番木瓜籽蛋白提取工藝及其性質(zhì)研究

馬若影　李幼梅　白新鵬　武林賀　張宇翔　王錫蘭

摘 要 為開發(fā)利用番木瓜籽中的蛋白質(zhì)，以番木瓜籽蛋白提取率為指標(biāo)，通過單因素實驗比較超聲輔助提?。║AE）與超聲-微波協(xié)同輔助提?。║MAE）對番木瓜籽蛋白提取的影響，并確定輔助提取方法及條件，后采用Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝，并對番木瓜籽蛋白等電點、溶解性、起泡性、乳化性、持水性等性質(zhì)進行研究。結(jié)果顯示：UMAE較UAE提取番木瓜籽蛋白具有更快速、高效、節(jié)能的特點；響應(yīng)面優(yōu)化UMAE提取工藝條件為料液比1 ∶ 90，提取2 min，功率50 W，提取率約為52.31%，與理論值無顯著差異；番木瓜籽蛋白的等電點pI4.56，pH4.5時起泡性最好，乳化性、溶解度最低；該蛋白持水能力較低，為（1.58±0.3）g/g。

關(guān)鍵字 番木瓜籽蛋白；提?。豁憫?yīng)面；性質(zhì)

中圖分類號 S667.9 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract The effect of solid-liquid ratio， extraction time and power of machine on the yield of protein in papaya seed was studied. The extraction method and conditions of papaya seed protein were confirmed by the single factor experiments of UAE and UMAE and the optimal process was determined by the Box-Behnken design. The properties of papaya seed protein such as isoelectric point（pI）， solubility， foamability， emulsibility and water binding capacity were explored. Results indicated that UMAE was superior to UAE of papaya seed protein which was extracted rapidly and efficiently relatively. The optimal extract process was that solid-liquid ratio was 1 ∶ 90， extracted for 2 min， power was 50 W of the machine. Under this condition， the extract yield of papaya seed protein was about 52.31%. The pI of the extracted protein in papaya seed was 4.56. At pH4.5，the foaming ability was the highest which was opposite to the ability of emulsification and solubility. The protein extracted from papaya seed was short of water-holding which was（1.58±0.3）g/g.

Key words Papaya seed protein； extraction； response surface； properties

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.022

番木瓜（Carica Papaya L.）屬十字花目番木瓜科[1]，據(jù)FAO統(tǒng)計[2]，全球番木瓜年產(chǎn)量超1 000萬t。番木瓜籽呈卵球形，無外殼，外層由半透明的果膠包裹，內(nèi)籽表明凹凸不平，呈黑棕色，約占番木瓜質(zhì)量的7%，是番木瓜加工后的下腳料。目前，有關(guān)番木瓜籽的研究，主要集中在番木瓜籽油提取[5]、脂肪酸鑒定及活性成分提取等[3-4]方面，鮮見其蛋白質(zhì)相關(guān)方面的研究報道，鄧楚津[6]通過分析番木瓜籽的基本營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)番木瓜籽粗蛋白約為24.91%，其必需氨基酸種類齊全，且賴氨酸、絡(luò)氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸含量豐富，可與谷物搭配起蛋白質(zhì)互補作用。

查閱國內(nèi)外文獻，有關(guān)番木瓜籽蛋白的提取工藝、性質(zhì)等方面研究甚少。據(jù)此，本試驗比較超聲輔助和超聲微波提取番木瓜籽蛋白，并采用響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，對番木瓜籽蛋白的等電點、溶解性、起泡性、乳化性、持水性等性質(zhì)進行研究，旨在為進一步綜合利用番木瓜籽蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器與設(shè)備見表1。

番木瓜籽及前處理：產(chǎn)自海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物園，屬番木瓜屬番木瓜種紅肉番木瓜，編號HNsp5018。用自來水沖洗番木瓜籽，去除雜物，洗至干凈，晾干，置于凍干機中-80 ℃，5 MPa冷凍干燥，粉碎機粉碎，過80目篩，取篩下物用石油醚1 ∶ 30（w ∶ v）反復(fù)脫脂至脂類成分脫除干凈，干燥，即為試驗原料。

試劑：牛血清蛋白標(biāo)品、考馬斯亮藍G-250、95%乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）等，購自廣州市化學(xué)試劑廠，均為AR。

1.2 試驗方法

1.2.1 番木瓜籽蛋白質(zhì)提取 蛋白質(zhì)提取率計算：原料粗蛋白采用凱氏定氮法[7]測定，參照國標(biāo)GB 5009.5-2010[8]《食品中蛋白質(zhì)的測定》，考馬斯亮藍法[9]測定番木瓜籽提取液中蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)提取率公式按下式計算：

