劍麻斑馬紋病菌EST—SSR標(biāo)記開發(fā)與評價

吳偉懷　汪涵　汪全偉　習(xí)金根　鄭金龍　梁艷瓊　李銳　黃興　楊蕊馨　賀春萍　易克賢

摘 要 劍麻斑馬紋病是劍麻生產(chǎn)中具有破壞性的一種真菌病害。本研究從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）中隨機(jī)下載10 525條寄生疫霉EST序列，經(jīng)過去冗余處理后得到5 519條無冗余EST。利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件進(jìn)行SSR發(fā)掘，從中共搜索到199個1～6堿基SSR，其中三核苷酸重復(fù)基元類型最多，共鑒定到55個，占SSR總數(shù)的27.6%；其次是二核苷酸重復(fù)基元類型和單核苷酸重復(fù)基元類型，分別鑒定到51和47個，各占所鑒定SSR總數(shù)的25.6%和23.6%。進(jìn)一步分析表明，AG/CT二核苷酸重復(fù)基元類型為優(yōu)勢重復(fù)類型，占二核苷酸SSR總數(shù)的76.5%。而AAG/CTT和AGC/CTG 2個基元類型在三核苷酸中出現(xiàn)頻率最多，分別為15和11次，分別占三核苷酸SSR總數(shù)的27.3%及20.0%。從鑒定的199個SSR中，選取含有SSR的合適區(qū)段設(shè)計(jì)了22對引物，并通過18個劍麻斑馬紋病菌菌株的基因組DNA進(jìn)行了評價，結(jié)果只有其中9對引物能從劍麻斑馬紋病菌基因組DNA中有效擴(kuò)增，其擴(kuò)增移效率為40.9%。由此表明，利用此方法來開發(fā)劍麻斑馬紋病菌的分子標(biāo)記具有可行性，只是存在一個轉(zhuǎn)移效率問題。

關(guān)鍵詞 劍麻斑馬紋病菌；表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）；SSR；分子標(biāo)記

中圖分類號 Q78；S563.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Zebra spot disease caused by Phytophora nicotianae var. parasitica（or Phytophora parasitica var. nicotianae）is the most serious and devastating fungi disease in sisal. In the present study， a total of 5 519 non-redundant P. nicotianae were generated from the 10 525 publicly available EST sequences by CAP3 software， which used to mine potential microsatellites by microsatellite identification tool（MISA）. A total of 199 SRR was found in P. nicotianae expressed-squence tags data. Of the 199 SSR， the most abundant SSR was the tri-nucleotide type， with the SSR numbers being 55， accounting for 27.6%， followed by the di-nucleotide and mono-nucleotide type， with the SSR numbers being 51 and 47， accounting for 25.6% and 23.6%. Among the di -nucleotide repeats， AG/CT was the most motifs and accounted for 76.5%. The AAG/CTT and AGC/CTG was the most motifs in tri-nucleotide， being 15 and 11， accounting for 27.3% and 20.0%， respectively. Further screening to the number of repetitions and motifs relatively large number of SSR among the 199 SRR， which the right position to develop molecular markers， and a total of 22 primers were developed.Among the 22 primer pairs designed and synthesized， there were only 9 primer pairs that amplified characteristic SSR bands in genomic DNA of 18 tested isolates of P. nicotiana from sisal， thus the transferability was 40.9%. The results showed that it is feasible for molecular markers using this method to develop the sisal zebra germs， only a transfer rate of problems.

Key words Phytophora nicotianae var. parasitica / Phytophora parasitica var. nicotianae； expressed sequence tag （EST）； simple sequence repeat（SSR）； molecular marker

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.018

近年來，隨著分子生物學(xué)與生物技術(shù)的飛速發(fā)展，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已成為研究植物病原真菌遺傳變異與檢測的重要手段。傳統(tǒng)基因組來源的SSR（Simple Sequence Repeat，簡單重復(fù)序列）引物的開發(fā)需要構(gòu)建基因組文庫、探針雜交和克隆測序等復(fù)雜的操作程序。此方法不僅費(fèi)時、費(fèi)力，而且開發(fā)成本較高[1]。隨著表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）技術(shù)的迅速發(fā)展，EST數(shù)據(jù)庫為開發(fā)SSR標(biāo)記提供了快速與廉價的途徑[2]。與此同時，由于EST的SSR標(biāo)記開發(fā)是基于基因的轉(zhuǎn)錄部分，反映了基因的編碼部分，可直接體現(xiàn)基因表達(dá)信息，從而與功能基因緊密連鎖，使得其在近緣物種間具有很高的通用性[3]。正因如此，使得EST-SSR標(biāo)記已成為當(dāng)今被廣泛利用的分子標(biāo)記技術(shù)之一。目前，該標(biāo)記已廣泛應(yīng)用到包括卵菌在內(nèi)的植物病原菌的群體遺傳變異、多樣性和進(jìn)化、基因定位等研究中[4-7]。

