無細(xì)胞蛋白合成體系實現(xiàn)胰島素原可溶性表達(dá)

胡元，張宇琛，徐焱成，劉天罡

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無細(xì)胞蛋白合成體系實現(xiàn)胰島素原可溶性表達(dá)

胡元1，張宇琛2，徐焱成1，劉天罡2

1 武漢大學(xué)中南醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北武漢 430071 2 武漢大學(xué)藥學(xué)院組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點實驗室，湖北武漢 430071

胡元, 張宇琛, 徐焱成, 等. 無細(xì)胞蛋白合成體系實現(xiàn)胰島素原可溶性表達(dá). 生物工程學(xué)報, 2017, 33(3): 467–477.Hu Y, Zhang YC, Xu YC, et al. Synthesis of soluble proinsulin in a cell-free protein synthesis system. Chin J Biotech, 2017, 33(3): 467–477.

胰島素原 (Proinsulin，Pins) 是胰島素的合成前體。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，其一般以包涵體的形式存在，需要經(jīng)過變性復(fù)性等后續(xù)加工過程才能得到有活性的胰島素。而無細(xì)胞蛋白合成體系 (Cell-free protein synthesis，CFPS) 作為一種新型體外蛋白合成手段，突破了細(xì)胞的生理限制，已成功應(yīng)用于多種重組蛋白藥物的生產(chǎn)。為了探索胰島素合成的新方法以滿足其在新型給藥途徑研發(fā)中的需求，本研究運用CFPS體系進(jìn)行胰島素原的可溶性表達(dá)。通過將胰島素原與熒光蛋白進(jìn)行融合來增加其可溶性，成功在CFPS體系中表達(dá)了胰島素原融合蛋白。最后使用Western blotting對融合紅色熒光蛋白的胰島素原 (Pins-mCherry) 進(jìn)行鑒定，利用酶標(biāo)儀對融合綠色熒光蛋白的胰島素原 (Pins-eGFP) 在上清中的表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明Pins-eGFP部分可溶，其表達(dá)量為 (12.28±3.45) μg/mL。本研究首次實現(xiàn)了融合胰島素原在CFPS系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)，其融合熒光蛋白的策略顯著提升了胰島素原的可溶性，該結(jié)果為探究胰島素合成新方法及開發(fā)基于CFPS系統(tǒng)的新型胰島素給藥途徑奠定了基礎(chǔ)。

無細(xì)胞蛋白合成體系，胰島素原，融合熒光蛋白，可溶性，蛋白折疊

糖尿病是由胰島素分泌缺乏或胰島素抵抗引起的以血糖水平升高為特點的代謝性疾病。近一個世紀(jì)以來，胰島素被廣泛應(yīng)用于治療糖尿病，拯救了無數(shù)糖尿病患者的生命[1-2]。胰島素分子量為5 808 Da，由A、B兩條氨基酸鏈組成，A鏈有21個氨基酸，B鏈有30個氨基酸。其中A7與B7、A20與B19四個半胱氨酸中的巰基形成2個二硫鍵，此外A鏈中A6與A11之間也存在1個二硫鍵[3]。β細(xì)胞首先合成前體物質(zhì)前胰島素原，之后前胰島素原在蛋白酶作用下切去信號肽，形成胰島素原。然后胰島素原進(jìn)入高爾基體在蛋白酶作用下切去C肽形成有活性的胰島素[4-5]。目前，人們主要通過DNA重組技術(shù)在大腸桿菌或酵母中合成胰島素原，然后加工成有活性的胰島素[6-7]。大腸桿菌系統(tǒng)是一個高效的表達(dá)系統(tǒng)，然而在表達(dá)胰島素原過程中，轉(zhuǎn)錄翻譯速率明顯快于蛋白折疊速率，且缺乏折疊酶及翻譯后修飾，易相互聚集，形成不溶性的包涵體，需要經(jīng)過復(fù)雜的加工過程才能形成有活性的胰島素[8-9]。酵母合成的胰島素原容易積累在胞內(nèi)，不能有效分泌至胞外[10-11]。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中一般采取在大腸桿菌分別表達(dá)胰島素的A、B鏈的策略或者酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)胰島素。

