合成生物學在環(huán)境修復中的應用

唐鴻志，王偉偉，張莉鴿，黃玲，陸歆毓，許平

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合成生物學在環(huán)境修復中的應用

唐鴻志，王偉偉，張莉鴿，黃玲，陸歆毓，許平

上海交通大學生命科學技術學院微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240

唐鴻志, 王偉偉, 張莉鴿, 等. 合成生物學在環(huán)境修復中的應用. 生物工程學報, 2017, 33(3): 506–515.Tang HZ, Wang WW, Zhang LG, et al.Application of synthetic biology in environmental remediation. Chin J Biotech, 2017, 33(3): 506–515.

環(huán)境問題是21世紀人類面臨的最嚴重的挑戰(zhàn)。隨著現(xiàn)代工農業(yè)飛速發(fā)展，生態(tài)環(huán)境日益惡化，難降解污染物如新興污染物逐漸顯現(xiàn)，已成為制約社會經濟可持續(xù)發(fā)展的重要因素。微生物具有強大的環(huán)境修復能力，但是其進化速度遠不及新興污染物出現(xiàn)的速度，亟需應用合成生物學的技術來解決這一難題。在充分認識難降解有機污染物微生物降解 (途徑) 特性的基礎上，利用我國豐富的微生物與基因資源，運用合成生物學的手段，定向設計和改造現(xiàn)有降解菌株，構建能夠降解一種或多種污染物的工程菌株；同時針對復合型污染，如廢水等，在建立典型有機污染物代謝、調控和抗逆相關基因元件的模塊庫基礎上，引入人工菌群等策略，對生物系統(tǒng)進行理性設計和組裝，構建典型環(huán)境污染物的高效降解菌群，可有效促進我國新興污染物微生物分解代謝的研究，為環(huán)境修復的工程應用提供技術支持。

環(huán)境修復，合成生物學，新興污染物，分解代謝

環(huán)境保護與污染防治，是實現(xiàn)國家經濟和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的重要前提。環(huán)境廢棄物中所含的難降解有機污染物嚴重污染大氣、水和土壤。目前，在環(huán)境各介質中檢測到抗生素、內分泌干擾物和阻燃劑等新興難降解有機污染物，這些污染物對生物和人體具有潛在的危害，并且難以降解。高效降解環(huán)境中有害污染物的微生物制品研究，能夠為環(huán)境保護與污染防治提供技術支撐。利用我國豐富的微生物與基因資源，運用合成生物學的手段，有目的地重新設計和改造現(xiàn)有降解菌株，構建新的能夠降解某一特定污染物或同時降解多個污染物的菌株。針對復合型污染物，如污染水體，進行微生物系統(tǒng)的理性設計和組裝，合理構建具有抗逆特性的針對環(huán)境難降解有機污染物的高效降解菌群，為環(huán)境修復提供理論與技術保障。

1 難降解有機污染物現(xiàn)狀

難降解有機污染物是指在自然環(huán)境條件下持久穩(wěn)定存在的、幾乎不能被生物降解的一類有害物質，其中多數(shù)為人工合成的化學物質。難降解有機污染物具有持久性、生物富集性、長距離遷移能力及生物有害性等特點，其中新興污染物是近年來才被意識到或者尚未意識到其危害的物質。新興污染物有可能是新物質，也可能是近年來才發(fā)現(xiàn)其危害或具有潛在危害的物質，其數(shù)目種類繁多，性質多樣，幾乎無處不在。常見的分類包括：藥品 (主要以抗生素為主)、洗護用品、增塑劑、阻燃劑以及殺蟲劑等等。