劍麻斑馬紋病是一種嚴(yán)重危害劍麻的主要病害[8]。其病原菌為煙草疫霉（Phytophora nicotianae var. parasitica或表示為Phytophora parasitica var. nicotianae）。中國自1970年首次在廣東省東方紅農(nóng)場出現(xiàn)此病后，各植麻區(qū)都先后不同程度地發(fā)生過此病[8，11]。中國劍麻生產(chǎn)以收獲葉纖維為主，其主栽品種‘H.11648栽種歷史已有50 a，其種植面積達(dá)到總種植面積98%以上[12]。由于長期大面積單一種植，導(dǎo)致其抗性明顯下降，病蟲害不斷發(fā)生[9]。針對劍麻斑馬紋病菌，印度研究者對印度劍麻麻園的斑馬紋病病原菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)致病菌為煙草疫霉的變種（Phytophthora nicotianae Breda var. parasitica）[13]。趙艷龍等[14]對煙草疫霉菌游動孢子接種劍麻方法進(jìn)行了研究，結(jié)果表明刺傷-棉花保濕法接種劍麻葉片，操作簡單方便，接種成功率高，是利用游動孢子接種劍麻斑馬紋病的最好方法。劉巧蓮[15]則采用菌絲生長速率法對13種藥劑的抑菌效果進(jìn)行室內(nèi)篩選 55%敵克松、70%甲基托布津和68%精甲霜·錳鋅的EC50和EC95最小，抑菌效果最好。國內(nèi)外對劍麻斑馬紋病菌研究主要集中在病原菌鑒定、生物學(xué)特性以及致病性與防治藥劑等方面，而未見關(guān)于劍麻斑馬紋病菌EST-SSR分子標(biāo)記方面的報(bào)道。為此，本研究擬從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）隨機(jī)下載寄生疫霉EST序列，經(jīng)過去冗余處理后，利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件進(jìn)行SSR的查找和分析。在此基礎(chǔ)上，于SSR的側(cè)翼區(qū)域合適位置設(shè)計(jì)引物，并通過劍麻斑馬紋病菌基因組DNA進(jìn)行引物真實(shí)性驗(yàn)證，最終開發(fā)適用用于斑馬紋病菌的EST-SSR標(biāo)記。為后續(xù)病原菌遺傳變異及其監(jiān)測提供分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）下載10 525條寄生疫霉EST序列（截至2014年9月2日）。用Blast軟件進(jìn)行比對，相似度大于80%的就去掉其中一條。EST拼接后從而獲得Unigene；然后，利用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件對對聚類后的無冗余EST序列進(jìn)行SSR搜索。篩索標(biāo)準(zhǔn)是：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸最少重復(fù)次分別為20、6、5、4、3和3次。

1.2 方法

1.2.1 劍麻斑馬紋病菌菌株及DNA提取 用于本研究的18個劍麻斑馬紋病菌分離物采自不同地方與年份，其具體信息詳見表1。供試各菌株菌絲體收集與基因組DNA提取參照吳偉懷等的方法[16]。

1.2.2 SSR位點(diǎn)引物設(shè)計(jì) 利用Primer Premier 5.0軟件（http：//redb.ncpgr.cn/modules/redbtools/primer5.php）于SSR的側(cè)翼區(qū)域合適位置設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)引物時嚴(yán)格按照如下條件進(jìn)行：復(fù)性溫度（Tm）55～60 ℃且上下游引物復(fù)性溫度相差小于3 ℃；預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小50～300 bp；引物長度17～23 bp，且不形成二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。設(shè)計(jì)好的引物最終交由Invitrogen公司采用普通脫鹽方式合成。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括14.2 ddH2O，1 μL DNA模板（約50 ng/μL），2 μL 10×EasyTaq Buffer，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.2 μL EasyTaq DNA poly。PCR反應(yīng)在 Mastercycler gradient Mastercycler PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；隨后94 ℃變性30 s，55 ℃～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，15 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠于北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-Ⅱ型垂直板電泳儀及DYC-30型電泳槽中電泳分離（電泳緩沖液1×TBE，電壓90 V，時間2 h）。電泳完畢后，銀染顯色，BIORAD凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.2.4 引物的有效性評價 所設(shè)計(jì)的引物其有效性通過來自于中國不同劍麻栽培區(qū)18個劍麻斑馬病菌株進(jìn)行評價。供試引物只要在18個劍麻斑馬紋病菌株中的任一個擴(kuò)增出有效條帶即為有效引物，而在18個菌株中擴(kuò)增出不同DNA大小片段的則記為多態(tài)性標(biāo)記。反之，不能在18個劍麻斑馬紋病菌菌株中擴(kuò)增出任何條帶則為無效引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 寄生疫霉菌EST序列中SSR出現(xiàn)頻率與特點(diǎn)