無細(xì)胞蛋白合成體系(CFPS) 利用細(xì)胞抽提物中的酶和蛋白質(zhì)因子，以外源DNA或mRNA為模板，通過補充翻譯所需的底物和能量物質(zhì)，從而實現(xiàn)目標(biāo)蛋白的體外合成。與體內(nèi)表達(dá)體系相比，CFPS不受胞內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響、可調(diào)控性強、對毒性蛋白的耐受力高和產(chǎn)物分離成本低的優(yōu)點可以為解決生物制藥領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵問題提供潛在的新解決方案[12]。近年來已經(jīng)逐漸被應(yīng)用于高通量藥物篩選、大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白藥物、多肽類藥物和腫瘤疫苗等領(lǐng)域中[13-14]。Jewett等創(chuàng)建的簡易細(xì)胞提取物制備方法生產(chǎn)成本低，高效、快速、簡單[15]。最近Collins等通過將CFPS組分制成凍干提取物，制備成便攜式微型藥物合成工廠，成功生產(chǎn)出具有生物活性的抗菌肽，便攜式白喉疫苗，設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白 (Designed ankyrin repeat proteins，DARPins) 以及納米抗體，為疾病的預(yù)防、診斷以及按需隨時取用的個體化精準(zhǔn)治療提供了新的可能[16]。除了上述應(yīng)用之外，關(guān)于CFPS系統(tǒng)能否合成可溶性的胰島素原，是否可以用于胰島素的便攜式生產(chǎn)及糖尿病的個體化治療的探索還少有涉及。有研究利用CFPS系統(tǒng)表達(dá)胰島素原，但所用的連續(xù)性CFPS制備較為復(fù)雜，效率低，并且產(chǎn)物大部分仍以包涵體形式存在[17]。熒光蛋白家族因其受激發(fā)會發(fā)出熒光的特性，被廣泛作為標(biāo)記物運用于生物學(xué)研究當(dāng)中，也可用于構(gòu)建融合蛋白作為標(biāo)記物及增加目的蛋白的可溶性[18-19]。本研究中，為了使CFPS系統(tǒng)可以合成可溶的胰島素原，將熒光蛋白融合至胰島素原的C端，首次實現(xiàn)了融合胰島素原蛋白在CFPS系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)。在CFPS系統(tǒng)成功合成可溶性胰島素原為探究胰島素合成新方法、探索便攜式胰島素給藥方式以及在無細(xì)胞體系中合成成熟的胰島素提供了良好的工作基礎(chǔ)和有用的信息。

1 材料與方法

1.1 材料

BL21 (DE3) 受體菌為本實驗室保存，pET-28a(+)載體購于Novagen公司?？倀RNA，ATP，GTP，CTP，UTP，磷酸烯醇式丙酮酸，20種氨基酸及其他試劑購于Sigma公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

按照胰島素原的基因序列 (GenBank Accession No. NP_000198.1)，設(shè)計引物F1/R1，引物兩端分別引入酶切位點Ⅰ和d Ⅲ，PCR擴增合成的胰島素原基因，擴增后的片段插入到pET28對應(yīng)酶切位點，獲得的重組載體pYH1帶有6×His標(biāo)簽。融合熒光蛋白的胰島素原質(zhì)粒pYH2、pYH3采用Simple Cloning的方法構(gòu)建，以胰島素原表達(dá)質(zhì)粒pYH1為模板，F(xiàn)2/R2為引物進(jìn)行PCR擴增，并分別以熒光蛋白基因片段m/為模板，F(xiàn)3/R3為引物進(jìn)行PCR擴增，引物序列見表1，分別得到融合熒光蛋白的胰島素原表達(dá)質(zhì)粒pYH2和pYH3，熒光蛋白融合在胰島素原的C端。

表1 引物序列

Note: the underlined sequences represent restriction site.