1.1 抗生素污染

抗生素應用廣泛，是一類常見的新興污染物。近些年，不斷有研究報道抗生素在環(huán)境中的殘留及轉歸現(xiàn)狀，抗生素的污染及其產生的一系列生態(tài)效應和對人群健康的影響開始引起人們的廣泛關注。醫(yī)用抗生素和獸用抗生素的濫用情況日益加重，抗生素被機體攝入吸收后，絕大部分以原形通過糞便和尿液排出體外，對土壤和水體等造成污染。研究表明，在我國廣東北江一帶，大環(huán)內酯類抗生素污染最為嚴重，其含量范圍為11.7?114.6 ng/L，表層水中磺胺甲惡唑含量達14.7 ng/L，阿奇霉素達到25.0 ng/L，在沉積物中氧氟沙星達到5.4 ng/g，四環(huán)素的含量也達到3.3 ng/g[1]。這一數(shù)據(jù)顯示，抗生素的污染已經成為環(huán)境中比較嚴重的污染問題。以四環(huán)素類抗生素為例，它是新興污染物Pharmaceutical and personal care products (PPCPs) 中的一種，在畜禽以及水產養(yǎng)殖中應用十分廣泛。在自然條件下，四環(huán)素類抗生素的生態(tài)毒性較強，土壤和水中殘留的四環(huán)素類抗生素和其代謝產物會逐漸破壞土壤以及水的生態(tài)系統(tǒng)，影響動物、植物和微生物的生長活動。多項研究表明，四環(huán)素類抗生素可能通過抑制葉綠體合成酶的活性進而對植物生長產生抑制作用，影響植物發(fā)芽率和根的生長，同時其對藻類抑制作用尤為明顯，進而破壞完整的生物鏈[2]。張樹清等對我國規(guī)?；B(yǎng)殖場畜禽糞便的主要成分進行抽樣分析，結果表明，在畜禽糞便中可以檢測到高含量的四環(huán)素類抗生素殘留，豬糞中土霉素平均質量濃度為9.09 mg/kg，最高可達134.75 mg/kg；四環(huán)素平均質量濃度為5.22 mg/kg，最高可達78.57 mg/kg；金霉素平均質量濃度為3.57 mg/kg，最高可達121.78 mg/kg[3]。Hamscher等也在畜禽糞便中檢測到高含量的四環(huán)素和金霉素，質量濃度分別為4.0、0.1 mg/kg，土壤環(huán)境中四環(huán)素和金霉素的殘留質量濃度分別達到86.2?198.7、4.6?7.3 μg/kg[4]。Aust等研究者也發(fā)現(xiàn)加拿大土壤環(huán)境中四環(huán)素的質量濃度可達到52 μg/kg[5]。綜上，四環(huán)素類抗生素在環(huán)境中的殘留十分嚴重，對環(huán)境造成了潛在威脅。目前抗生素的種類多達幾千種，常用的有數(shù)百種之多。與此同時，新型抗生素層出不窮，不斷推陳出新，對治理抗生素污染提出了更高的要求。

1.2 內分泌干擾物污染

內分泌干擾物是一類典型的新興污染物，又稱環(huán)境激素。歐盟將其定義為一類能夠對正常生物體或其后代內分泌功能產生不利影響的外源物質[6]。這類污染物主要是外源性干擾內分泌系統(tǒng)，通過直接攝入、間接積累等途徑，雖不直接作為有毒物質給人體和動物造成危害，但是在這類污染物質長期刺激作用下，會對動物和人體造成嚴重的生殖能力下降、幼體死亡、行為異常、生殖器障礙、甚至種類滅絕等危害[7-8]。內分泌干擾物種類廣泛，包括70%?80%的農藥 (滴滴涕及其分解產物、六氯苯、六六六、艾氏劑、狄氏劑)、阻燃劑 (六溴環(huán)十二烷、多溴聯(lián)苯醚等)、類固醇雌激素 (17α-乙炔基雌二醇、17β-雌二醇、己烷雌酚等)以及一些有機化合物 (烷基酚 (AP)、烷基酚聚氧乙烯醚 (APE)、雙酚A、鄰苯二甲酸酯 (PAE)、多氯聯(lián)苯類 (PCB) 等)[7]。據(jù)報道，有機氯農藥在禁用20年后，六六六(HCHs)、硫丹、七氯、狄氏劑在魚肉中均有不同程度的檢出，其中六六六的殘留水平最高達到了0.33 mg/kg[9]。類固醇類雌激素在環(huán)境介質中被廣泛檢出，雞蛋中檢出雌二醇、雌酮、雌三醇、睪酮[10]；動物組織中檢出己烯雌酚濃度達到 0.2 ng/g[11]；尿液中檢出4-壬基酚、雙酚、雌二醇和雌酮等[12]。

