趨化因子受體CXCR2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

鄭正榮++++++葉凱++++++孫亞鋒++++++趙清泉++++++許建華

[摘要] 目的 探討結(jié)直腸癌患者組織中趨化因子受體CXCR2的表達(dá)水平及其對臨床上結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移等預(yù)后的影響。 方法 以46例大腸癌、20例結(jié)腸息肉或腺瘤、30例正常結(jié)腸黏膜為研究對象，采用免疫組織化學(xué)SP法及RT-PCR法檢測組織中CXCR2的蛋白質(zhì)定量及mRNA半定量水平，并根據(jù)臨床病理特征進(jìn)行對照分析。 結(jié)果 CXCR2表達(dá)水平（蛋白水平及mRNA水平）在結(jié)直腸癌組織與大腸良性腫瘤組織中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；CXCR2表達(dá)水平在腸癌組織與正常結(jié)腸組織中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；CXCR2表達(dá)水平在腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者與未轉(zhuǎn)移患者中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；不同分化程度腸癌CXCR2表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；結(jié)直腸癌中CXCR2的表達(dá)與臨床分期相關(guān)。 結(jié)論 結(jié)直腸癌細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移過程中可能有趨化因子受體CXCR2的參與，臨床上對腸癌組織CXCR2的檢測對其侵襲、轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的預(yù)測具有重要的意義。

[關(guān)鍵詞] 趨化因子受體；CXCR2；結(jié)直腸腫瘤；侵襲；轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）12（a）-0009-05

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈上升趨勢。由于結(jié)直腸癌手術(shù)時多已存在微轉(zhuǎn)移灶，故結(jié)腸癌患者行根治術(shù)后，仍有25%～30%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)。許多學(xué)者正在尋找一些客觀生物指標(biāo)，用于結(jié)直腸癌的早期診斷及預(yù)測侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)情況。目前趨化因子受體CXCR2與腫瘤的侵襲生長及轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究正成為一個新的熱點(diǎn)。CXCR2是趨化因子CXC亞家族的受體，與其特異性配體相作用可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)，從而介導(dǎo)細(xì)胞參與各種生理和病理過程[1]。在某些腫瘤細(xì)胞中CXCR2可高表達(dá)，可在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮作用。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法及RT-PCR方法檢測結(jié)直腸良性腫瘤（息肉和腺瘤）、結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中CXCR2的蛋白質(zhì)及mRNA水平的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年9月～2013年9月于本院行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者，完整病例資料且符合實(shí)驗條件入組病例共46例，其中男性27例，女性19例，平均年齡50.1歲。手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)病理科按流程標(biāo)準(zhǔn)處理，有經(jīng)驗病理科醫(yī)師HE染色于鏡下證實(shí)。同時取結(jié)直腸良性腫瘤（息肉或腺瘤）對照患者共20例，其中男性13例，女性 7例，平均年齡45.5歲。所有患者術(shù)前均未接受過其他相關(guān)治療。

1.2 試劑、儀器

1.2.1 免疫組織化學(xué)相關(guān)試劑 Elivision plus試劑盒（KIT-9901）購自福州邁新；鼠抗人CXCR2多克隆抗體（SC-683）：濃縮型，工作濃度為1∶200，購自SANTA CRUZ生物公司。

1.2.2 RT-PCR方法相關(guān)試劑 CXCR2引物序列（上游引物：5′-CAGCGACCCAGTCAG GATTTA-3′，5′-ACCAG CATCACGAGGGAGTTT-3′，產(chǎn)物251 bp）及內(nèi)參引物序列（β-actin上游引物：5′-ATCATGTTTGAGACCTTC AACA-3′，下游引物：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，產(chǎn)物318 bp）由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）購自Fermentas公司，Trizol、DEPC購自Invitrigeon公司，主要儀器：PCR儀（美國PE2400），凝膠電泳儀（DYY-Ⅲ8B），高速冷凍離心機(jī)（TGL-16G），凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集 于臨床手術(shù)中下標(biāo)本后30 min內(nèi)，取新鮮相關(guān)組織置于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測 充分勻漿鮮凍手術(shù)標(biāo)本組織并提取總RNA，取總RNA 3 μg，加入隨機(jī)引物oligo（dT）18 1 μl，70℃共孵育5 min，依次加入2.5 μl 10×reaction buffer、1 μl Rnasin（20 U/μl）、10 mmol/L dNTPs 2 μl，37℃孵育5 min，添加1 μl M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μl），42℃反應(yīng)60 min，合成第一鏈cDNA，70℃孵育10 min，終止反應(yīng)；以此cDNA模板進(jìn)行下一步實(shí)驗，PCR體系成分（總體積至25 μl）：1 μl Taq合酶（1 U/μl），1 U 10 μmol/L的上游引物、1 U 10 μmol/L的下游引物、2.5 μl 10×PCR緩沖液、0.5 μl 10 mmol/L dNTPs、1.0 μl 25 mmol/L MgCl2、去離子水補(bǔ)充。所需PCR條件設(shè)置：94℃變性45 s，60℃復(fù)性45 s，72℃延伸50 s，共28個循環(huán)，72℃再延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)對電泳膠進(jìn)行攝像，分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用x±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR2在正常大腸黏膜、惡、良性腫瘤組織中的表達(dá)