1.3 細(xì)胞提取物的制備

用1 L的2×YTPG培養(yǎng)基 (16 g蛋白胨， 10 g酵母提取物，5 g氯化鈉，7 g K2HPO4，3 g KH2PO4，18 g葡萄糖，pH 7.2) 培養(yǎng)BL21 (DE3)，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至600值為0.6–0.8，加入1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)使菌體表達(dá)足量的T7 RNA聚合酶，培養(yǎng)至600=4時 5 000 r/min離心15 min收集菌體。用緩沖液A (10 mmol/L Trisbase，14 mmol/L醋酸鎂， 60 mmol/L谷氨酸鉀，2 mmol/L DTT，pH 8.2) 洗滌菌體3次，稱細(xì)胞濕重，保存于–80 ℃冰箱。按照1 g菌體濕重/1 mL緩沖液A的比例重懸菌體，超聲破碎，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清分裝后液氮速凍，保存于–80 ℃冰箱中。

1.4 無細(xì)胞體系合成蛋白

CFPS合成反應(yīng)在1.5 mL EP管中進(jìn)行。反應(yīng)體系含有以下成分：1.2 mmol/L ATP，0.86 mmol/L GTP、UTP、CTP；34.0 μg/mL亞葉酸，170.0 μg/mLtRNA混合物，175 mmol/L谷氨酸鉀， 2.7 mmol/L草酸鉀，10 mmol/L谷氨酸銨， 12 mmol/L谷氨酸鎂，20種氨基酸各2 mmol/L，0.33 mmol/L NAD+，0.27 mmol/L CoA，1.5 mmol/L亞精胺，1 mmol/L腐胺，33.33 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸以及27% (/) 的細(xì)胞提取物。將反應(yīng)液混合完畢之后加入終濃度為13.3 μg/mL重組質(zhì)粒起始反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)。

1.5 胰島素原及融合紅色熒光蛋白的胰島素原的Western blotting分析

反應(yīng)4 h后，5 000 r/min離心10 min。將反應(yīng)產(chǎn)物分為上清液和沉淀兩部分，采用4%–16.5% Tricine SDS-PAGE進(jìn)行檢測，一塊膠考馬斯亮藍(lán)染色，另一塊膠濕轉(zhuǎn)至PVDF膜進(jìn)行后續(xù)分析。轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜用封閉緩沖液孵育2 h，再使用PBST (0.01 mol/L PBS，0.05% Tween20，Ph 7.4) 洗膜10 min，重復(fù)3次；洗膜后按1∶20 000的稀釋比例加入溶于封閉緩沖液的鼠抗His標(biāo)簽蛋白單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；孵育完成后，再使用PBST洗膜3次，按1∶1 000的比例加入溶于封閉緩沖液中的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgG的二抗，室溫孵育2 h，孵育完成后用PBST洗膜3次；采用化學(xué)發(fā)光法 (BIO-RAD molecular imager ChemiDoc XRS+ imaging system) 對目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測。

1.6 融合綠色熒光蛋白胰島素原的表達(dá)定量分析

將大腸桿菌來源純化的Pins-eGFP融合蛋白稀釋至不同濃度用酶標(biāo)儀 (PerkinElmer) 檢測熒光強度 (激發(fā)波長：485 nm，吸收波長：535 nm)，繪制融合蛋白濃度關(guān)于熒光強度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將反應(yīng)4 h后的CFPS反應(yīng)液，5 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算融合蛋白的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰島素原核表達(dá)系統(tǒng)以及CFPS系統(tǒng)合成胰島素設(shè)計原理

由于大腸桿菌表達(dá)過程中，表達(dá)產(chǎn)物會相互聚集形成包涵體，需要經(jīng)過變性和復(fù)性的過程才能得到有活性的胰島素。本研究目的在于構(gòu)建含有編碼蛋白酶識別位點基因的融合熒光蛋白的胰島素原表達(dá)質(zhì)粒，并以此為模板，利用CFPS體系無細(xì)胞膜的特點，通過添加蛋白酶對融合蛋白進(jìn)行切割從而實現(xiàn)成熟胰島素在CFPS體系中的合成。在需要時，為了便于儲存和運輸，可以將這些組分分別制成凍干粉，需要時通過加入水起始反應(yīng)即可獲得胰島素。