幾種常見新興污染物質四環(huán)素、金霉素、滴滴涕和多溴聯(lián)苯醚的結構如圖1所示。大多數(shù)新興污染物結構非常復雜，化學性質穩(wěn)定，傳統(tǒng)的物理化學方法降解效率不高，并會導致二次污染。微生物降解環(huán)境污染物具有環(huán)保、高效和價格低廉等優(yōu)點，被認為是最具潛力的降解方法。據(jù)報道，丙二酸檸檬酸桿菌在35 ℃、pH 5.5的條件下，72 h內降解86.1%的四環(huán)素[13]。菌株SW-5、LJ245和LJ302在適宜條件下都能對四環(huán)素達到90%的降解效率[14]。假單胞菌可以完全降解滴滴涕到4-氯苯甲酸[15]。但是隨著科學技術的發(fā)展，新興污染物種類快速增加，目前面臨的主要問題有，現(xiàn)有降解菌不可能對所有新興污染物質具有降解作用；很多新興污染物質目前還不能被任何微生物降解；使用已有降解菌株降解效率低；在極端環(huán)境下降解菌難以實現(xiàn)降解作用等。合成生物學的發(fā)展，為解決這些問題提供了新的思路與技術。

圖1 幾種常見新興污染物結構[7]

2 合成生物學生物修復構想

現(xiàn)代化學工業(yè)的發(fā)展導致新的化合物不斷出現(xiàn)，特別是一些人工合成的自然界原本不存在的化合物，自然存在的微生物尚未依靠自然進化獲得降解它們的能力，許多菌株往往僅具備代謝通路中的一種或幾種催化元件，因此不能將污染物徹底礦化。通過研究細菌中代謝通路的信息，不斷發(fā)現(xiàn)代謝通路中與代謝產物相關的重要元件，如降解元件、轉運元件、趨化元件和抗逆元件等，使我們可以利用合成生物學的技術，有選擇性地開發(fā)和利用這些重要的生物元件，將不同來源微生物的元件進行設計和組合并構建具備全新代謝網絡的工程菌，從而實現(xiàn)環(huán)境新興污染物的徹底礦化，以達到環(huán)境修復的目的。

2.1 生物修復關鍵基因元器件挖掘

2.1.1 脫鹵酶元件

脫鹵酶元件在含鹵污染物礦化過程中起到脫鹵作用。許多新興污染物含有鹵素原子，去除鹵素原子既可以降低該底物生物降解的難度，又可以避免有毒中間產物的產生。

如有機氯農藥 (Organochlorine pesticides，OCPs)，在五氯酚降解菌鞘氨醇單胞菌ATCC39723[16-17]的基礎上，研究者成功導入細胞色素P-450cam突變基因，使降解菌具備將六氯苯酚轉化為五氯苯酚的能力，進一步通過編碼的單加氧酶反應生成四氯對苯二酚，后經過基因逐步脫氯，實現(xiàn)六氯苯酚的完全礦化[18]。Nagata等發(fā)現(xiàn)，少動鞘氨醇單胞菌UT26的水解脫鹵酶LinB是一種具有廣泛底物特異性的鹵代烷脫鹵酶，作用于以六六六代謝中間產物四氯環(huán)己二烷為代表的底物，使其碳氯鍵水解斷裂，生成烷基-酶中間產物，最終實現(xiàn)對底物的降解[19]。除此以外，從殺菌劑百菌清降解菌株假單胞菌sp. CTN-3中分離出能在厭氧和有氧條件下，不需要輔因子的存在即可以進行水解脫氯反應的水解脫氯酶基因，為含氯新興污染物的完全降解提供了研究基礎[20]。

又如溴代聯(lián)苯醚 (PBDEs)，作為一類在環(huán)境中廣泛存在的污染物，其降解途徑和降解基因一直處于探索階段，有關基因編碼和表達的報道甚少，更多研究集中在其母環(huán)化合物聯(lián)苯醚 (PCBs) 上。隨著對PCBs降解相關的關鍵調控基因和[21-22]的深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)其對PBDEs的降解也發(fā)揮著重要作用。將和基因導入PCBs降解菌-紅球菌中，發(fā)現(xiàn)其能夠使多種多溴聯(lián)苯醚同系物發(fā)生脫溴轉化，基因重組菌可以降解多種高溴代聯(lián)苯醚，而重組菌則傾向于低溴代聯(lián)苯醚如一溴、二溴、三溴代聯(lián)苯醚的脫溴轉化[23]。