2.1.1 免疫組織化學(xué)SP法染色結(jié)果 CXCR2蛋白水平在癌細(xì)胞中細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈中-強(qiáng)染色，相比之下在良性腫瘤、正常大腸黏膜中，呈現(xiàn)出較弱染色甚至是無染色（圖1～圖3）。在該組病例中，CXCR2陽性表達(dá)率為69.6%，正常黏膜及良性腫瘤中CXCR2陽性表達(dá)率分別為33.3%和35.0%。

2.1.2 RT-PCR結(jié)果 較之良性腫瘤及相應(yīng)正常黏膜，大腸癌組織標(biāo)本中CXCR2 mRNA的表達(dá)量明顯升高，而各組中β-actin的表達(dá)相對均一（圖4）。

在蛋白水平及mRNA水平，CXCR2表達(dá)的檢出率與上述CXCR2陽性表達(dá)率相當(dāng)，在所選大腸癌病例中，CXCR2陽性表達(dá)率為69.6%，在正常大腸黏膜及良性腫瘤中CXCR2陽性表達(dá)率分別為33.3%和45.0%。

2.2 CXCR2在各組織中的含量

正常黏膜、良性腫瘤組織和大腸癌組織之間，CXCR2的含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。正常黏膜組織和良性腫瘤之間CXCR2的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1、表2）。

2.3 結(jié)直腸癌組織CXCR2表達(dá)水平與臨床病理特征間的關(guān)系

無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的CXCR2表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），低分化癌患者與高分化癌患者的CXCR2表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。臨床分期與CXCR2表達(dá)有相關(guān)性（P<0.05）。臨床病理特征中年齡、性別、腫瘤部位、是否肝轉(zhuǎn)移等因素與組織中CXCR2表達(dá)無相關(guān)性（P>0.05）。在免疫組織化學(xué)及RT-PCR法的檢測中得到相同的結(jié)論（表3、表4）。

3 討論

趨化因子受體可參與多種生理和病理過程[1]。趨化因子及趨化因子受體都在在腫瘤細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中有起重要作用[2]。國外已有實(shí)驗表明腫瘤的轉(zhuǎn)移部分受趨化因子的調(diào)控，多種趨化因子都與腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的相對應(yīng)受體有關(guān)。已有大量證據(jù)表明腫瘤的生長和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移與血管形成密切相關(guān)，血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ)。因此新生血管形成是轉(zhuǎn)移連鎖過程開始的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

CXCR2作為IL-8的受體之一（IL-8RB），通常被認(rèn)為通過與IL-8的相互作用主要在血管生成方面發(fā)揮效應(yīng)。因此諸多學(xué)者認(rèn)為CXCR2可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色，Glu-Leu-Arg（+）[ELR（+）]類CXC趨化因子，是血管發(fā)生的有力促進(jìn)因子，已經(jīng)被證明可以誘導(dǎo)肺非小細(xì)胞肺癌的血管生成活性。[ELR（+）]類CXC趨化因子有一個共同的受體即CXCR2。利用同系基因型Lewis肺癌細(xì)胞種植于C57BL/6鼠模型，分為CXCR2陽性組及CXCR2缺失組，首先顯示[ELR（+）]類CXC趨化因子與腫瘤的生長增殖及轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。其次發(fā)現(xiàn)在CXCR2缺失組鼠體中腫瘤的生長受到抑制，更甚，CXCR2缺失組鼠體中腫瘤的自發(fā)肺部轉(zhuǎn)移顯著減弱。形態(tài)測定分析發(fā)現(xiàn)CXCR2缺失組鼠體中原發(fā)腫瘤的腫瘤壞死比CXCR2陽性組明顯加強(qiáng)。實(shí)驗更進(jìn)一步證實(shí)了CXCR2在介導(dǎo)[ELR（+）]類CXC趨化因子血管生成中扮演的角色[3]。CXCR2可介導(dǎo)趨化活性和鈣動員，誘導(dǎo)腎細(xì)胞癌（RCC）中腫瘤相關(guān)血管生成從而促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[4]。已有研究證明惡性結(jié)直腸上皮細(xì)胞上過表達(dá)IL-8及CXCR2，預(yù)期通過阻斷CXCR2來達(dá)到抗腫瘤血管生成從而成為治療結(jié)直腸腺癌的有力靶點(diǎn)[3]。同時在胃癌[6]、前列腺癌[7]細(xì)胞株上亦發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株CXCR2的表達(dá)有差異。國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)有CXCR2在結(jié)直腸腫瘤中表達(dá)的相關(guān)文獻(xiàn)，國外對該因子的研究也僅限于胃癌、前列腺癌、胰腺癌[8]、乳腺癌[9]等。也少見對結(jié)直腸癌細(xì)胞株[10]的干預(yù)，最近文獻(xiàn)僅有Erreni等[11]通過結(jié)腸癌組織樣本與正常組織樣本的對比分析發(fā)現(xiàn)，CXCR2是結(jié)腸癌組織樣本中幾種顯著高表達(dá)的細(xì)胞因子受體之一。