圖1 E. coli生產(chǎn)胰島素流程圖及CFPS合成胰島素的示意圖(改編自文獻(xiàn)[16])。(A) E. coli生產(chǎn)胰島素流程圖。(B)新型CFPS合成胰島素實驗設(shè)計。

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

表達(dá)胰島素原的重組質(zhì)粒及融合熒光蛋白的胰島素原表達(dá)質(zhì)粒的設(shè)計如圖2所示。胰島素原基因克隆至載體pET-28a(+)獲得重組質(zhì)粒pYH1，經(jīng)Ⅰ和d Ⅲ雙酶切驗證，獲得產(chǎn)物長度為268 bp，與理論長度一致 (圖3)。為了實現(xiàn)胰島素原的可溶性表達(dá)，構(gòu)建了融合紅色熒光蛋白 (mCherry) 的胰島素原重組質(zhì)粒pYH2，通過PCR分別擴增基因片段和重組質(zhì)粒pYH1，獲得產(chǎn)物長度為778 bp和5 535 bp，結(jié)果與預(yù)期大小相符。由于pYH2載體上有2個Ⅰ酶切位點，使用Ⅰ單酶切驗證重組質(zhì)粒，獲得2個片段，長度分別為5 433 bp和780 bp，與理論長度相符，證明重組質(zhì)粒pYH2構(gòu)建成功 (圖4)。構(gòu)建編碼融合綠色熒光蛋白 (eGFP) 與胰島素原融合基因重組質(zhì)粒pYH3，PCR分別擴增基因片段和重組質(zhì)粒pYH1，獲得產(chǎn)物長度為787 bp和5 535 bp，結(jié)果與預(yù)期長度相符。以Ⅰ和Ⅰ雙酶切驗證重組質(zhì)粒，獲得2個片段，長度分別為3 819 bp和2 403 bp (圖5)，證明重組質(zhì)粒pYH3構(gòu)建成功。同時在pYH2和pYH3質(zhì)粒中胰島素原與熒光蛋白之間均加入了氨基酸序列為PSCSSPSP的連接以降低融合對蛋白折疊的影響。

圖2 本研究所構(gòu)建的質(zhì)粒示意圖。(A)表達(dá)胰島素原的重組質(zhì)粒pYH1的構(gòu)建。(B) 融合紅色熒光蛋白的胰島素原重組質(zhì)粒pYH2的構(gòu)建。(C)融合綠色熒光蛋白的胰島素原重組質(zhì)粒pYH3的構(gòu)建。

圖3 pins基因的PCR擴增及質(zhì)粒pYH1的酶切驗證結(jié)果。(A)PCR擴增胰島素原基因(pins)。(B)表達(dá)胰島素原的重組質(zhì)粒pYH1的雙酶切驗證。

2.3 CFPS表達(dá)eGFP的紫外透照儀檢測

為確定本次構(gòu)建的CFPS體系能合成蛋白質(zhì)，在CFPS體系中加入編碼基因的質(zhì)粒，利用CFPS合成eGFP，采用紫外透照儀使用365 nm波長進(jìn)行初步檢測。結(jié)果如圖6所示，證明構(gòu)建的CFPS體系能成功表達(dá)eGFP蛋白，可用于后續(xù)蛋白質(zhì)的體外合成。

2.4 CFPS表達(dá)胰島素原的Western blotting分析

在證明CFPS系統(tǒng)可用于合成eGFP后，在CFPS系統(tǒng)中加入編碼胰島素原的質(zhì)粒pYH1來利用CFPS體系表達(dá)胰島素原。Western blotting實驗結(jié)果顯示，胰島素原在CFPS中成功合成，大小為11.7 kDa，但是表達(dá)的胰島素原主要以包涵體的形式存在于沉淀中，無可溶性表達(dá) (圖7)。