2.1.2 氧化酶元件

氧化酶在芳香烴類有機污染物降解途徑中發(fā)揮重要的功能，可以將苯環(huán)羥基化或切割化。苯雙加氧酶將苯氧化成順苯二氫二醇，在維氏假單胞菌1YdBTEX2和1YB2中存在此類苯雙加氧酶相關基因[24]。甲苯單加氧酶可以將甲苯逐步氧化形成苯甲酸，在惡臭假單胞菌mt-2的大質粒pWW0上包含降解甲苯和間二甲苯的單加氧酶編碼基因簇[25]，甲苯雙加氧酶則是將甲苯分解成順甲苯二氫二醇，在菌株F1中存在苯甲酸雙加氧酶編碼基因[26]。萘雙加氧酶同屬一種復合酶，在NCIN9816-4中萘雙加氧酶編碼基因為[27]。聯(lián)苯雙加氧酶由還原酶、氧化還原蛋白和鐵硫蛋白組成，組成基因包括4個，在菌株sp. LB400中包含編碼基因，可以催化聯(lián)苯進行雙加氧反應[28]。二苯并呋喃雙加氧酶可催化二苯并呋喃進行側面雙加氧，再利用下游基因逐步礦化二苯并呋喃，其中地桿菌屬sp. DBF63包含二苯并呋喃雙加氧酶編碼基因，是催化二苯并呋喃降解的第一步關鍵基因[29]。

2.1.3 轉運蛋白元件

目前，從已有研究報道菌株谷氨酸棒狀桿菌中發(fā)現(xiàn)，4-羥基苯甲酸和原兒茶酸的轉運蛋白 (PcaK/NCg1031)、香草酸的轉運蛋白 (VanK/NCg2302) 以及苯甲酸的轉運相關蛋白 (BenK/NCg2325，BenE/NCg2326)，這些轉運蛋白在生物修復過程中起著十分重要的作用[30]。龍膽酸轉運蛋白GenK在ATCC13032代謝龍膽酸過程中發(fā)揮關鍵作用[31]。

2.1.4 趨化蛋白元件

趨化蛋白元件的發(fā)掘能夠給污染物降解工程菌株構建提供一定的參考作用。芳香烴化合物感應的甲基趨化受體蛋白的相關研究發(fā)現(xiàn)叢毛單胞菌CNB-1中MCP2201蛋白可以感應TCA循環(huán)中產生的芳香族化合物。另外，發(fā)現(xiàn)甲基趨化受體MCP2901可以與芳香族化合物結合，通過檸檬酸循環(huán)觸發(fā)趨化反應，還可以啟動其下游趨化信號的傳導[32-33]。在海洋微生物食堿菌屬中發(fā)現(xiàn)趨化蛋白CheW2，能夠被長鏈烷烴誘導并傳遞信號給下游途徑，進而激活下游的趨化信號[34]。

2.2 抗逆基因元器件挖掘

在過去的幾年中，我國微生物學者對環(huán)境中有機污染物的微生物降解機制進行了大量研究，闡明了尼古丁、聯(lián)苯等環(huán)境有毒有害物質的微生物降解途徑及資源化利用的機制[35-36]。但是在實際應用中往往出現(xiàn)高溫、高鹽、過酸、過堿或者高滲的惡劣環(huán)境，對微生物的生存及代謝具有抑制作用。因此，從微生物自然抗逆功能基因出發(fā)，利用離子泵、相似相容性溶質和全局性調控因子等在極端微生物中存在的抗逆機制要素，運用合成生物學手段，構建適配底盤微生物的高效抗逆元件，有目的地重新設計和改造現(xiàn)有降解菌株，對提高微生物在環(huán)境壓力中的耐受性及其在高效處理環(huán)境污染物方面的應用具有重大意義。