對從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest）下載10 525條寄生疫霉EST序列，經(jīng)過去冗余處理后獲得5 519條無冗余EST，總長度為4.05×106 bp。從中共搜索到199個SSR，分布在186條無冗余的EST上，其發(fā)生頻率為10.6%（含有SSR的EST與無冗余的EST數(shù)之比），SSR平均分布距離為20.4 kb（表2）。其中有13條EST序列中包含1個以上SSR（表2）。在被鑒定到的199個SSR中，單核苷酸、二、三、四、五，以及六核苷酸基元類型SSR分別有47、51、55、5、10和31個，其出現(xiàn)頻率依次為23.6%、25.6%、27.6%、2.5%、5.0%以及15.6%（圖1）。而在EST-SSR重復(fù)次數(shù)數(shù)量方面，出現(xiàn)頻率較高的則是重復(fù)數(shù)為6、4和7，出現(xiàn)次數(shù)分別為40、37、30次（表3）。

2.2 二核苷酸基元組成及其頻率

在199個SSR中，其中二，三核苷酸基元類型分布最為普遍，為此對二者核苷酸基元類型及頻率做更進(jìn)一步分析。分析結(jié)果表明，在51個二核苷酸基元類型SSR中，共存在AC/GT、AG/CT以及AT/AT等3種核苷酸基元類型，其數(shù)量依次為5、39及7個，分別占二核苷酸基元類型SSR總數(shù)的9.8%、76.5%以及3.7%。由此可見，AG/CT基元為二核苷酸基元類型SSR中最為豐富基元類型（圖2）。

2.3 三核苷酸基元組成及其頻率

在55個三核苷酸SSR中共存在10種不同基元類型。具體而言，AAG/CTT和AGC/CTG 2個基元出現(xiàn)次數(shù)最多，分別為15和11次，占三核苷酸SSR總數(shù)的27.3%及20.0%。其次為AGG/CCT、ACC/GGT、ACG/CGT和AAT/ATT等4種基元類型出現(xiàn)的次數(shù)分別為9、6、5和3，占三核苷酸SSR總數(shù)的16.4%、10.9%、9.1%和5.5%。相比之下，ACT/AGT、CCG/CGG、AAC/GTT與ATC/ATG等4種基元類型出現(xiàn)次數(shù)最低，分別為2、2、1、1次（圖3）。

2.4 分子標(biāo)記開發(fā)及有效性驗(yàn)證

由于多態(tài)性是判斷分子標(biāo)記可用性的一個重要依據(jù)。為此，對所獲得的EST-SSR進(jìn)一步分析，并從中選取了22個位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)出22對引物（表4）。利用所設(shè)計(jì)的引物分別對來自不同地區(qū)的18個劍麻斑馬紋病菌進(jìn)行了擴(kuò)增評價。結(jié)果表明，只有9對引物從劍麻斑馬紋病菌DNA中擴(kuò)增出條帶，占所開發(fā)總引物數(shù)的40.9%。具體而言，PP2F/R、PP7F/R、PP8F/R、PP11F/R、PP15F/R、PP16F/R、PP17F/R、PP19F/R、PP20F/R等9對引物能擴(kuò)增出有效條帶（表4）。其中PP11F/R、PP16F/R、PP20F/R分子標(biāo)記顯示出多態(tài)性，而PP20F/R多態(tài)性最為豐富（圖4）。總而言之，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的寄生疫霉菌EST數(shù)據(jù)來開發(fā)劍麻斑馬紋病菌SSR標(biāo)記具有可行性，不過值得注意的是，存在一個轉(zhuǎn)移效率問題。