2.5 CFPS表達(dá)融合熒光蛋白的胰島素原及其定量分析

通過在CFPS系統(tǒng)中加入重組質(zhì)粒pYH2表達(dá)融合紅色熒光蛋白的胰島素原 (Pins- mCherry)，通過Western blotting對其進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示Pins-mCherry成功在CFPS系統(tǒng)中表達(dá)，大小為39.1 kDa (圖8)。在后續(xù)實驗中，由于熒光蛋白受激發(fā)光的特性，采用酶標(biāo)儀對融合蛋白的熒光強度進(jìn)行檢測來對融合蛋白進(jìn)行定量分析。在大腸桿菌中表達(dá)pYH3質(zhì)粒并純化了Pins-eGFP蛋白，首先利用BCA試劑盒測定大腸桿菌來源的純化的Pins-eGFP濃度，將稀釋不同倍數(shù)的Pins-eGFP的濃度關(guān)于熒光強度的關(guān)系繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。將重組質(zhì)粒pYH3加入CFPS反應(yīng)后進(jìn)行離心，取上清檢測熒光強度，其相對熒光強度為 (2 037.68±272.93)。Pins-eGFP濃度關(guān)于熒光強度的線性相關(guān)公式為：= 0.005 01+ 2.079，2= 0.995 37 (圖9)。通過計算得到該體系表達(dá)可溶性Pins-eGFP融合蛋白的濃度為(12.28±3.45) μg/mL。

圖4 PCR擴增和pYH2酶切驗證結(jié)果。(A) PCR擴增紅色熒光蛋白基因 (mCherry)。(B)PCR擴增表達(dá)胰島素原的重組質(zhì)粒pYH1。(C)融合紅色熒光蛋白的胰島素原重組質(zhì)粒pYH2的酶切驗證。

圖5 PCR擴增和pYH3酶切驗證結(jié)果。(A) PCR擴增綠色熒光蛋白基因 (eGFP)。(B) PCR擴增表達(dá)胰島素原的重組質(zhì)粒pYH1。(C) 融合綠色熒光蛋白的胰島素原重組質(zhì)粒pYH3的酶切驗證。

圖6 CFPS表達(dá)eGFP的紫外透照儀檢測(1：陰性對照組不含質(zhì)粒；2：CFPS合成產(chǎn)物)

圖7 CFPS表達(dá)胰島素原的Western blotting分析(M：預(yù)染蛋白marker；1：陰性對照組不含質(zhì)粒；2：CFPS反應(yīng)后上清；3：CFPS反應(yīng)后沉淀)

圖8 CFPS表達(dá)Pins-mCherry蛋白的Western blotting分析(M：預(yù)染的蛋白marker；1：陰性對照組不含質(zhì)粒；2：CFPS表達(dá)產(chǎn)物)

圖9 Pins-eGFP濃度關(guān)于熒光強度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

胰島素是由胰島β細(xì)胞產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)類激素，是臨床上治療糖尿病的重要藥物。目前，工業(yè)上通過DNA重組技術(shù)進(jìn)行合成胰島素方法已經(jīng)相當(dāng)成熟[20-21]。臨床上最為常用的胰島素給藥途徑為注射給藥，隨著糖尿病人群的日益增多，開發(fā)一種新的胰島素給藥方式一直是一項熱點問題。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，胰島素原易形成不溶性的包涵體，需要經(jīng)過復(fù)雜的加工過程才能合成有活性的胰島素；而酵母合成的胰島素原容易積累在胞內(nèi)，不能有效分泌至胞外[22-23]。無細(xì)胞蛋白合成體系是一個開放的體系，去除了細(xì)胞膜的限制，可以方便地對其組分進(jìn)行控制，對毒性蛋白的耐受力高，使得許多很難在體內(nèi)順利合成的復(fù)雜蛋白在體外順利表達(dá)。近年來已經(jīng)逐漸被應(yīng)用于高通量藥物篩選、大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白藥物[24]。但是在CFPS系統(tǒng)合成胰島素原只有通過加入去垢劑的方式才能使其可溶性表達(dá)，否則大部分胰島素原仍然以包涵體的形式存在。