2.2.1 離子泵

離子泵是一類能夠驅使特定的離子逆電化學梯度穿過質膜的蛋白質。細胞內離子泵主要包括鈉鉀泵和質子泵。若能利用合成生物學方法將這些膜離子泵相關的基因整合到底盤微生物中，對于環(huán)境污染修復，尤其是在利用嗜鹽、嗜酸和嗜堿微生物抗逆基因構建降解環(huán)境污染物的工程菌株方面具有廣闊的應用前景。最典型的一類鈉離子泵是Na+/H+逆向轉運蛋白，它可以偶聯(lián)氫質子輸入系統(tǒng)，泵出細胞內的鈉離子，從而維持細胞內的離子濃度平衡。Yang等克隆了鹽芽孢桿菌D-8T中染色體DNA上編碼Na+/H+轉運蛋白的基因，并在大腸桿菌KNabc中進行異源表達，使得菌體能夠在0.2 mol/L NaCl或者5 mmol/L LiCl中生存[37]。K+轉運系統(tǒng)中的基本元件多為單向轉運蛋白，在外界鹽濃度較高時，通過在胞內積累K+實現(xiàn)菌體內外滲透壓平衡。嗜鹽單胞菌中的Trk系統(tǒng)和嗜鹽古菌中的Kdp系統(tǒng)，是兩種主要的K+轉運系統(tǒng)[38-39]。Greie等的研究指出，嗜鹽古菌中的基因簇可在環(huán)境K+濃度變化時由下游基因3誘導表達，調節(jié)K+轉運，使得細胞內外環(huán)境達到平衡狀態(tài)[39]。

2.2.2 相似相容性溶質分泌

相似相容性溶質如甜菜堿、氨基酸、糖、多元醇等可以在高滲條件下積累到較高濃度，提高細胞內水活度，在低滲條件下分解或者被排出到周圍環(huán)境中，使細胞內外滲透壓達到平衡，維持細胞正常的代謝活動。Yu等在大腸桿菌中異源表達來自于沙冬青屬的甜菜堿醛脫氫酶基因，使得大腸桿菌在700 mmol/L NaCl和55 ℃下表現(xiàn)出了良好的耐鹽及耐熱性能[40]。玫瑰鹽水球菌和西班牙鹽水球菌中存在的脯氨酸是主要的滲透平衡作用調節(jié)因子[41]。在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中也存在著由蛋白PutP、ProP和ProU構成的既相互獨立又可協(xié)同作用的脯氨酸轉運系統(tǒng)[42]。除此之外，分別擴增枯草芽孢桿菌中的和基因，構建融合基因，在大腸桿菌JM83中進行表達，能顯著提高菌體內脯氨酸的積累，增強了大腸桿菌對高滲環(huán)境的耐受性能[43]。

2.2.3 全局性調控因子

能夠增強微生物抗逆性能的全局性調控因子主要有sRNA以及熱激蛋白 (HSP) 等。sRNA是存在于原核生物中的一種能夠通過與mRNA結合進而影響其穩(wěn)定性或者翻譯過程，并最終調控靶基因表達的非編碼RNA。熱激蛋白是一類能夠在高溫下與胞內變性的蛋白質結合，修復折疊錯誤的蛋白，并維持其空間構象和功能的分子伴侶。Negrete等報道，在pH 6.0的弱酸性條件下，將基因在大腸桿菌K-12 1655中進行組成型表達，可以激活胞內的賴氨酸脫羧酶系統(tǒng) (LDS) 及等耐酸基因的表達，使得菌體生長過程中產生的乙酸含量從8 g/L降低至4 g/L，減輕了對大腸桿菌生長的抑制作用，促進了菌體的生長[44]。孫翔英等以啟動子T7和基因作為調控元件，組裝并構建了誘導型耐熱元器件和組成型耐熱元器件，有效提高了大腸桿菌的耐熱性能和有機溶劑耐受性[45]。Fiocco等在乳桿菌屬WCFS1中過表達18.5、18.55以及19.3這3種熱激蛋白的基因，降低了37 ℃或者40 ℃高溫以及12 ℃低溫環(huán)境對菌體生長速率的影響，同時提高了菌體對丁醇和乙醇等有機溶劑的耐受性[46]。除此之外，傳統(tǒng)熱激基因如、、、等也是微生物在抵抗環(huán)境變化中發(fā)揮重要功能的基因元件[47-49]。

