合成生物學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展——DNA合成、組裝與基因組編輯

李詩(shī)淵，趙國(guó)屏，王金

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合成生物學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展——DNA合成、組裝與基因組編輯

李詩(shī)淵1,2，趙國(guó)屏1，王金1

1 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

李詩(shī)淵, 趙國(guó)屏, 王金. 合成生物學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展——DNA合成、組裝與基因組編輯. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(3): 343–360.Li SY, Zhao GP, Wang J. Enabling technologies in synthetic biology——DNA synthesis, assembly and editing. Chin J Biotech, 2017, 33(3): 343–360.

合成生物學(xué)作為一門新興學(xué)科，其目標(biāo)主要有兩點(diǎn)：一是利用非天然的分子使其出現(xiàn)生命的現(xiàn)象，也就是“人造生命”；二是“改造生命”，比如利用一種生命體的元件(或經(jīng)過(guò)人工改造)，組裝到另一個(gè)生命體中，使其產(chǎn)生特定功能。無(wú)論是哪種目的，對(duì)生命遺傳物質(zhì)DNA的操作都非常關(guān)鍵，其具體包括DNA的從頭合成、組裝和編輯等。同時(shí)，這些使能技術(shù)的進(jìn)步也促進(jìn)了合成生物學(xué)其他領(lǐng)域的發(fā)展。本文介紹了DNA操作相關(guān)的合成生物學(xué)使能技術(shù)的最新進(jìn)展。

合成生物學(xué)，使能技術(shù)，DNA組裝，基因合成，基因組編輯

20世紀(jì)90年代開始，DNA的大量測(cè)序?yàn)楹铣缮飳W(xué)的發(fā)展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[1]。2000年，Collins等團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中成功構(gòu)建了撥動(dòng)開關(guān)和振蕩器[2-3]；這些工作也預(yù)示著合成生物學(xué)這一新學(xué)科的正式開啟。2010年，Venter團(tuán)隊(duì)利用化學(xué)合成的絲狀支原體JCVI-syn1.0基因組DNA替換了原山羊支原體的細(xì)胞，并成功實(shí)現(xiàn)了自我復(fù)制，對(duì)“人造生命”具有里程碑的意義[4]。雖然合成生物學(xué)僅經(jīng)歷十多年的發(fā)展，但已經(jīng)取得了不少進(jìn)展。可以預(yù)期，合成生物學(xué)將對(duì)藥物、能源、材料、環(huán)境以及人類的健康等領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響[5]。

合成生物學(xué)作為一門生物學(xué)與工程學(xué)融合的學(xué)科，實(shí)際上是工程學(xué)的思維在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[6]。工程學(xué)中重要的策略，標(biāo)準(zhǔn)化(Standardization)、模塊化(Modularity/decoupling)以及建模(Abstraction/modeling) 在合成生物學(xué)中同樣關(guān)鍵。另外，合成生物學(xué)家們將復(fù)雜的系統(tǒng)分解，利用工程學(xué)的思維在不同的尺度上(如元件、回路、途徑等) 進(jìn)行設(shè)計(jì)、組裝構(gòu)建、測(cè)試并重新設(shè)計(jì)的循環(huán)實(shí)驗(yàn)過(guò)程；其中，每一步工作都有新技術(shù)被不斷地開發(fā)出來(lái)[7]。對(duì)這些技術(shù)的開發(fā)和利用也能進(jìn)一步促進(jìn)合成生物學(xué)的快速發(fā)展。本文就合成生物學(xué)中DNA操作的相關(guān)技術(shù)加以介紹，其中包括DNA組裝、DNA從頭合成和基因組編輯等。

1 DNA組裝

20世紀(jì)70年代，第一次將DNA片段通過(guò)限制性內(nèi)切酶和連接酶實(shí)現(xiàn)了DNA序列的“切和連”，從而開啟了基因工程的生物技術(shù)革命[8-9]。合成生物學(xué)延續(xù)了基于重組DNA的技術(shù)，同時(shí)又加入了新的要求和思想。從大方向來(lái)說(shuō)，DNA組裝技術(shù)追求兩個(gè)大的方向，一個(gè)是建立組裝的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)其操作標(biāo)準(zhǔn)化[10]，另一個(gè)是建立更簡(jiǎn)便、高效且能組裝更大更復(fù)雜片段的方 法[11]。BioBrick的標(biāo)準(zhǔn)是Tom Knight等在2003年提出的，是最先建立的一套DNA體外拼接標(biāo)準(zhǔn)。該方法利用了一組標(biāo)準(zhǔn)化的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，分別叫做前綴(含RⅠ、Ⅰ位點(diǎn)) 和后綴(含Ⅰ、Ⅰ位點(diǎn)) 的序列位于每一個(gè)生物元件的兩端。利用這些位點(diǎn)進(jìn)行切割和后續(xù)的連接便形成了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的DNA拼接流程[12]。BioBrick標(biāo)準(zhǔn)目前仍然應(yīng)用于合成生物學(xué)領(lǐng)域，特別在每年的國(guó)際遺傳工程機(jī)器大賽(iGEM) 中，很多工作的實(shí)現(xiàn)都是利用BioBrick標(biāo)準(zhǔn)。BioBrick標(biāo)準(zhǔn)對(duì)合成生物學(xué)的主要貢獻(xiàn)包括以下兩點(diǎn)：首先，兩端的內(nèi)切酶序列為單個(gè)生物元件設(shè)立了物理邊界，因此DNA的拼接可以像樂高玩具一樣，便于將來(lái)工程化的操作；其次，在整個(gè)研究群體中，標(biāo)準(zhǔn)化拼接方法的建立可以實(shí)現(xiàn)不同研究團(tuán)體間DNA元件的通用，避免了重新構(gòu)建的麻煩，也實(shí)現(xiàn)了資源共享。盡管有這些優(yōu)勢(shì)，但是BioBrick最主要的局限是元件序列中不能含有前后綴中的酶切位點(diǎn)序列。另外，連接中會(huì)形成疤痕序列，這種疤痕序列可能會(huì)影響生物元件的功能，并且不能用此方法構(gòu)建融合蛋白。