3 討論

斑馬紋病是劍麻最為嚴(yán)重的一種真菌病害。了解和監(jiān)測劍麻斑馬紋病原菌的群體動態(tài)變化對于病害的防控具有重要意義。傳統(tǒng)上病害監(jiān)測采用鑒別寄主法，但是該方法比較耗時費(fèi)力。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，產(chǎn)生了多種分子標(biāo)記技術(shù)，從而可以從分子水平上監(jiān)測病原菌的變化。在這些分子標(biāo)記技術(shù)中，其中SSR標(biāo)記由于其具有分布廣、側(cè)翼序列相對保守、多態(tài)性豐富，標(biāo)記多呈共現(xiàn)性，以及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)而廣受歡迎。SSR標(biāo)記開發(fā)綜合起來有如下3個途徑，一是基于基因組序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)發(fā)掘；二是利用同源或相關(guān)物種SSR信息而開發(fā)，通過驗(yàn)證其真實(shí)性，從而到達(dá)開發(fā)SSR的目的；最后則是基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行SSR標(biāo)記開發(fā)。本研究中，通過從NCBI中下載的10 525條寄生疫霉EST，經(jīng)同源性比對分析后獲得的5 519條無冗余的Unigene，最后利用MISA軟件進(jìn)行SSR發(fā)掘。結(jié)果篩選到1～6堿基SSR199個，分布在186條無冗余的EST上，出現(xiàn)頻率為10.6%。其中出現(xiàn)頻率由高到低依次為三核苷酸重復(fù)基元類型、二核苷酸重復(fù)基元類型、單核苷酸重復(fù)基元類型以及六堿核苷酸重復(fù)基元類型。這與已報(bào)道的構(gòu)巢曲霉菌（Aspergillus niculans）排前三的SSR基元類型（依次為五核苷酸基元類型、六核苷酸、核苷酸類型）具有明顯差異[17]。在鑒定的楊樹銹菌（Melampsora larici-populina）EST-SSR中，三核苷酸重復(fù)基元的數(shù)量最多，占全部SSR 的44.70%，為優(yōu)勢重復(fù)基序；其次為五核苷酸、四核苷酸、二核苷酸、所含微衛(wèi)星所占比例分別20.53%、17.72%、17.05%[18]。由此揭示，不同病原菌菌體中SSR類型存在明顯差異。更進(jìn)一步比較表明，SSR優(yōu)勢重復(fù)基元類型也因病原菌的不同而存在著明顯差異。在本研究中，二核苷酸重復(fù)基元類型中，存在AC/GT、AG/CT與AT/AT等3種類型，其中AG/CT為優(yōu)勢類型。而三核苷酸重復(fù)基元類型中共存在10種不同基序，其中AAG/CTT、AGC/CTG與AGG/CCT為優(yōu)勢類型。與之相比，尖鐮孢（Fusarium oxysporum）EST-SSR以二核苷酸重復(fù)基元類型為主，占總SSR的59.78%。二核苷酸重復(fù)基元又以AC/GT（0.51%）為主[19]。

利用同源或相關(guān)物種SRR信息而開發(fā)標(biāo)記，其轉(zhuǎn)移效率是評價引物開發(fā)成功的重要指標(biāo)。為此，在本研究中利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的煙草疫霉菌EST數(shù)據(jù)所合成的22對引物對18個劍麻斑馬紋病菌DNA進(jìn)行了真實(shí)性評價。結(jié)果表明，僅9對引物能擴(kuò)增出條帶，占總標(biāo)記的40.9%。這表明其轉(zhuǎn)移效率為40.9%。相比之下，Zhu等[20]利用大豆疫霉EST序列數(shù)據(jù)，從中設(shè)計(jì)了40對SSR引物，結(jié)果有33對（82.5%）擴(kuò)增出SSR特征條帶；隨后，藺宇等[4]設(shè)計(jì)140對EST-SSR引物，并通過用10個大豆疫霉分離物進(jìn)行PCR 檢測，最終共有111引物（79.3%）擴(kuò)增出SSR 特征條帶。而徐靜靜等則從1 234個含有2～4個堿基重復(fù)單元的完全SSR中選出260段設(shè)計(jì)引物，經(jīng)10個大豆疫霉分離物基因組DNA檢測，有213對（81.9%）擴(kuò)增出SSR特征條帶，其中114（53.5%）對引物擴(kuò)增出多態(tài)性[5]。由此表明，通過不同EST數(shù)據(jù)來開發(fā)病原菌的分子標(biāo)記，其效率具有明顯差異。就本研究而言，雖然所利用數(shù)據(jù)為寄生疫霉菌與引起劍麻斑馬紋病病原菌煙草疫霉（Phytophora nicotianae var. parasitica 或表示為Phytophora parasitica var. nicotianae）十分近源，但值得注意的是，即使是同一病原菌在與不同寄主共同進(jìn)化過程中也可能產(chǎn)生變異[21]。另外，由于受內(nèi)含子有無差異的影響，一些cDNA序列與相應(yīng)基因組區(qū)域存在著一定差異，從而容易導(dǎo)致所發(fā)掘的EST-SSR位點(diǎn)序列不存在于基因組DNA上，繼而導(dǎo)致所開發(fā)的引物不能進(jìn)行有效PCR擴(kuò)增[22]。因此，EST-SSR位點(diǎn)的真實(shí)性是需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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