3 展望

為實現(xiàn)環(huán)境中難降解有機污染物的有效降解，應用合成生物學技術，開發(fā)新興污染物質降解菌株，已成為環(huán)境微生物領域研究前沿。不同于傳統(tǒng)的從環(huán)境中篩選能夠代謝特定污染物質的天然微生物為重點的環(huán)境生物技術，以合成生物學技術為基礎的生物學技術研發(fā)重點是在細胞中插入天然或者非天然功能元器件、構建自然界中原不存在的合成代謝途徑，形成全新的定向降解的生物細胞工廠。為此研究者可通過合成生物學技術的應用，定向改造微生物代謝路徑，使不具降解性能的菌株具有降解某種污染物的能力，提高已報道降解菌株降解效率，增強新興污染物降解菌株環(huán)境適應性能，使其能夠在高鹽、酸堿、高滲透壓條件下保持降解活性，將有利于新興污染物的環(huán)境修復。

研究者也可通過恒化器培養(yǎng)的方法，利用微生物的適應性進化，經過人為施加選擇壓力，使菌株定向進化，進而篩選得到適應性菌群中的優(yōu)良菌株。在多種微生物參與的反應器中，研究者可以利用合成生物學技術，人工構建微生物群落生態(tài)關系，建立不同微生物間群體感應，使它們能夠進行細胞間交流并通過相關基因表達調控來協(xié)調群體行為，以使微生物能夠在更寬泛的生長環(huán)境中長期健康生存并維持平穩(wěn)的代謝狀態(tài)，從而在環(huán)境修復領域發(fā)揮不可替代的作用。

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(本文責編 陳宏宇)

唐鴻志 上海交通大學生命科學技術學院/微生物代謝國家重點實驗室教授、博士生導師。2012年12月–2013年12月美國麻省理工學院訪問學者。曾獲得國家自然基金委“優(yōu)秀青年基金”、上海市“青年科技啟明星”、上海市“晨光學者”、上海交大“晨星學者”A類、首屆唐仲英青年教師獎。2013年獲得上海市“明治乳業(yè)生命科學獎”。主持多項國家如科技部、自然基金委、教育部、上海市等項目。中國微生物學會環(huán)境微生物專業(yè)委員會秘書 (委員)、普通微生物專業(yè)委員會委員。

Application of synthetic biology in environmental remediation

Hongzhi Tang, Weiwei Wang, Lige Zhang, Ling Huang, Xinyu Lu, and Ping Xu

School of Life Sciences & Biotechnology and State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

Environmental problems are the most serious challenges in the 21st century. With the rapid development of modern industry and agriculture, ecological and environmental deterioration have become the most important factors to restrict the sustainable development of social economy. Microbial cells have strong ability for environmental remediation, but their evolution speed is slower than the speed of emerging pollutants. Therefore, the treatment using the synthetic biology is in urgent need. Full understanding of the microbial degradation characteristics (pathways) of refractory organic pollutants with the help of abundant microbial and gene resources in China is important. Using synthetic biology to redesign and transform the existing degrading strain will be used to degrade particular organic pollutants or multiple organic pollutants. For the complex pollutants, such as wastewater, based on the establishment of metabolic or regulation or resistance related gene modules of typical organic pollutants, artificial flora could be designed to solve the complex pollutants. The rational design and construction of engineering bacteria for typical environmental organic pollutants can effectively promote microbial catabolism of emerging contaminants, providing technical support for environmental remediation in China.

environmental remediation, synthetic biology, emerging pollutants, catabolism

November 1, 2016; Accepted: December 15, 2016

Hongzhi Tang. Tel: +86-21-34204066; Fax: +86-21-34206723; E-mail: tanghongzhi@sjtu.edu.cn

Supported by:National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (No. 31422004), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2013CB733901), Cryrus Tang Young Scholars Foundation.

國家優(yōu)秀青年基金(No. 31422004)，國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃) (No. 2013CB733901)，仲英青年學者資助。