1.1 基于內(nèi)切酶的拼接方法

針對(duì)BioBrick標(biāo)準(zhǔn)的缺陷，陸續(xù)產(chǎn)生了不少改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)。比如BglBrick標(biāo)準(zhǔn)中利用Ⅱ和HⅠ作為同尾酶連接，從而使得連接之后得到的疤痕序列(編碼甘氨酸-絲氨酸)，且可以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)蛋白的融合表達(dá)[13]。另外，我們實(shí)驗(yàn)室建立的iBrick標(biāo)準(zhǔn)，利用識(shí)別長(zhǎng)序列的歸位內(nèi)切酶代替了常規(guī)的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，從而避免了BioBrick標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于DNA元件序列的要求(例如，不能含有標(biāo)準(zhǔn)中的酶切位點(diǎn)等)[14]。但iBrick也存在明顯的缺點(diǎn)，即利用iBrick標(biāo)準(zhǔn)拼接的兩個(gè)元件之間會(huì)形成一個(gè)較長(zhǎng)的疤痕序列。最近，我們利用CRISPR相關(guān)蛋白Cpf1開發(fā)了一套C-Brick的拼接標(biāo)準(zhǔn)。由于Cpf1可以由人工設(shè)計(jì)的crRNA特異性引導(dǎo)切割DNA并形成5′突出的粘性末端，通過(guò)類似BioBrick的前后綴設(shè)計(jì)思路，從而實(shí)現(xiàn)DNA元件的標(biāo)準(zhǔn)化拼接。C-Brick的優(yōu)點(diǎn)是，不僅可以識(shí)別長(zhǎng)的序列(26 bp左右的特定序列)，而且產(chǎn)生短的疤痕序列(編碼的氨基酸與BglBrick相同)[15]。

此外，基于限制性內(nèi)切酶的拼接方法還包括Golden Gate以及在此基礎(chǔ)上的改進(jìn)方法。Golden Gate拼接方法利用ⅡS類(type ⅡS) 限制性內(nèi)切酶，其切割位點(diǎn)位于識(shí)別位點(diǎn)之外，因此留下一個(gè)可變的粘性末端，可以實(shí)現(xiàn)多片段一步法無(wú)縫連接[16-17]。Golden Gate雖然操作方便，其仍然受限于DNA中廣泛存在的酶切位點(diǎn)。為此，本實(shí)驗(yàn)室建立了MASTER (Methylation-assisted tailorable ends rational) 連接法。該方法使用了甲基化依賴的JⅠ，它兼具type ⅡM和type ⅡS的性質(zhì)，即它只識(shí)別甲基化的4 bp序列mCNNR (R=A或G)，并且切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外。通過(guò)PCR或添加接頭，可以很方便地在所需連接的片段兩端加入JⅠ的識(shí)別序列，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)大片段的無(wú)縫拼接[18]。

1.2 位點(diǎn)特異性重組

位點(diǎn)特異性重組舍棄了限制性內(nèi)切酶，取而代之的是噬菌體整合酶。這些位點(diǎn)特異性整合酶可以識(shí)別不同版本的附著點(diǎn)(attB、attP) 序列，然后實(shí)現(xiàn)這些DNA序列之間的重組。目前，最常用的是Gateway克隆方法，其具體流程是通過(guò)λ整合酶將需克隆的DNA (兩端含正交的兩個(gè)位點(diǎn)attB與attP) 直接重組到載體中[19]。這個(gè)方法簡(jiǎn)單、高效，在克隆文庫(kù)的構(gòu)建和真核表達(dá)系統(tǒng)的分析中被廣泛應(yīng)用[20-21]。通過(guò)合成多個(gè)正交的att重組序列，Gateway方法也可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)DNA片段的一步法、按順序拼接[22]。

然而，Gateway (或類似) 拼接方法會(huì)在拼接完成的DNA序列之間留下重復(fù)的疤痕序列，可能會(huì)對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)、mRNA的折疊以及DNA的生物學(xué)功能帶來(lái)一定問題。

1.3 基于重疊序列的拼接

Gibson等開發(fā)了一種廣泛采用的拼接方法(Gibson assembly)，可以實(shí)現(xiàn)多片段體外一步法拼接[23]。這個(gè)方法通常需要一個(gè)線性化的載體和若干個(gè)PCR產(chǎn)物，在相鄰兩個(gè)DNA片段之間留有20?40 bp的重疊區(qū)。在反應(yīng)階段，T5外切酶將DNA的5′端序列部分消化，形成3′突出的粘端。然后在50 ℃下使得T5外切酶失活的同時(shí)，片段之間的重疊區(qū)退火連接，然后在Phusion聚合酶的作用下，補(bǔ)平片段間的間隔區(qū)，最后利用DNA連接酶連接好DNA缺刻。Gibson assembly方法非常簡(jiǎn)單，可以一次組裝5個(gè)或更多的片段，且整個(gè)反應(yīng)只需1 h；組裝完成的反應(yīng)物可直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。比如，用Gibson assembly方法拼接完成了生殖支原體基因組的拼接(583 kb)[23]。Gibson方法能拼接最大片段的限制還不確定，但目前已經(jīng)有900 kb片段拼接成功的案例[23]。

基于重疊序列拼接的方法還有SLiC (Sequence and Ligase-independent Cloning)[24]，CPEC (Circular Polymerase Extension Cloning)[25]和SLiCE (Seamless Ligation Cloning Extract)[26]等。SLiC方法利用T4 DNA聚合酶處理載體和插入片段，在無(wú)dNTPs狀態(tài)下，T4 DNA呈現(xiàn)外切酶的活性。然后加入dCTP終止外切反應(yīng)，然后將載體與片段混合并退火[24]。由于SLiC沒有延伸和連接，所以缺口的補(bǔ)平在大腸桿菌體內(nèi)完成。CEPC是一種基于PCR的連接方法，經(jīng)過(guò)變性使得載體與插入片段形成單鏈，由于兩者間有重疊序列，退火后可以互為引物進(jìn)行延伸，由此可以進(jìn)行連接[25]。SLiCE區(qū)別于SLiC的地方在于該反應(yīng)中利用大腸桿菌細(xì)胞提取物，這樣就不需要額外的聚合酶和DNA連接酶，而且操作簡(jiǎn)單便宜，1 h之內(nèi)即可完成[26]。

此外，一些生物技術(shù)公司也開發(fā)了簡(jiǎn)單易用的無(wú)縫拼接試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)DNA片段的一步法無(wú)縫拼接，例如TaKaRa公司的In-Fusion試劑盒(50 ℃條件下反應(yīng))、上海吐露港公司的Ezmax無(wú)縫拼接試劑盒(37 ℃條件下反應(yīng)) 等。這些公司的產(chǎn)品雖然效率很高，但均沒有公布具體的實(shí)驗(yàn)機(jī)制或?qū)＠墨I(xiàn)，其具體的操作原理未知。

相比傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶方法，基于重疊序列的拼接方法最明顯的優(yōu)勢(shì)是不需要考慮片段內(nèi)部的序列限制。但必須指出的是，重復(fù)序列、短序列或容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列都會(huì)降低這些方法的效率和成功率，因此需要盡量避免。

