CCR9對乳腺癌細胞MCF—7增殖和侵襲的影響

劉肖++金曉娟+趙釗

[摘要] 目的 探討人CCR9基因在乳腺癌細胞中的生物學(xué)功能。 方法 取扁桃體標本并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴增CCR9基因，連接至pEGFP-N2質(zhì)粒，脂質(zhì)體感染人MCF-7乳腺癌細胞。免疫印跡證實CCR9基因在MCF-7乳腺癌細胞表達。CCK-8方法檢測MCF-7乳腺癌細胞增殖。 結(jié)果 免疫印跡證實構(gòu)建pEGFP-N2-CCR9質(zhì)粒及CCR9基因在MCF-7乳腺癌細胞中高效穩(wěn)定表達，且CCR9基因能促進MCF-7乳腺癌細胞過度增殖和侵襲（P<0.05或P<0.01）。 結(jié)論 CCR9基因促進MCF-7乳腺癌細胞增殖和侵襲。

[關(guān)鍵詞] CCR9；增殖；侵襲；乳腺癌細胞

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）35-0028-03

Effects of CCR9 on proliferation and invasion of breast cancer MCF-7 cells

LIU Xiao1 JIN Xiaojuan1 ZHAO Zhao2

1.Clinical Laboratory， The 117 Hospital of PLA， Hangzhou 310012， China； 2.Clinical Laboratory， Zhejiang Provincial People's Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To explore the biological function of human CCR9 gene in breast cancer cells. Methods Tonsil samples were taken and reverse-transcripted into cDNA. CCR9 gene was amplified， and was ligated to pEGFP-N2 plasmid. MCF-7 human breast cancer cells were infected by liposome. Immunoblotting confirmed the expression of CCR9 gene in MCF-7 breast cancer cells. CCK-8 assay was used to detect the proliferation of MCF-7 breast cancer cells. Results Western blot confirmed the construction of pEGFP-N2-CCR9 plasmid and efficient and stable expression of CCR9 gene in MCF-7 breast cancer cells. CCR9 gene could promote the over-proliferatioin and invasion of MCF-7 breast cancer cells（P<0.05 or P<0.01）. Conclusion CCR9 gene promotes the proliferation and invasion of MCF-7 breast cancer cells.

[Key words] CCR9； Proliferation； Invasion； Breast cancer cells

趨化因子是分子量為10 kDa左右的一類小分子蛋白，與相對應(yīng)的趨化因子受體結(jié)合具有趨化白細胞的功能。趨化因子受體是具有七次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體。趨化因子受體9（CC chemokine receptor 9，CCR9）與其相對應(yīng)的配體CCL25結(jié)合后與T淋巴細胞的趨化有關(guān)。趨化因子受體及其配體廣泛參與機體細胞生長、分化、腫瘤細胞的生長和遷移等各種生理病理過程。趨化因子及受體的相互結(jié)合在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移中扮演非常重要的作用，腫瘤細胞或免疫細胞表達特定的趨化因子受體，其受體與配體的相互結(jié)合引起腫瘤細胞的定向其靶器官的轉(zhuǎn)移或免疫抑制細胞的招募，從而最終引起患者死亡。

乳腺癌的局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者預(yù)后的重要因素，對預(yù)測浸潤和轉(zhuǎn)移的研究具有重要的臨床意義，其中趨化因子受體CCR9表達于大部分腫瘤細胞上，它的高表達會通過相應(yīng)的細胞骨架信號通路來促進腫瘤細胞的過度增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移。近年來，趨化因子及其受體在乳腺癌遠端轉(zhuǎn)移中的作用引起了重視[1，3]。本研究通過在人MCF-7乳腺癌細胞過度表達CCR9，并分析與乳腺癌細胞增殖和侵襲相關(guān)功能指標，初步探討CCR9在乳腺癌細胞中的功能。

1 材料與方法

1.1乳腺癌細胞和質(zhì)粒

1640培養(yǎng)基購自杭州Invitrogen公司，人MCF-7細胞購自北京細胞庫，pEGFP-N2質(zhì)粒購自美國Clontech公司。

1.2試劑

限制性內(nèi)切酶BglII和SalI（美國Promega公司，貨號：R6085、R6051）；T4連接酶（美國Promega公司，貨號：M1801）；胎牛血清（杭州四季青公司，貨號：HB0205）；有基質(zhì)膠的Transwell（美國BD公司，貨號：356234）；人CCR9一抗（美國Abcam公司，貨號：ab32556），大腸桿菌DH5α菌株購自杭州達科為公司，質(zhì)粒抽提試劑盒（上海生工公司，貨號B518191），Transwell細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司，引物由上海生工公司合成，CCK-8（CK04，日本同仁公司）。

