茚三酮溶液檢驗氨基酸實驗的實證與優(yōu)化

劉海生+孟海蓮

摘要：針對茚三酮檢驗氨基酸實驗的教學困惑，在查閱相關文獻、調查氨基酸市場售價的基礎上，通過實驗探究了pH、溫度及試劑相對用量等因素對顯色效果的影響，認為教材上的實驗方案在氨基酸選擇、試劑相對用量、水浴溫度控制等方面存在不足，進而提出了改進建議。新方案以甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸為對象，控制茚三酮與氨基酸相對用量比5：1及水浴溫度70℃，具有實驗現(xiàn)象明顯、試劑成本低、操作性強、內容銜接順暢等優(yōu)點。

關鍵詞：水合茚三酮；顯色反應；氨基酸檢驗；等電點；實驗探究

文章編號：1005–6629（2017）4–0067–04 中圖分類號：G633.8 文獻標識碼：B

1 困惑

茚三酮與氨基酸的反應在藥品檢驗、臨床分析和食品工業(yè)等領域被廣泛應用。在高中有機化學內容的教學時，若能適時開展氨基酸檢驗的實驗探究活動，對幫助學生認識氨基酸的化學性質及檢驗方法是大有裨益的。本地區(qū)所用的人教版教材有機部分未編排該實驗內容，翻閱其他版本的教材，唯獨蘇教版提供了操作步驟：取1mL 0.1%的茚三酮溶液，加入1%的甘氨酸溶液，將試管放入熱水浴中，觀察現(xiàn)象。用色氨酸溶液替代甘氨酸溶液，重復上述實驗。

在仔細研讀以上方案后，發(fā)現(xiàn)存有諸多困惑，主要有以下幾點：

（1）方案中向1mL 0.1%的茚三酮溶液加入的1%甘氨酸或色氨酸溶液的用量未具體指明，是數(shù)滴（少量）、幾毫升，還是其他可能的用量？

（2）實驗時所用的熱水浴控制多少溫度合適？能否采用酒精燈直接加熱？

（3）同一課時“問題解決”欄目在幫助學生了解肽鍵形成時，選擇甘氨酸和丙氨酸為例探討，本方案又為什么選擇甘氨酸和色氨酸作為研究對象？

對此，我們專門做了一些實證探索，得出了一些結果，供各位同仁參考。

2 探索

在分析茚三酮顯色原理與20種L型氨基酸市場售價基礎上，我們重點實證探索了氨基酸種類、pH、溫度及試劑相對用量等因素對顯色效果的影響，進而優(yōu)化選擇了茚三酮檢驗氨基酸實驗的條件。

2.1 茚三酮反應的基本原理

茚三酮在溶液中會形成水合茚三酮，兩者的結構如圖1所示。

氨基酸中的氨基和羧基共同參與和茚三酮的反應。水合茚三酮引起氨基酸氧化脫氨、脫羧反應，形成的還原產物可以與氨基酸分解產生的氨結合，再與另一分子還原茚三酮縮合，互變異構成藍紫色化合物（該化合物最大吸收峰在570nm處）[1]。具體過程見圖2。

2.2 常見氨基酸的市場價格調查

迄今人類已發(fā)現(xiàn)的數(shù)百種氨基酸中，從蛋白質水解得到的最常見的有20種。為方便購買化學試劑及降低實驗開設成本的考慮，我們在阿里巴巴化工品銷售平臺上查閱相關商品的市場價格，以教材出現(xiàn)的20種L型氨基酸為例（甘氨酸不存在L型），2015年8月食品級試劑的平均售價見表1。

2.3 氨基酸與茚三酮顯色反應條件的探索

氨基酸和茚三酮在一定條件下會發(fā)生顯色反應，顯色情況受氨基酸種類、溶液pH、試劑相對用量、反應溫度等多種因素的共同影響。

（1）pH對氨基酸與茚三酮顯色反應的影響

實驗1 分別吸取pH為3～11的緩沖溶液2mL，再加入1mL 1%的茚三酮溶液和4滴1%的氨基酸溶液，混勻后在熱水浴下加熱10min，取出并觀察，記錄溶液顏色。實驗結果見表2。

結果表明，氨基酸與茚三酮的顯色反應對介質pH非常敏感，不同種類氨基酸與茚三酮溶液呈現(xiàn)的顏色在不同pH下均會有明顯的變化，大部分氨基酸顯色的最佳pH在5～7。因此，要使實驗出現(xiàn)的藍色現(xiàn)象明顯，從溶液酸堿性角度宜控制反應在弱酸性環(huán)境下進行。

（2）常見氨基酸的等電點及水溶液的pH

氨基酸的等電點（pI）是氨基酸的重要物理常數(shù)，常用于氨基酸的分離與純化。當溶液pH等于氨基酸的pI時，氨基酸分子呈電中性狀態(tài)，相互排斥力較小，易形成沉淀。常見氨基酸的等電點數(shù)據(jù)見表3。

等電點是氨基酸的特征常數(shù)和重要化學性質，而氨基酸水溶液的pH則還一定程度上受溶液濃度等的影響。雖然這是兩個內涵不同的概念，但也有學者通過研究證明，將氨基酸溶于純水后溶液的pH與該氨基酸的等電點數(shù)值上相差并不明顯[3]。因此，我們一般可將氨基酸的pI值近似認為與其水溶液的pH相等。選擇上述氨基酸中pI在5～7進行的實驗，無需調節(jié)溶液pH而直接用于顯色，可簡化操作步驟。