1.4 體內(nèi)DNA拼接

許多物種體內(nèi)具有強(qiáng)大的重組系統(tǒng)，例如枯草芽胞桿菌和酵母菌等。利用體內(nèi)的重組系統(tǒng)可以將兩端帶同源序列的片段通過(guò)重組的方法連接起來(lái)；該方法對(duì)于大片段DNA的拼接非常有優(yōu)勢(shì)。例如，Itaya等利用枯草芽胞桿菌，組裝了小鼠線粒體基因組和水稻葉綠體基因組[27]；Venter的團(tuán)隊(duì)利用酵母系統(tǒng)拼接了的生殖道支原體JCVI-1.0基因組[28-29]和1.1 Mb的絲狀支原體基因組[4]。在實(shí)際的應(yīng)用中，多個(gè)超大DNA片段同時(shí)轉(zhuǎn)化到酵母體內(nèi)有一定的技術(shù)難度；覃重軍團(tuán)隊(duì)開發(fā)了CasHRA技術(shù)，利用酵母原生質(zhì)體融合，結(jié)合Cas9在體內(nèi)切割釋放出待拼接的DNA片段，然后利用酵母體內(nèi)重組系統(tǒng)將片段拼接，最后得到1.03 Mb的MGE-syn1.0最小大腸桿菌基因組[30]。

2 DNA從頭合成

盡管通過(guò)體內(nèi)體外改造天然的DNA序列可以解決很多問題，但更多的情況下，DNA的從頭合成有著許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[31]。首先，工程化改造一個(gè)新功能的DNA序列常常需要大幅度甚至是全序列的改變，因此利用從頭合成的技術(shù)是最容易實(shí)現(xiàn)目的的。第二，對(duì)于研究遺傳學(xué)機(jī)理方面，經(jīng)過(guò)人工優(yōu)化合成的序列往往要優(yōu)于天然的序列，因?yàn)檫@些序列可以設(shè)計(jì)并測(cè)試一些假說(shuō)。第三，很多序列很難獲得天然來(lái)源的模板來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增和修飾，例如，利用宏基因組數(shù)據(jù)拼接完成的序列。這里我們介紹DNA從頭合成的技術(shù)，包括從大規(guī)模的單鏈DNA的合成、進(jìn)一步組裝成更長(zhǎng)雙鏈DNA序列以及其中存在的一些問題。

2.1 寡核苷酸合成

寡核苷酸的合成可以追溯到20世紀(jì)50年代在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的DNA合成；接著在80年代逐漸形成了自動(dòng)化和商業(yè)化；而到了90年代，基于高通量的寡核苷酸合成的方法取得了重要進(jìn)展[32]。

2.1.1 柱式寡核苷酸合成

20世紀(jì)50年代，Todd等第一次成功合成寡核苷酸[33]。如今，絕大部分寡核苷酸都是利用自動(dòng)化的設(shè)備通過(guò)固相亞磷酰胺化學(xué)法來(lái)進(jìn)行合成。其具體過(guò)程由4步循環(huán)組成，分別是：1) 去保護(hù)；2) 偶聯(lián)；3) 加帽和4) 氧化[34]，且一個(gè)循環(huán)生成一個(gè)新的核苷酸。

這種自動(dòng)化的方法通?？梢赃_(dá)到96?384條核苷酸合成通量，每一條10到100 nmol的含量。多年來(lái)，材料、自動(dòng)化、加工和純化方面的進(jìn)步使得合成100 nt的核苷酸大約是每核苷酸0.05?0.15美元，錯(cuò)誤率在1/200甚至更低。化學(xué)法合成的局限在于合成的長(zhǎng)度和錯(cuò)誤率，有以下幾個(gè)原因。首先，每一步循環(huán)的產(chǎn)量必須非常高，特別是對(duì)于生產(chǎn)長(zhǎng)鏈的寡核苷酸。比如說(shuō)，即使每一循環(huán)的產(chǎn)量達(dá)到99%，那么對(duì)于200 nt的寡核苷酸來(lái)說(shuō)，最終理論上只能得到13%的全長(zhǎng)產(chǎn)物。另外，脫嘌呤反應(yīng)，特別是腺嘌呤會(huì)在合成長(zhǎng)寡核苷酸時(shí)出現(xiàn)問題[35]。最后，即使成功合成的寡核苷酸也可能有一定概率的錯(cuò)誤[36]。因此，還需要研發(fā)新的化學(xué)工藝來(lái)增加合成長(zhǎng)度和提高質(zhì)量。

2.1.2微陣列介導(dǎo)的DNA合成

20世紀(jì)90年代的早期，Affymetrix公司開發(fā)了基于微陣列合成的方法[37-38]。他們運(yùn)用有掩模光刻法(Mask-based photolithographic) 技術(shù)，來(lái)選擇性去保護(hù)光不穩(wěn)定核苷亞磷酰胺。如今，已有多種方法對(duì)DNA微陣列從空間上進(jìn)行去保護(hù)。無(wú)掩模程序大大簡(jiǎn)化了光刻技術(shù)，通過(guò)程序化的微鏡設(shè)備，直接用光進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)[39-40]。微陣列表面進(jìn)行噴墨打印核苷酸的技術(shù)(Agilent公司所用) 可以用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺法合成寡核苷酸[41-42]。另外，CustomArray公司開發(fā)了基于半導(dǎo)體的電化學(xué)法來(lái)選擇性去保護(hù)核酸[43]。目前，科研界使用的寡核苷酸池主要來(lái)自于Agilent和CustomArray公司；其價(jià)格要比柱式便宜2?4個(gè)數(shù)量級(jí)(根據(jù)不同長(zhǎng)度、規(guī)模和平臺(tái)，每個(gè)核苷酸0.000 01?0.001美元)。

2.2 基因合成

將一組寡核苷酸(通常是5?50個(gè)) 通過(guò)一定的方法組裝成更大的片段(通常200?3 000 bp)，叫做基因合成(Gene synthesis)，當(dāng)然這里的基因指的是基因長(zhǎng)度的意思。最初，Khorana研究團(tuán)隊(duì)用T4 DNA連接酶將寡核苷酸連接成了80–200 bp長(zhǎng)度的序列[44-45]。這種基于連接的方法，將互補(bǔ)重疊的鏈通過(guò)連接酶反應(yīng)形成更長(zhǎng)的片段。后來(lái)，將普通連接酶改成耐熱連接酶，在高溫下(50?65 ℃) 連接，從而減少了寡核苷酸鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成[46-47]。聚合酶循環(huán)組裝PCA (Polymerase cycling assembly) 的方法是目前更常用的拼接方法，這種方法利用聚合酶將片段重疊區(qū)進(jìn)行延伸，形成雙鏈DNA片段[48]。連接法和PCA法通常都需要利用PCR進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)增，并進(jìn)行最終的克隆和測(cè)序確認(rèn)。