1.3 方法

1.3.1 人MCF-7細胞的培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37℃的5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.3.2 構(gòu)建pEGFP-N2-CCR9 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染MCF-7細胞株 取正常人手術(shù)切除扁桃體標本，提取總RNA，在引物前后各加入BglII和SalI酶切位點，Taq酶擴增CCR9的基因，取擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳。將產(chǎn)物和pEGFP-N2質(zhì)粒酶切，電泳回收并用T4連接酶連接，再將質(zhì)粒進行細菌轉(zhuǎn)化，搖菌并提取質(zhì)粒。用1640培養(yǎng)基液稀釋質(zhì)粒和脂質(zhì)體混勻并孵育20 min加入細胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)孵育培養(yǎng)。

1.3.3 免疫印跡檢測CCR9蛋白表達 細胞裂解液提取細胞蛋白，100℃變性10 min并用免疫印跡電泳。用5%BSA將NC膜孵育0.5 h，加入β-actin或CCR9抗體與NC膜孵育1 h。用PBS溶液洗4次，加入HRP二抗，孵育0.5 h，PBS溶液洗4次，最后顯影。

1.3.4 檢測CCR9對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響 MCF-7細胞和MCF-7-CCR9細胞接種于6孔板中，當細胞生長到1、2和3 d 時，每一孔加入10 μL CCK-8并于在培養(yǎng)箱中孵育45 min，然后酶標儀450 nm處檢測吸光度值。

1.3.5 檢測CCR9對乳腺癌MCF-7細胞侵襲的影響 將MCF-7或MCF-7-CCR9細胞分別接種到含有基質(zhì)膠的Transwell板上。下面再加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加100%甲醇固定小室5 min，用結(jié)晶紫染色30 min，最后清洗拍照。

2 結(jié)果

2.1 在MCF-7乳腺癌細胞過表達后CCR9蛋白的表達

免疫印跡顯示CCR9和β-actin在特定位置有特異性條帶。MCF-7-CCR9細胞組比MCF-7組顏色加深（封三圖5），證實MCF-7-CCR9組中CCR9蛋白表達量比MCF-7組顯著升高（封三圖5）。

2.2 過表達CCR9對乳腺癌MCF-7細胞增殖能力的檢測

使用CCK-8實驗在1、2和3 d測定細胞增殖并統(tǒng)計。結(jié)果顯示CCR9對過表達CCR9的MCF-7細胞增殖顯著上升（P<0.05）（封三圖6）。

2.3過表達CCR9對乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力的檢測

鋪有基質(zhì)膠的侵襲實驗結(jié)果顯示，過表達CCR9的MCF-7細胞侵襲能力顯著上升（封三圖7A、7B），MCF-7-CCR9及MCF-7或每組拍照5個視野并統(tǒng)計。結(jié)果顯示CCR9對MCF-7乳腺癌細胞的侵襲能力顯著上升（P<0.01，封三圖7C）。

3 討論

趨化因子為機體免疫細胞分泌的小分子活性蛋白，活化的免疫細胞可產(chǎn)生相對應(yīng)的趨化因子。當趨化因子與其受體相互結(jié)合后，可促進細胞的歸巢和造血組織和器官形成[4]。許多研究證實，趨化因子的受體及其配體的相互作用與腫瘤細胞的定向遷移有著緊密的聯(lián)系[5-7]。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個具有特異組織性長期過程，原發(fā)灶的腫瘤細胞侵襲、遷移到特定組織的分子相關(guān)機制的研究并不十分明確。目前有很多學(xué)說可以解釋腫瘤轉(zhuǎn)移：包括種子土壤學(xué)說等。但最近研究顯示，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，趨化因子不僅參與了正常淋巴細胞的趨化，也參與了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移并非隨意性，轉(zhuǎn)移到特定器官的惡性腫瘤細胞常表現(xiàn)出高度的組織特異性[5]。大量研究證實特定分子能促進其增殖和侵襲，其中包括增強腫瘤細胞粘附到特定組織的內(nèi)皮細胞上：如靶器官會釋放大量的趨化因子，而靶器官分泌相對應(yīng)的趨化因子則能招募對應(yīng)表達相應(yīng)趨化因子受體的腫瘤細胞招募并大量生長[7]。在腫瘤細胞定向遷移的過程中，趨化因子則會通過與表達相應(yīng)趨化因子受體的腫瘤細胞相互作用，誘導(dǎo)腫瘤細胞的結(jié)構(gòu)重排，促使腫瘤細胞能夠穿透淋巴管的內(nèi)皮細胞，并最終轉(zhuǎn)移到遠端器官，從而在遠端器官定植，擴增，形成轉(zhuǎn)移灶，導(dǎo)致患者的重要器官功能衰竭并死亡。