番木瓜籽蛋白提取率Y/%=提取液中蛋白質(zhì)含量/原料蛋白質(zhì)含量×100

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mL濃度為100 μg/mL的蛋白質(zhì)溶液，采用蒸餾水補足至1 mL，加入2.0 mg/mL考馬斯亮藍G-250，混勻反應(yīng)2 min后在620 nm進行測定，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)、吸光度Abs為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.007 1x+0.079 8，R2=0.998 3。

提取工藝流程：取番木瓜籽粉，加磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH8.0），用輔助手段提取后離心分離，先上清液等電點沉淀，再水洗沉淀，最后冷凍干燥即成番木瓜籽蛋白。

提取工藝優(yōu)化：試驗分2個階段進行，先通過單因素試驗從料液比、時間、功率比較UAE和UMAE對番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響，確定輔助方法，采用Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理對提取率高的方法進行試優(yōu)化試驗，整個實驗過程控制提取液的溫度在55 ℃以下。

1.2.2 番木瓜籽蛋白質(zhì)性質(zhì)研究 等電點：參考劉永創(chuàng)[10]等的方法，采用HAc-NaAc緩沖體系調(diào)節(jié)浸提液的pH3.0至7.0，8 000 r/min離心15 min，取上清液進行考馬斯亮藍染色，在620 nm處測吸光值。根據(jù)吸光值大小判定蛋白質(zhì)等電點，等電點處蛋白質(zhì)沉淀量最大，上清液蛋白含量最低，染色后吸光值最小。

溶解性：采用氮溶解指數(shù)（NSI）[11]評價番木瓜籽蛋白質(zhì)溶解性[12]。用去離子水配制1%（W/V）番木瓜籽蛋白樣品溶液20 mL，用0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，磁力攪拌2 h，8 000 r/min離心15 min，采用微量凱氏定氮法測定上清液中的氮含量。重復(fù)3次，取平均值。

氮溶解指數(shù)NSI/%=上清液的氮含量/樣品氮含量×100

起泡性：參考椰子分離蛋白起泡性[13]的測定方法并進行改進，取25 mL 1%的樣品溶液，用0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.0、5.5、7.0，室溫條件下，用高速均漿機均質(zhì)1 min，快速將樣品轉(zhuǎn)移到25 mL量筒中，測定樣品總體積（V2），30 min后再次測量1次泡沫體積（V1）。重復(fù)3次，取平均值。

起泡性=（V2-V1）/V0，其中，V0為起始體積，V0=25 mL

乳化性：參考β-伴大豆球蛋乳化性[14]的測定方法并進行改進，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）配制1%蛋白樣品，用0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至3.0、4.5、6.0、7.5，取1 mL色拉油與3 mL待測溶液于均質(zhì)機中均質(zhì)5 min，吸取攪打后的溶液，用0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS）稀釋2 000倍，混勻后在500 nm處測定吸光值，以SDS溶液作為空白。重復(fù)3次，取平均值。

乳化活性指數(shù)（EAI）=（2.303×2×A500×稀釋倍數(shù)）/（C×Φ×L）

式中：EAl為每克蛋白質(zhì)的乳化面積，m2/g；Φ為油相所占的分?jǐn)?shù)，在本實驗中油相占1/4；C為蛋白質(zhì)的濃度，1%；L為比色池光徑，10 mm。

持水性：參照花生蛋白持水性[15]的測定方法并進行改進，取1.0 g樣品置于20 mL離心管中，加入10 mL去離子水，室溫下靜置2 h后離心（5 000 r/min，20 min），將上清液倒去，并將離心管倒置在濾紙上，10 min后稱量。持水力以每克樣品吸附水的質(zhì)量數(shù)表示。重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲、超聲-微波輔助提取單因素實驗

2.1.1 料液比對番木瓜籽蛋白提取率影響 將料液比作為變量，在其他條件相同下探討UAE和UMAE這2種提取方法對番木瓜籽蛋白提取率的影響。由圖1可知，隨著料液比的增大，UAE和UMAE的提取率有明顯的提高，后趨于平穩(wěn)。當(dāng)加入溶劑的量過少時，番木瓜籽粉末顆粒本身會吸收一定量的水分，導(dǎo)致作為輔助提取的介質(zhì)液體減少，使得超聲波及超聲-微波在液相中的吸收大于在固相中的吸收。隨著溶劑量的增加，加快了整個傳質(zhì)過程，提取率明顯提高。在UAE中，當(dāng)料液比大于1 ∶ 70時，提取率增加的幅度不大，趨于穩(wěn)定；UMAE中料液比大于1 ∶ 90出現(xiàn)提取率飽和現(xiàn)象。從圖1還可看出，UMAE番木瓜籽蛋白提取率明顯優(yōu)于UAE，料液比1 ∶ 90時，UMAE番木瓜籽蛋白提取率為45.65%，而UAE僅為25.33%，是UAE的1.8倍。UMAE較UAE具有微波作用，說明UMAE中的微波作用有助于番木瓜籽蛋白的溶出。