兩種方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，連接法合成降低了錯(cuò)誤率的發(fā)生，這是因?yàn)殄e(cuò)誤的序列雜合并連接的可能性較低。然而，上下兩條鏈都需要完整地被寡核苷酸鏈覆蓋，并且5′末端需要磷酸化修飾，因此這種方法的價(jià)格更高。PCA的方法只需要在兩條寡核苷酸鏈之間有15?25 nt的重疊即可，因此相比連接法，PCA合成的寡核苷酸更少。當(dāng)然，沒有雜交過(guò)程的錯(cuò)誤過(guò)濾，PCA合成的錯(cuò)誤率要高一些。

雖然微陣列合成寡核苷酸非常便宜，但對(duì)于基因合成還有一些挑戰(zhàn)。首先，雖然一個(gè)“pool”中合成的寡核苷酸數(shù)量非常大，但是大多數(shù)情況下單種的濃度很低。第二，微陣列合成的錯(cuò)誤率通常比基于柱式合成的方法更高。最后，生產(chǎn)的寡核苷酸絕對(duì)數(shù)量在基因拼接中易導(dǎo)致干擾，使得很難按比例進(jìn)行放大。

實(shí)際上，這些困難應(yīng)該都是可以克服的。田敬東等在拼接前，利用PCR的方法擴(kuò)增提高寡核苷酸的濃度，通過(guò)與反向互補(bǔ)鏈的雜交來(lái)降低錯(cuò)誤率，然后通過(guò)設(shè)計(jì)蛋白序列結(jié)合計(jì)算來(lái)避免可能的錯(cuò)誤雜交[49]。但是，這個(gè)工作一次只用了十幾到上百條寡核苷酸序列。超過(guò)1 000個(gè)寡核苷酸就很難用這個(gè)方法[50]。因此，一個(gè)寡核苷酸pool越大，價(jià)格優(yōu)勢(shì)就越明顯，但合成基因就變得越困難。另外，這種方法需要在合成的基因序列中有足夠的序列正交性，這也限制了一部分潛在的應(yīng)用范圍。目前，主要采用通過(guò)將寡核苷酸分離成“subpool”的方法來(lái)避免序列的復(fù)雜性和正交性。Kosuri等用預(yù)先設(shè)計(jì)好的“條形碼”序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這些擴(kuò)增的序列參與部分拼接，并且在標(biāo)準(zhǔn)拼接之前需要將“條形碼”序列切除[51]。Quan等用噴墨合成的方法，用物理手段將寡核苷酸序列分組到分開的微孔中，然后原位擴(kuò)增拼接[52]。這兩種方法都用到了更大的寡核苷酸pool (>10 000條寡核苷酸)，并通過(guò)酶法糾正錯(cuò)誤序列，提高拼接準(zhǔn)確率，從而為其將來(lái)的商業(yè)化鋪平了路。

2.3 錯(cuò)誤序列的糾正

在基因序列組裝完成之后，還需要對(duì)合成的基因進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。在整個(gè)基因合成的過(guò)程中，該步驟成本高、耗時(shí)，而且很難自動(dòng)化。因此，減少基因合成過(guò)程中的錯(cuò)誤率，可以減少待驗(yàn)證克隆的數(shù)量，從而降低工作量和合成成本。前期的方法是融合一個(gè)編碼蛋白的序列，通常是抗性蛋白或熒光蛋白[53-54]。由于單堿基的缺失會(huì)導(dǎo)致移碼從而使蛋白失活，通過(guò)篩選可以去除很多錯(cuò)誤序列；但這種方法僅限于蛋白編碼的序列。

更常用的糾錯(cuò)方法是利用酶的方法來(lái)降低錯(cuò)誤率。所有這些技術(shù)都基于一個(gè)事實(shí)，就是在每個(gè)位置，大多數(shù)寡核苷酸分子序列是正確的堿基。加熱、退火可以迫使異源雜合鏈的形成，從而形成不標(biāo)準(zhǔn)的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。這種破壞可以被一些蛋白識(shí)別并作用。MutS可以結(jié)合雜合鏈，通過(guò)反向純化可以過(guò)濾掉這些錯(cuò)誤鏈[55]。一些聚合酶有外切酶、內(nèi)切酶和解鏈的活性，通過(guò)切割雜合位點(diǎn)再重新擴(kuò)增也能夠達(dá)到過(guò)濾錯(cuò)誤序列的目的[36,56-58]。有些商業(yè)化公司也利用混合酶ErrASE來(lái)減少合成基因的錯(cuò)誤率[51]。

最近幾年，有研究人員運(yùn)用第二代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing，NGS) 篩選正確序列，可以在寡核苷酸水平或基因水平篩選正確的目標(biāo)DNA序列。Matzas等利用454測(cè)序法結(jié)合機(jī)器吸取移液頭，自動(dòng)化讀取序列并利用正確的序列合成基因[59]。Kim等也利用454測(cè)序，但在每個(gè)分子上標(biāo)有隨機(jī)標(biāo)簽，通過(guò)測(cè)序正確的序列則利用特定標(biāo)簽序列進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增[60]。兩種方法都能夠降低突變率，雖然這些方法仍然會(huì)面臨測(cè)序錯(cuò)誤和更昂貴的長(zhǎng)鏈測(cè)序的問題。Schwartz等用Illumina測(cè)序法來(lái)獲取正確序列，通過(guò)帶標(biāo)簽測(cè)序的方法克服了長(zhǎng)測(cè)序錯(cuò)誤的局限，然后通過(guò)標(biāo)簽引物PCR擴(kuò)增(Dial PCR)[61]。這3種方法降低了錯(cuò)誤率，并且隨著DNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步而改進(jìn)。

2.4 從頭合成的大片段DNA組裝

商業(yè)機(jī)構(gòu)和學(xué)術(shù)系統(tǒng)已經(jīng)可以用高效、高正確率、高可靠性以及低成本的方法將基因長(zhǎng)度的片段拼接成更大的片段。目前，有不少無(wú)縫拼接的方法(如前文所述)。對(duì)于大片段的拼接也可以應(yīng)用這些方法，特別是Gibson和體內(nèi)酵母拼接已經(jīng)實(shí)現(xiàn)基因組大小的片段的一步拼接[23,28]。