大量研究證實：趨化因子受體CCR9與對應(yīng)配體趨化因子CCL25的結(jié)合在腫瘤細胞的組織特異性轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[8-10]，例如：Zhong Y等[11]研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常的肺組織，CCR9在肺癌組織中高表達，而且CCR9的表達水平與肺癌腫瘤組織的大小，淋巴結(jié)遠端轉(zhuǎn)移以及TNM腫瘤分期密切相關(guān)，且高表達CCR9的肺癌病人比低表達CCR9的肺癌病人生存期短，且是肺癌病人預(yù)后的獨立因子。體外實驗也支持CCR9-CCL25相互作用對肺癌細胞侵襲和遷移能力上發(fā)揮重要作用，CCR9-CCL25之間的相互作用能夠防止肺癌細胞過度凋亡，包括上調(diào)抗凋亡蛋白，下調(diào)凋亡蛋白，并且這種作用是依賴PI3K-/Akt 信號通路完成的，如果抑制PI3K-/Akt 信號通路，CCR9-CCL25之間的相互作用就會消失。此外，如果在運用慢病毒構(gòu)建的CCR9干擾質(zhì)粒，肺癌細胞則會過度的凋亡，體內(nèi)小鼠動物模型中腫瘤的負擔也會明顯減小[12-14]。另外，CCR9在前列腺癌細胞上也有高度表達，CCR9高表達在LNCaP和PC3前列癌細胞上，而不表達或低表達于正常的前列腺上皮細胞，抗體阻斷CCL25-CCR9的相互結(jié)合可以顯著減低LNCaP和PC3前列腺癌細胞的近端侵襲與遠端遷移，并且CCL25影響了膠原酶I和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1，MMP-13，MMP-10，MMP-11，MMP-2，而不是通過MMP-3，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-12，or MMP-14，說明CCL25-CCR9的相互作用還會通過影響腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)金屬蛋白酶的合成和降解來促進腫瘤的侵襲和遠端轉(zhuǎn)移[15]。

此外，Johnson-Holiday C等[16，17]應(yīng)用半定量免疫組化證實，CCR9在中低分化的乳腺癌組織中的表達量高于正常乳腺導(dǎo)管組織，且與乳腺癌細胞的分化程度呈負相關(guān)。在細胞水平上，惡性MDA-MD-231乳腺癌細胞上的CCR9表達顯著高于低惡性MCF-7，阻斷CCR9顯著降低乳腺癌細胞的侵襲和遷移。另外，CCR9-CCL25相互作用可以顯著上調(diào)乳腺癌細胞微環(huán)境中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達。隨后研究也顯示，CCL25趨化因子可促進乳腺癌細胞的過度增殖和抑制乳腺癌細胞的正常凋亡，可能是CCL25誘導(dǎo)PI3K信號通路等生存信號的活化來完成的。因此，CCL25也可能通過PI3K信號通路來調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡，侵襲和遷移。

Heinrich EL等[18，19]發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞能夠分泌CCR9對應(yīng)的趨化因子CCL25，并可通過自分泌和旁分泌的方式促進胰腺癌細胞的增殖和遷移。并用免疫組化方法檢測了胰腺癌組織和癌旁組織CCR9和CCL25的蛋白表達，結(jié)果顯示胰腺癌組織高度表達趨化因子受體CCR9，但癌旁組織中沒有CCR9的表達，同樣，胰腺癌組織高度表達趨化因子CCL25，但癌旁組織中沒有CCL25表達。從而在胰腺癌組織中，高度表達的CCR9和CCL25相互作用進一步促進了胰腺癌的惡性生物學(xué)行為。此外，PANC-1胰腺癌細胞也分泌CCL25，并且用CCR9的抗體能夠阻止胰腺癌細胞的侵襲。

Chamorro S等[20]構(gòu)建了特異性的CCR9抗體，并發(fā)現(xiàn)在急性T淋巴細胞白血病的免疫缺陷小鼠模型中使用CCR9抗體會減少85%腫瘤的大小，在腫瘤組織部位也伴隨著大量凋亡的腫瘤細胞和壞死區(qū)域，腫瘤細胞的增值率和腫瘤部位異常豐富的血供也明顯減少。并且在體外T淋巴細胞白血病細胞加入CCR9抗體，會導(dǎo)致白血病細胞的溶解。同樣，在黑色素瘤，乳腺癌小鼠腫瘤模型應(yīng)用了此種抗體，小鼠的腫瘤體積都明顯減少。

總之，我們的初步研究中成功構(gòu)建了CCR9 的表達質(zhì)粒，并證實CCR9在體外能夠促進乳腺癌細胞的侵襲和增殖，為以后的小鼠功能學(xué)研究做了鋪墊。

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（收稿日期：2016-08-04）