2.1.2 功率對番木瓜籽蛋白提取率影響 UAE與UMAE中功率對番木瓜籽蛋白提取率影響如圖2所示，提取率由10 W時的22.43%、41.62%提高至50 W時的30.94%、47.7%。當(dāng)功率大于50 W后，番木瓜籽蛋白UAE的提取率約為31.45%，UMAE約為48.24%，功率提高，提取率增大不明顯。

2.1.3 時間對番木瓜籽蛋白提取率影響 UAE和UMAE方法中，時間對番木瓜籽蛋白提取率影響如圖3所示，隨處理時間的延長，蛋白質(zhì)提取率隨之增大，隨后趨于穩(wěn)定。UAE中反應(yīng)10 min的番木瓜籽蛋白提取率為23.82%，UMAE中反應(yīng)1 min的提取率為38.54%，是UAE的1.62倍。當(dāng)UAE提取時間到達110 min后，番木瓜籽蛋白的提取率趨于飽和，約為38%；而UMAE反應(yīng)2 min后，提取率保持在48%左右，是UAE提取時間達到110 min時的1.26倍。番木瓜籽蛋白在UAME中提取1 min的提取率與在UAE中提取110 min相當(dāng)，由此可見，UAME較UAE在番木瓜籽蛋白提取中具有快速完成提取的特點。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

綜合1階段從液料比、提取時間、提取功率比較UAE和UMAE對番木瓜籽蛋白提取率影響，選取蛋白質(zhì)提取率高的UMAE采用Box-Behnken試驗進行工藝優(yōu)化，結(jié)果如表2所示。

采用Design-Expert V8.0.6進行多元回歸擬合，得到回歸模型方程：

Y=48.87+3.36A+1.80B+0.64C+0.037AB+1.32AC-0.88BC-3.68A2-3.93B2+1.66C2

回歸方程方差分析結(jié)果見表3，模型的F值為187.70，P值（P=0.003 0）小于0.01，表明模型較顯著，在各因素交互作用中，A和B交互影響不顯著，A和C交互影響極顯著，B和C交互影響顯著，說明各自兩因素之間不是簡單的線性關(guān)系，還存在二次關(guān)系。模型誤差失擬P值（P=0.139 9）大于0.05，不顯著，表明此方程對試驗擬合度較好，具有一定的可靠性，模型預(yù)測值與實際值誤差較小，可應(yīng)用此回歸模型對番木瓜籽蛋白提取效果進行分析及預(yù)測。

采用各因素的F值可評價此因素對試驗指標(biāo)的影響，F(xiàn)值越大，表明因素的影響越顯著。由表3可知，F(xiàn)（A）=574.72，F(xiàn)（B）=165.20，F(xiàn)（C）=21.00，即各因素對番木瓜籽蛋白提取率影響為料液比>提取時間>功率。

由圖4可看出，隨因素A和B的取值不斷增大，響應(yīng)值的值先增大后減小，在A和B的中心點附近出現(xiàn)最大值。在料液比和提取時間交互作用等高線中，等高線沿A軸（料液比軸）的變化趨勢明顯高于B軸（提取時間軸），說明料液比對番木瓜籽蛋白提取的影響大于提取時間。

由圖5、6可知，在C的作用下，隨因素A、B值的增大，響應(yīng)值不斷增大，在中心點過后小幅度下降，波動不大，曲面呈馬鞍狀，且功率的響應(yīng)面曲線坡度明顯小于提取時間、料液比的響應(yīng)面曲線坡度，此外，圖5、6的等高線橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)的趨勢相比，可看出提取時間、料液比坐標(biāo)較為陡峭，說明提取時間、料液比對番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率影響均大于功率對其的影響。

綜上，各因素對番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響主次順序是料液比>提取時間>功率。

2.3 番木瓜籽蛋白性質(zhì)結(jié)果

2.3.1 等電點 等電點的實驗結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，在pH4.56，620 nm處吸光值較小，故番木瓜籽蛋白的等電點pI=4.56。

2.3.2 溶解性 番木瓜籽蛋白在不同pH條件下的溶解度如圖8所示，番木瓜籽蛋白質(zhì)溶解性較差，這可能是因為其中的清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白等類型的蛋白含量及所占比例不同。番木瓜籽蛋白在pH4～5之間溶解度最小，據(jù)此可推番木瓜籽蛋白的等電點在4～5之間，此結(jié)果與等電點的測定結(jié)果相符。