因此，對(duì)于從頭合成的應(yīng)用，合成基因大小的片段的花費(fèi)和錯(cuò)誤比拼接大片段DNA更為重要。

3 基因組編輯工具

基因組編輯工具在過(guò)去一段時(shí)間里得到了迅猛的發(fā)展，目前已經(jīng)有不少能夠靶向基因組特定位點(diǎn)的工具。最早期使用同源重組的方法進(jìn)行基因組的編輯[62]，但不同系統(tǒng)的效率不一，而且通常需要引入抗性等篩選標(biāo)記。后來(lái)，利用位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)大大提高了效率，包括Cre蛋白(Cyclization recombinase) 和與之對(duì)應(yīng)的loxP序列，F(xiàn)lp-FRT系統(tǒng)，C31整合酶-att位點(diǎn)[63-65]。這些系統(tǒng)首先需要loxP、FRT、att序列插入到基因組上的特定位點(diǎn)，然后引入位點(diǎn)特異性重組蛋白，使得基因組DNA重排。近幾年位點(diǎn)特異性切割蛋白得到了迅速發(fā)展，從大型核酸酶(Meganuclease) 的應(yīng)用[66-67]，到鋅指蛋白核酸酶ZFN (Zinc-finger nuclease)[68-70]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶TALEN (Transcription activator- like)[71-72]和CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)[73-75]等。這些工具的共同點(diǎn)都是在細(xì)胞內(nèi)引起DNA雙鏈的斷裂(Double-strand breaks)，然后通過(guò)細(xì)胞自身的非同源末端連接引起錯(cuò)誤修復(fù)，或者額外加入同源重組模板進(jìn)行重組修復(fù)的精確編輯。這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比見表1。具體來(lái)說(shuō)，大型核酸酶是一類識(shí)別長(zhǎng)序列(12?45 bp) 的核酸內(nèi)切酶，特異性高，但通常需要將這段識(shí)別序列先插入到特異位點(diǎn)中，因此造成一定的不便。之后，發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白可以被工程化改造為特異性識(shí)別的核酸酶ZFN，通過(guò)融合序列特異性DNA結(jié)合的鋅指蛋白串聯(lián)重復(fù)序列與Ⅰ核酸酶結(jié)構(gòu)域。另一工程化的核酸酶是TALEN，這一改造思路與鋅指蛋白類似，同樣需要融合Ⅰ核酸酶，但TALEN的特異性和效率都要優(yōu)于ZFN。ZFN和TALEN這兩個(gè)系統(tǒng)在實(shí)際切割過(guò)程中，都需要一對(duì)蛋白靶向到相鄰的兩端DNA序列上，使得Ⅰ核酸酶形成二聚體進(jìn)行雙鏈DNA切割。最近幾年，來(lái)源于原核生物的CRISPR系統(tǒng)(特別是Cas9)，由于其簡(jiǎn)便、高效而受到了廣泛的關(guān)注。此外，2015年張鋒實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)CRISPR相關(guān)蛋白Cpf1同樣可以進(jìn)行基因組編輯[76]，且擁有比Cas9更低的脫靶率，因而同樣具有很大的應(yīng)用潛力[77-78]。在本綜述中，我們將重點(diǎn)介紹目前最具應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿Φ腃RISPR技術(shù)。另外，除了單個(gè)位點(diǎn)或少數(shù)位點(diǎn)的基因組編輯技術(shù)外，對(duì)于高通量基因組編輯工程也會(huì)做一簡(jiǎn)要介紹。

表1 不同內(nèi)切酶系統(tǒng)比較

3.1 CRISPR技術(shù)

3.1.1CRIPSR的免疫機(jī)理

CRISPR系統(tǒng)是許多細(xì)菌和大多數(shù)古菌的獲得性免疫系統(tǒng)。這些含有CRISPR系統(tǒng)的菌株會(huì)首先從侵染它們的噬菌體或質(zhì)粒上獲得一些DNA片段，并轉(zhuǎn)錄成crRNAs (CRISPR RNAs)。在同樣的外源核酸再次侵染時(shí)，crRNAs會(huì)引導(dǎo)Cas蛋白切割再次侵染的RNA或DNA，從而幫助宿主獲得了對(duì)該外源核酸的免疫[79-80]。

一般來(lái)說(shuō)，CRISPR系統(tǒng)響應(yīng)外源侵染的DNA分為3個(gè)階段[81]。第一個(gè)階段也被稱為獲取階段，宿主獲取侵染的質(zhì)?；蚴删w的DNA片段(叫做protospacers) 并插入到CRISPR基因座的重復(fù)序列中。第二個(gè)階段，Cas蛋白表達(dá)，含有spacer的CRISPR序列轉(zhuǎn)錄成前體crRNA (pre-crRNA)，接著前體crRNA被加工成成熟的crRNA。加工完成的crRNA起引導(dǎo)作用，通過(guò)Cas蛋白和其他RNA組分靶向侵染的基因組[82]。在typeⅡ的CRISPR系統(tǒng)中，非編碼的tracrRNA與crRNA的重復(fù)序列結(jié)合，這對(duì)crRNA的加工、Cas9蛋白的結(jié)合和Cas9介導(dǎo)的靶向切割非常重要。在第3個(gè)階段，Cas蛋白在crRNA的介導(dǎo)下，識(shí)別特定的靶標(biāo)序列并切割靶標(biāo)序列，從而達(dá)到宿主細(xì)胞預(yù)防侵染的作用。另外，許多CRISPR系統(tǒng)需要在靶標(biāo)臨近存在短的PAM (Protospacer Adjacent Motif) 序列[83]。在Cas蛋白中，目前研究得最為清楚的就是Cas9和Cpf1，下面將從其結(jié)構(gòu)、應(yīng)用等多方面對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)闡述。

3.1.2Cas9的結(jié)構(gòu)

Cas9完成識(shí)別和切割有3個(gè)成員參與了這一過(guò)程，包括被切割的雙鏈DNA，起引導(dǎo)作用的sgRNA和切開雙鏈作用的Cas9蛋白[84-85]。