本研究應(yīng)用RT-PCR法及免疫組織化學(xué)SP法對正常結(jié)腸黏膜組織、結(jié)腸良性腫瘤、結(jié)直腸癌、進(jìn)行檢測，測定這些組織標(biāo)本中CXCR2的mRNA及蛋白表達(dá)，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系。

RT-PCR結(jié)果顯示，癌組織中CXCR2 mRNA的表達(dá)高于及正常黏膜組織和良性腫瘤。RT-PCR法及免疫組織化學(xué)法對CXCR2表達(dá)的檢出率一致，在良性腫瘤中陽性率為45.0%；在正常大腸黏膜中陽性率為33.3%。結(jié)直腸癌、良性腫瘤、正常黏膜三者之間，CXCR2表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。研究顯示，CXCR2的表達(dá)與大腸癌的發(fā)生有著重要的關(guān)系。針對惡性腫瘤臨床病理特征的分析結(jié)果提示CXCR2表達(dá)水平高者，其浸潤能力強(qiáng)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多見，由于許多隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者不能被臨床所發(fā)現(xiàn)，所以檢測患者組織中CXCR2表達(dá)水平，可為臨床提供參考并期望成為評價腫瘤生長和浸潤情況的有效指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示CXCR2含量隨分期增加而逐步升高，提示組織CXCR2表達(dá)水平還與臨床分期密切相關(guān)（P<0.05），并且Ⅲ、Ⅳ期與Ⅰ、Ⅱ期相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明隨著臨床病期的進(jìn)展，CXCR2分泌量增高，腫瘤的侵襲能力增強(qiáng)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率增大，預(yù)后不良?；颊吣挲g、性別、腫瘤所在部位及肝轉(zhuǎn)移等臨床病理特征與組織中CXCR2含量之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示CXCR2并不參與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在免疫組織化學(xué)及RT-PCR法的檢測中得到相同的結(jié)論。

結(jié)腸癌中血管發(fā)生與包括復(fù)發(fā)率、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、無瘤生存率等預(yù)后參數(shù)密切相關(guān)。本研究檢測了結(jié)直腸癌、良性結(jié)直腸腫瘤及正常結(jié)直腸組織的CXCR2含量，結(jié)果說明CXCR2在由正常結(jié)腸黏膜或結(jié)腸良性腫瘤到結(jié)直腸癌的逐步演變過程中起到重要作用。腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是評價惡性腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)[13-20]，本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤所在部位等臨床病理特征與CXCR2表達(dá)之間無相關(guān)性，而與腫瘤的臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，說明CXCR2表達(dá)可能和腫瘤浸潤深度和局部淋巴結(jié)侵襲轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)系，通過相關(guān)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)及實(shí)驗結(jié)果，推測CXCR2在腫瘤新生血管形成中扮演著重要的角色，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的血管生成活性，誘導(dǎo)微血管的增殖和趨化現(xiàn)象，促進(jìn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞的浸潤侵襲。

在腫瘤的體外試驗階段特異性阻斷趨化因子受體CXCR2信號系統(tǒng)的傳遞，可以達(dá)到抑制腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的能力，為抗腫瘤的研究提供了新的思路，這在胰腺癌的靶向治療方面已經(jīng)有了初步的實(shí)驗證據(jù)[12]，在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)有趨化因子受體CXCR2的高表達(dá)，也為結(jié)直癌的綜合治療提供了可參考的指標(biāo)和方向。

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（收稿日期：2014-10-14 本文編輯：郭靜娟）

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（收稿日期：2014-10-14 本文編輯：郭靜娟）