（3）氨基酸與茚三酮相對用量對顯色的影響

綜合氨基酸售價、pI及實驗效果等影響因素，確定較廉價（低于100元/kg）的6種氨基酸作為進一步研究的對象（下同），即甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸等。

實驗2 吸取1mL 1%的茚三酮溶液，加入一定量1%的氨基酸溶液（按茚三酮與氨基酸不同的相對用量比），再補加適量蒸餾水控制實驗組中混合液總體積為3mL，振蕩混勻后在70℃的熱水浴下加熱10min，取出后觀察溶液顏色并記錄。具體結果見表4。

據(jù)此可知，在其他條件一定時，茚三酮和氨基酸的相對用量比控制在5：1左右時顯色效果最佳。實驗過程中我們也發(fā)現(xiàn)，不同相對用量比下的顯色速度也存在一定差別，5：1的用量比也是最為快速的。

（4）溫度對氨基酸與茚三酮顯色的影響

實驗3 取4根試管，各吸取1mL 1%的茚三酮溶液，再分別滴入4滴1%的氨基酸溶液，振蕩混勻后在不同溫度的水浴中加熱，觀察并記錄相應溶液從無色變?yōu)樗{紫色所耗時間（注：基于教學開展要求，我們控制每組顯色實驗的計時最長為10min，若溶液仍未變藍則記錄溶液的顏色）。具體結果見表5。

由實驗3可知，氨基酸與茚三酮的反應在常溫下顯色較慢，一般加熱后能顯著加快顯色速度，但溫度過高、時間太長又會引起顏色的變化甚至變淺、褪色，應盡力避免。實驗時選擇70℃水浴（不超過10min）加熱顯色速度快、實驗效果理想，能很好地滿足教學的需要。

3 討論

3.1 對教材實驗困惑問題的認識

實驗2相對用量的探究已說明，氨基酸與茚三酮顯色時兩者相對用量比在5：1時效果較好。教材實驗方案中，取用茚三酮溶液體積較大但濃度偏低（0.1%），后續(xù)加入的氨基酸溶液的質量分數(shù)（1%）則相對較大。由此推知，要切合上述用量比，需要的氨基酸溶液的體積很小，必當為“滴加”操作。一般而言滴管取用1mL液體可分20滴，經計算需向1mL 0.1%的茚三酮溶液中加入1%的氨基酸溶液量不足半滴，顯然不宜操作。有研究[4]表明，茚三酮反應的靈敏度較高，溶液濃度在0.5%～1%時顯色效果最佳。因此，建議在實際操作時，可通過適當增大茚三酮溶液濃度的方法解決以上問題。

水浴溫度對茚三酮與氨基酸的反應進程有顯著影響。文獻指出，溫度過低會使茚三酮與氨基酸的反應速率變緩，反應不徹底，溫度過高則會破壞氨基酸的結構，增大茚三酮的揮發(fā)損耗，從而導致反應不顯色[5，6]。顯然，采用酒精燈直接加熱的方式不合適。本實驗應使用水浴加熱，但教材探究方案中并未對所用水浴溫度明確說明，最好能加以說明以便操作。可參考實驗3結論，70℃水?。ú怀^10min）加熱的效果對教學而言很理想。

從甘氨酸和色氨酸相近的溶液pH（5.9左右，均呈弱酸性）、良好的實驗效果、簡單與復雜氨基酸的代表性等角度，教材擇其為例幫助學生了解氨基酸的共性的做法無可厚非，但從實驗成本角度，色氨酸價格偏貴，卻又未必是最佳的唯一選擇，綜合而言還是苯丙氨酸更具優(yōu)勢。此外，兼顧到后續(xù)同課時“問題解決”欄目中選擇簡單的甘氨酸和丙氨酸探討肽鍵形成，筆者認為探究實驗方案可同時以甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸為研究對象更為適宜。

3.2 對教材實驗方案的修改建議

綜合以上分析，為達到檢驗實驗現(xiàn)象更明顯、試劑成本更低、操作性更強等教學效果，同時使教材前后內容銜接更順暢，提出如下實施建議：

取1mL 1%的茚三酮溶液，加入1%的甘氨酸溶液3滴，將試管放入70℃熱水浴中（不超過10min），觀察現(xiàn)象。用丙氨酸溶液和苯丙氨酸溶液分別替代甘氨酸溶液，重復上述實驗。

4 結語

一線教師基于一定條件下對某些實驗現(xiàn)象提出一些新看法是很自然的，作為讀者似不宜認為書（包括權威著作）上的內容都是正確的，是否應提倡在學習過程中進行“質疑”，盡可能減少、避免對前人積累下來的知識的絕對信任、被動接受[7]。在教學過程中，類似于氨基酸與茚三酮實驗的案例還有很多，若我們在工作中能時常保持一顆“質疑之心”，進而進行一些必要的探索、分析與反思，將有助于增進對教材內容的深刻理解，合理把握和調控教學的難度與進度。從教師專業(yè)成長角度而言，也不失為一次很好的提升契機。

參考文獻：

[1][2]汪世龍等編著.蛋白質化學[M].上海：同濟大學出版社，2012：8，4～6.

[3]王苗霞，盧立春，王長鳳.關于氨基酸溶液的酸堿性及等電點計算問題的說明[J].生物技術世界，2012，（5）：23～25.

[4][6]洪永孟，陳清風.茚三酮顯現(xiàn)手印影響因素研究[J].海峽科學，2014，（11）：41～42.

[5]陳忠云. α-氨基酸和茚三酮反應的顏色與條件[J].邵陽師專學報，1995，（5）：56～59.

[7]嚴宣申. 2種制氧氣反應的探討[J].化學教育，2010，31（8）：84.