在Cas9/sgRNA/DNA復(fù)合體中，組分雙鏈DNA中必須含有PAM序列，這段短的序列緊挨著sgRNA識(shí)別序列，對(duì)Cas9的結(jié)合與有效切割起著重要作用。比如，最常用的來(lái)源于釀膿鏈球菌SpCas9的PAM是NGG[74]。第2個(gè)組分sgRNA實(shí)際上是人工改造過(guò)的crRNA，即將天然狀態(tài)下的crRNA和tracrRNA通過(guò)一段接頭連成了1個(gè)RNA，叫做sgRNA (Single guide RNA)，具有同樣的活性功能[74]。sgRNA可分為3個(gè)部分，第1個(gè)部分是20 nt左右的序列與靶標(biāo)DNA互補(bǔ)配對(duì)；第2個(gè)部分是repeat-antirepeat序列，這段序列本身是tracrRNA互補(bǔ)結(jié)合crRNA的部分，同時(shí)一部分也對(duì)Cas9的活性發(fā)揮作用；第3個(gè)部分是3個(gè)loop結(jié)構(gòu)，這段序列對(duì)于sgRNA與Cas9的結(jié)合非常關(guān)鍵。一部分研究顯示去掉第3個(gè)loop在體外也能很好地發(fā)揮活性[74]，但有些研究顯示完整的sgRNA在體內(nèi)的活性更高[86]。Cas9蛋白及其與DNA和sgRNA組成的復(fù)合體都已解析了晶體結(jié)構(gòu)[83-84]。從整體看，Cas9由內(nèi)切酶部分(NUC) 和α-螺旋識(shí)別部分(REC) 組成。其中，NUC包含HNH內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域、RuvC-like內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域、PAM相互作用結(jié)構(gòu)域(PI) 和1個(gè)進(jìn)化上趨異的楔形結(jié)構(gòu)域(WED)。RuvC和HNH結(jié)構(gòu)域分別切割雙鏈DNA中的一條鏈；PI結(jié)構(gòu)域與DNA上的PAM序列通過(guò)堿基的相互作用，對(duì)Cas9的特異性起到非常重要的作用。WED結(jié)構(gòu)域識(shí)別sgRNA骨架，不同來(lái)源的Cas9的WED差異大，同時(shí)它與PAM序列的骨架也有相互作用。螺旋REC部分不同的Cas9差異較大，它包含負(fù)責(zé)識(shí)別sgRNA和靶標(biāo)DNA雜合體的區(qū)域，同時(shí)也特異性識(shí)別sgRNA的骨架。另外，生化實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)研究也表明，Cas9作用于DNA并切割的過(guò)程中，構(gòu)象發(fā)生了一系列的變化。

3.1.3Cas9的應(yīng)用

Cas9介導(dǎo)的基因組編輯需要兩個(gè)步驟：DNA的切割和DNA的修復(fù)。sgRNA引導(dǎo)Cas9與特定的DNA結(jié)合，并切割引起DNA雙鏈的斷裂(DSB)[80]。雙鏈斷裂后，主要會(huì)引發(fā)體內(nèi)兩套修復(fù)系統(tǒng)的修復(fù)，一種是錯(cuò)誤傾向的非同源末端連接修復(fù)(NHEJ)，另一種是精確的同源重組修復(fù)(HR)。當(dāng)然也有研究表明，有些情況下存在MMEJ (Microhomology-mediated end joining) 的修復(fù)方式[87]。NHEJ修復(fù)方式存在于真核細(xì)胞中，少數(shù)原核細(xì)胞有不同于真核的較簡(jiǎn)單的NHEJ。NHEJ會(huì)在雙鏈斷裂的位置附近引起隨機(jī)的插入或缺失突變，會(huì)導(dǎo)致基因的敲出(例如引起移碼突變或關(guān)鍵位置編碼蛋白的變化)。HR的修復(fù)方式需要加入一段供體DNA作為模板，利用同源重組原理，進(jìn)行精確的修復(fù)。這種修復(fù)方式可以進(jìn)行基因的敲出、突變、插入或者基因的修正。值得一提的是，雖然大多數(shù)原核生物(包括大腸桿菌) 沒有NHEJ系統(tǒng)，但是可以通過(guò)利用Cas9切割后，額外加入重組的模板序列，這樣的做法可以提高原核生物中基因編輯的效率和成功率。

基于Cas9的基因編輯技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，例如對(duì)特定基因的研究，疾病模型的建立，以及遺傳和感染性疾病治療的研究[80,88]。通過(guò)引入多個(gè)sgRNA，Cas9可以同時(shí)切割多個(gè)位點(diǎn)，因而可以應(yīng)用于大規(guī)模的染色體重排[89]。

3.1.4 Cpf1的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用

2013年開始，通過(guò)生物信息學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)了另外一種Class 2類型的CRISPR系統(tǒng)，這種假定的type V的系統(tǒng)包含1個(gè)約1 300個(gè)氨基酸的大蛋白，被稱為Cpf1[90]。2015年，張鋒實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，Cpf1與Cas9一樣都是RNA介導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶，但在許多特性上又不同于Cas9蛋白[76]。首先，Cpf1只需要crRNA即可引導(dǎo)切割，而不需要tracrRNA；它識(shí)別的PAM是富含T的序列。另外，Cpf1切割雙鏈DNA后，留下1個(gè)5′突出的粘性末端。張鋒團(tuán)隊(duì)測(cè)試了16個(gè)Cpf1家族的蛋白，鑒定了來(lái)源于氨基酸球菌屬和毛螺菌屬的2個(gè)Cpf1能在人類細(xì)胞中發(fā)揮切割活性[76]。

最近，有研究證明Cpf1的體內(nèi)脫靶率遠(yuǎn)低于Cas9[77-78]，這對(duì)研究應(yīng)用和臨床應(yīng)用具有巨大的潛力。此外，Cpf1又有不同于Cas9的特性，比如切割成粘性末端[76]，同時(shí)具有切割DNA和RNA的能力等[91]，可以改造成其他有用工具的潛力。

3.1.5有待改進(jìn)問題

盡管CRISPR/Cas9的研究在近些年進(jìn)展飛快，而且在研究和醫(yī)療的應(yīng)用上具有巨大潛力，但有3個(gè)方面還有待改進(jìn)，包括提高特異性、效率以及時(shí)空控制[92]。

特異性：常用的SpCas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)非常明顯，因?yàn)榘袠?biāo)序列的長(zhǎng)度是20 bp加上3 bp的PAM序列，基因組上其他位置存在相似的序列就有可能也發(fā)生切割[93-94]。目前已經(jīng)有不少策略來(lái)降低脫靶的可能，比如：優(yōu)化sgRNA的設(shè)計(jì)，從序列信息上選擇與基因組上其他位置相似度低的序列；運(yùn)用一對(duì)nCas9 (nickase Cas9) 或者一對(duì)dCas9-FokI核酸酶來(lái)切割[95-96]；縮短sgRNA的長(zhǎng)度(17?18 bp) 或者在sgRNA的5′端加2個(gè)不配對(duì)的G[97-98]；或者降低Cas9-sgRNA復(fù)合體的濃度或者降低在細(xì)胞內(nèi)的活性時(shí)間；另外，通過(guò)突變Cas9的幾個(gè)位點(diǎn)，使得Cas9蛋白降低對(duì)非完全匹配序列的親和力[99]。雖然這些策略在一定程度上大大提高了特異性，但通常以降低效率為代價(jià)。不僅如此，如果將來(lái)用于醫(yī)療領(lǐng)域，任何一點(diǎn)點(diǎn)的脫靶都可能帶來(lái)意想不到的后果[100]。