2.3.3 起泡性 蛋白質(zhì)的起泡能力多取決于其可溶部分，不溶性部分的蛋白質(zhì)粒子因具有提高表面粘度的作用，也能在穩(wěn)定泡沫的過程中發(fā)揮作用。此外，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小分子多肽能增加起泡性；而不發(fā)生水解的蛋白質(zhì)以及水解產(chǎn)生的大分子多肽則有抑制起泡的作用。不同濃度的番木瓜籽蛋白在不同pH下的起泡性如圖9所示。

由圖9可以看出，各濃度的蛋白質(zhì)在pH4.5時的起泡性均最高，這是等電點附近產(chǎn)生較多的不溶解蛋白質(zhì)粒子；在同pH下，隨番木瓜籽蛋白濃度的增加，起泡性隨之增加；相同濃度，不同pH下的起泡性有顯著性差異，這是在不同的酸堿環(huán)境下，蛋白質(zhì)水解程度以及水解產(chǎn)物不同。

2.3.4 乳化性 由圖10可以看出，番木瓜籽蛋白乳化性在不同pH條件下差異較大，在等電點附近（pH4.5左右）的乳化性最低，pH增加，其乳化能力有所提高，這是因為隨pH變化，蛋白質(zhì)的溶解性發(fā)生變化，尤其在堿性條件下的溶解度增加，乳化能力增強。

2.3.5 持水性 番木瓜籽蛋白質(zhì)的持水力測定結(jié)果表明，其持水能力較低，為（1.58±0.3）g/g，與椰子種皮蛋白質(zhì)（1.50 g/g）[16]相當(dāng)，但遠(yuǎn)低于其它作物種子[17]蛋白質(zhì)的持水力，如紫蘇籽[18]、南瓜籽[19]和大豆分離蛋白[20]的持水力分別為2.72、3.52、3.10 g/g。這可能是因為脫脂番木瓜籽蛋白質(zhì)的溶解性相對較低，不利于蛋白質(zhì)向氣-水和油-水界面擴散，從而降低了其表面活性。

3 討論

隨著社會不斷發(fā)展，蛋白資源日益緊缺，加強對植物蛋白資源的開發(fā)和利用具有重大的意義。鄧楚津[6]等人對番木瓜籽進行成分分析，表明番木瓜籽蛋白中必需氨基酸種類齊全，且賴氨酸含量豐富，與谷物搭配可起蛋白質(zhì)互補作用。查閱國內(nèi)外文獻資料，未見有關(guān)于番木瓜籽蛋白提取和利用的研究報道，本文通過單因素比較UAE與UAME對番木瓜籽蛋白提取，發(fā)現(xiàn)UMAE較UAE具有高效、快速的特點。石瑋婷[21]采用微波輔助提取紫蘇籽蛋白，在最佳工藝條件下提取率為25.85%。趙見軍[22]等采用超聲波輔助提取核桃粕蛋白，提取率達69.62%。使用微波輔助提取，所需時間一般較短，在數(shù)分鐘可完成反應(yīng)，達到提取的目的，這是因為微波輻射過程是高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)到達物料內(nèi)部的微管束和腺胞系統(tǒng)的過程，物料吸收了微波能，細(xì)胞內(nèi)部的溫度迅速上升，使得細(xì)胞內(nèi)部壓力過大導(dǎo)致細(xì)胞破裂，番木瓜籽蛋白自由流出。此外，微波產(chǎn)生的電磁場可加速番木瓜籽蛋白由物料內(nèi)部向固液界面擴散的速率，從而縮短番木瓜籽蛋白由物料內(nèi)部擴散至固液界面的時間，使萃取速率提高。

蛋白質(zhì)性質(zhì)測定結(jié)果表明，番木瓜籽蛋白的等電點pI4.56，pH4.5（即等電點附近）時起泡性最好，乳化性、溶解度最低，持水能力較低，為（1.58±0.3）g/g，與大豆分離蛋白的持水力相差較遠(yuǎn)。對番木瓜籽蛋白進行初步性質(zhì)研究，可為番木瓜籽蛋白的加工及資源化利用提供依據(jù)。如將番木瓜籽蛋白作為食品添加劑添加至玉米等谷物制品中，不僅可填補谷物中缺少賴氨酸、絡(luò)氨酸等必需氨基酸空白，還可提高食品的營養(yǎng)價值，并且具有改善其結(jié)構(gòu)性能，利于人體吸收，同時可降低生產(chǎn)成本。試驗表明，番木瓜籽蛋白具有一定的功能特性，但與大豆蛋白仍有一定差異，因此有必要加強對番木瓜籽蛋白研究，尤其是對其蛋白質(zhì)類型分析，以期探索出適合番木瓜籽蛋白的加工技術(shù)路線，早日實現(xiàn)高值化利用。

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