效率：另一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是提高精確切割的效率，雖然目前已經(jīng)有不少基于實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析得到的不同sgRNA的效率，但是仍然沒有找到非常明確的規(guī)律[101]。另外，為了進(jìn)行精確的基因組編輯，需要提高同源重組修復(fù)的效率，且同時(shí)要降低NHEJ引發(fā)的錯(cuò)誤修復(fù)。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，科學(xué)家開發(fā)出了一些調(diào)節(jié)HDR與NHEJ比率的策略，包括添加調(diào)節(jié)DNA修復(fù)的小分子物質(zhì)，同步細(xì)胞周期，或優(yōu)化轉(zhuǎn)染時(shí)間和方法等[102-104]。但是，HDR的效率相對(duì)來(lái)說(shuō)仍然較低，而且不同細(xì)胞株系間差異非常大，提高HDR效率仍有很大的空間。

時(shí)空控制：如果嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卣{(diào)控Cas9的表達(dá)和活性很可能可以降低Cas9的脫靶效應(yīng)，這也是將來(lái)應(yīng)用于臨床的前提條件。可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄時(shí)或轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，結(jié)合化學(xué)或光誘導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)精確控制Cas9的表達(dá)與活性[105]。在轉(zhuǎn)錄水平，可以通過(guò)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子在細(xì)胞或小鼠中，控制Cas9或nCas9的表達(dá)，雖然這些啟動(dòng)子在許多類型的細(xì)胞中存在滲漏表達(dá)的情況[106]。在轉(zhuǎn)錄后的水平，Davis等構(gòu)建了內(nèi)含肽-Cas9融合蛋白，在滲透性的配體存在下融合蛋白可以產(chǎn)出有活性的Cas9[107]。這個(gè)系統(tǒng)中，化學(xué)響應(yīng)的內(nèi)含肽插入到Cas9中來(lái)干擾活性。除了化學(xué)添加，通過(guò)光進(jìn)行調(diào)節(jié)Cas9的活性，不僅可以實(shí)現(xiàn)快速調(diào)節(jié)，而且可以即時(shí)開啟和關(guān)閉Cas9的活性。這個(gè)光誘導(dǎo)系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)得益于Cas9結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)部分(DNA識(shí)別區(qū)和內(nèi)切酶活性區(qū)) 可以將它們分開，然后分別融合pMag和nMag，在470 nm藍(lán)光的誘導(dǎo)下，Cas9蛋白的兩個(gè)部分重新結(jié)合，從而又發(fā)揮Cas9的活性，一旦移除光，Cas9的兩個(gè)部分分開而失去活性[108]。

目前，時(shí)空控制的這些還是探索性階段，還有很多發(fā)展空間。另外，除了Cas9蛋白的控制，sgRNA也需要調(diào)節(jié)和控制。

3.2 其他基因組編輯酶

由于CRISPR/Cas系統(tǒng)的簡(jiǎn)便高效，才發(fā)展起來(lái)的ZFN和TALEN技術(shù)似乎正逐漸被淘汰。當(dāng)然，還有一些科學(xué)家，也在尋找不同于CRISRP系統(tǒng)的新型基因組編輯技術(shù)。

最近，韓春雨團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了來(lái)源于格氏嗜鹽堿桿菌的Argonaute蛋白可以利用磷酸化的ssDNA引導(dǎo)切割特定的雙鏈DNA，并且能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮活性，從而與CRISPR一樣，可以進(jìn)行基因組編輯操作[109]。從已發(fā)表的結(jié)果來(lái)看，在一些方面可能比Cas9更有優(yōu)勢(shì)。比如，不需要PAM序列，24 nt的靶向序列，突變3個(gè)堿基就無(wú)法切割，這可能比Cas9的脫靶效應(yīng)更低(由于很多情況下Cas9配對(duì)17 nt仍能切割)。然而，該技術(shù)目前正面臨著是否可以被重復(fù)的困擾。

南京大學(xué)團(tuán)隊(duì)，最近開發(fā)了一種由結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的內(nèi)切酶FEN1 (Flap endonuclease-1) 基因組編輯系統(tǒng)[110]。FEN1由識(shí)別3′flap結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域FokⅠ融合而成。向?qū)NA (gDNA) 與靶標(biāo)序列形成的3′flap結(jié)構(gòu)，從而引導(dǎo)特異性的切割。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不受序列的限制。

隨著研究的不斷進(jìn)步，相信還會(huì)有越來(lái)越多的新技術(shù)被不斷開發(fā)出來(lái)。當(dāng)然，這些新技術(shù)能不能替代CRISPR技術(shù)在基因組編輯方面的應(yīng)用，還需要更多的檢驗(yàn)。

3.3 高通量基因組工程

高通量基因組工程的策略與“自下而上”的從頭合成相反，其通過(guò)對(duì)宿主原有的基因組進(jìn)行大規(guī)模改造來(lái)實(shí)現(xiàn)目的。比如，近期在大腸桿菌中開發(fā)了多重自動(dòng)基因組改造MAGE (Multiplex automated genome engineering)[111]，“coselection” MAGE (CoS-MAGE)[112]和接合組裝基因組工程CAGE (Conjugative assembly genome engineering)[113]等，都屬于基因組規(guī)模的快速靶向工程化改造技術(shù)。MAGE方法利用短的合成的單鏈DNA寡核苷酸文庫(kù)，靶向到基因組中[111]。MAGE的方法對(duì)于改變小于4 bp的大腸桿菌DNA序列非常有效，但是對(duì)于超過(guò)20 bp的突變效率則非常低(<2%)。CoS-MAGE用了一個(gè)共篩選標(biāo)記，增加了寡核苷酸加入的效率[112]。CAGE的方法可以在不影響大腸桿菌生長(zhǎng)狀態(tài)的情況下，將其密碼子序列替換。通過(guò)大規(guī)模將TAG終止密碼子替換成TAA，可以將TAG這個(gè)密碼子引入非天然的氨基酸[113]。

除了TAG終止密碼子的替換，用MAGE、CAGE和CoS-MAGE方法也可以取代編碼基因中的密碼子。例如，Church團(tuán)隊(duì)成功地去除了大腸桿菌中42個(gè)高表達(dá)必需基因中的13個(gè)稀有密碼子，證明了在全基因組范圍內(nèi)利用該方法替換編碼基因的密碼子是可行的[114]。除了大腸桿菌的高通量基因組工程，在真核細(xì)胞釀酒酵母中也用了MAGE類似的方法，稱為YOGE (Yeast oligo-mediated genome engineering)[115]。

4 總結(jié)與展望

合成生物學(xué)經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展，我們看到了很多突破性進(jìn)展。綜上，合成生物學(xué)仍然處于初期階段，這個(gè)類似于20世紀(jì)60年代的計(jì)算機(jī)科學(xué)，可能到很多年以后，人們才能體會(huì)到合成生物學(xué)對(duì)人類生活的巨大改變作用。

在合成生物學(xué)建立初期，它的一個(gè)特點(diǎn)是標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化的好處在于：1) 便于提取與應(yīng)用生物學(xué)元件；2) 便于定性、定量檢測(cè)元件的活力/功能；3) 便于開發(fā)與簡(jiǎn)化工程化應(yīng)用[116]。就像組裝計(jì)算機(jī)一樣，每個(gè)元件都是標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)、開發(fā)。例如，Zhao等近期就標(biāo)準(zhǔn)化在天然產(chǎn)物合成生物學(xué)中的重要性進(jìn)行了綜述[117]。在這種背景下，標(biāo)準(zhǔn)化的拼接技術(shù)也孕育而生[10]。除了前文介紹應(yīng)用較廣的BioBrick等，其他標(biāo)準(zhǔn)化拼接方法的建立，如MoClo (Modular cloning)系統(tǒng)[118]、GoldenBraid[17]、MODAL (Modular overlap-directed assembly with linkers)[119]和PaperClip[120]等，其目的都是方便或簡(jiǎn)化組裝流程，并幫助不同研究組間交換模塊化的DNA片段。但是，隨著更簡(jiǎn)便拼接技術(shù)的發(fā)展，以及從頭合成DNA價(jià)格的逐漸下降，傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化拼接方法，比如BioBrick等應(yīng)用率正逐步下降。Endy等在2013年調(diào)查了合成生物學(xué)中使能技術(shù)應(yīng)用情況，在拼接技術(shù)應(yīng)用上，過(guò)去應(yīng)用較多的是BioBrick、BglBrick和Gateway等標(biāo)準(zhǔn)化的拼接方法，而近期Gibson拼接和從頭合成已經(jīng)趕超[121]。相信就今后的發(fā)展趨勢(shì)來(lái)說(shuō)，從頭合成DNA將占據(jù)更重要的地位，可能就如同工程學(xué)中如今興起的3D打印技術(shù)。

CRISPR技術(shù)在2012年鑒定了Cas9的體外切割特性[74-75]。近幾年，已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，并且已有用于臨床實(shí)驗(yàn)的計(jì)劃。在原核生物，Cas9和同源重組的結(jié)合應(yīng)用，提高了傳統(tǒng)的基因敲除、替換和插入等的效率[122]，甚至是100 kb以上大片段替換[123]。除了用于基因組編輯，Cas9也被改造成能識(shí)別并結(jié)合特定DNA序列但失去切割活性的dCas9 (dead Cas9)，經(jīng)過(guò)融合特定功能的蛋白，可用于DNA定位[124]、基因調(diào)控[125-126]和特異位點(diǎn)修飾等[92,127-128]。

合成生物學(xué)將對(duì)化學(xué)品的生產(chǎn)、人類的健康和環(huán)境等領(lǐng)域具有廣闊的前景。而合成生物學(xué)的使能技術(shù)的發(fā)展，必將加速合成生物學(xué)的發(fā)展。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

趙國(guó)屏 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所研究員，博士生導(dǎo)師，中國(guó)科學(xué)院院士。主持過(guò)若干微生物基因組和功能基因組研究，完成對(duì)重要致病菌——問號(hào)鉤端螺旋體的全基因組測(cè)序和注釋，鑒定過(guò)若干關(guān)鍵代謝途徑和基因功能，為深入研究致病機(jī)理提供新的思路。同時(shí)，完成了SARS分子流行病學(xué)和SARS冠狀病毒進(jìn)化研究，為認(rèn)識(shí)該病毒的動(dòng)物源性及其從動(dòng)物間傳播到人間傳播過(guò)程中基因組、特別是關(guān)鍵基因的變異規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。目前，主要聚焦于合成生物學(xué)研究方向，曾主持合成生物學(xué)973項(xiàng)目“新功能人造生物器件的構(gòu)建及集成”。

王金 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所副研究員，碩士生導(dǎo)師。主要研究方向是放線菌氮代謝調(diào)控的分子機(jī)制以及合成生物學(xué)使能技術(shù)的開發(fā)。在代謝調(diào)控方面，系統(tǒng)鑒定了放線菌氮代謝全局調(diào)控蛋白GlnR的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并初步闡釋了“硝酸鹽效應(yīng)”的分子機(jī)制——硝酸鹽同時(shí)增強(qiáng)利福霉素生物合成基因簇的表達(dá)和促進(jìn)其前體的大量供給，從而大幅度提高利福霉素的產(chǎn)量。在合成生物學(xué)使能技術(shù)方面，成功開發(fā)了多項(xiàng)DNA體外拼接技術(shù)和拼接標(biāo)準(zhǔn)。

Enabling technologies in synthetic biology——DNA synthesis, assembly and editing

Shiyuan Li1,2, Guoping Zhao1, and Jin Wang1

1 Key Laboratory of Synthetic Biology, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Synthetic biology is an emerging discipline, which aims at creating artificial lives or remolding the present organisms to generate new features. To achieve these goals, synthetic biologists need to design and synthesize new genes, pathways, modules or even whole genomes. As these enabling technologies (gene synthesis, DNA assembly and genome editing) are very important for the progress of synthetic biology, we will focus on the development of these technologies in this review.

synthetic biology, enabling technology, DNA assembly, gene synthesis, genome editing

November 1, 2016; Accepted:December 8, 2016

Jin Wang. Tel: +86-21-54971125; Fax: +86-21-54971127; E-mail: jinwang@sibs.ac.cn

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB721102), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31421061, 31430004, 31300031), the Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. XDB19040200).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (No. 2012CB721102)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31421061, 31430004, 31300031)，中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(No. XDB19040200) 資助。

2016-12-27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20161227.1439.002.html