為了解決這一問題，本研究成功構(gòu)建了基于BL21(DE3)的CFPS表達(dá)體系，首次通過融合熒光蛋白的策略實現(xiàn)了胰島素原在CFPS中的可溶性表達(dá)。通過Pins-eGFP對融合蛋白進(jìn)行定量，其在CFPS系統(tǒng)中的產(chǎn)量為(12.28±3.45) μg/mL。并且融合蛋白的設(shè)計也為后續(xù)在CFPS系統(tǒng)中將胰島素原進(jìn)一步加工為成熟的胰島素原提供便利，例如可以將蛋白酶切割位點構(gòu)建到連接肽上方便切割。相較于采用連續(xù)流CFPS系統(tǒng)而言，本研究胰島素原的產(chǎn)量水平還不夠高，在后續(xù)的研究中可以通過采取連續(xù)反應(yīng)的方式來進(jìn)一步提升產(chǎn)量。除此之外，還可以通過添加氧化劑和二硫鍵異構(gòu)酶DsbC等策略來促進(jìn)二硫鍵的形成和蛋白折疊，從而增加胰島素的可溶性表達(dá)[25-27]。

如前文所述，為了改善注射給藥方式患者依從性差及副作用的缺點，諸如口服給藥、吸入式給藥、直腸給藥和皮下芯片等方式被提出作為新的胰島素給藥方式[28-29]。但是這些方式也有一些問題亟待解決，例如吸入式給藥途徑容易引起肺功能的改變、增加患肺癌的風(fēng)險、劑量不易控制價格昂貴、攜帶不方便等；口服給藥需要面對如何防止消化道蛋白酶分解的問題[30]。在應(yīng)用CFPS系統(tǒng)開發(fā)給藥裝置的探索中，Collins等通過將CFPS組分凍干，制備成便攜式微型藥物合成工廠。但是運用CFPS系統(tǒng)來生產(chǎn)胰島素還有諸如表達(dá)可溶性胰島素原，提高胰島素原表達(dá)量，以及將胰島素原加工為成熟胰島素等關(guān)鍵問題需要解決。因此，本研究結(jié)果為胰島素原在無細(xì)胞體系中的可溶性表達(dá)及后續(xù)加工提供了良好的工作基礎(chǔ)，并為開發(fā)胰島素新型給藥途徑提供了有用的信息。但是諸如CFPS系統(tǒng)中合成的可溶性的融合蛋白是否具有免疫活性以及如何利用CFPS合成有活性的胰島素等仍有待進(jìn)一步研究。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

徐焱成 教授，一級主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，博士后流動站指導(dǎo)教師。武漢大學(xué)中南醫(yī)院內(nèi)分泌科學(xué)科帶頭人，內(nèi)分泌和綜合醫(yī)療科首席專家。原任中華醫(yī)學(xué)會全國糖尿病學(xué)會副秘書長，中國醫(yī)師協(xié)會內(nèi)分泌代謝病分會常務(wù)委員。中華醫(yī)學(xué)會湖北省糖尿病學(xué)分會主任委員?，F(xiàn)任中華老年醫(yī)學(xué)學(xué)會全國內(nèi)分泌代謝分會副主任委員，中國非公醫(yī)協(xié)會全國內(nèi)分泌糖尿病分會副主任委員，中華醫(yī)學(xué)會湖北省內(nèi)分泌學(xué)分會主任委員。擔(dān)任多個專業(yè)雜志編委、主編及副主編。專著18部，發(fā)表論文180余篇。享受政府津貼。承擔(dān)國家自然基金和省科技攻關(guān)課題多項，獲湖北省政府科技進(jìn)步獎 (第一負(fù)責(zé)人) 多項。

劉天罡 2010年至今任武漢大學(xué)藥學(xué)院教授，2012年依托武漢生物技術(shù)研究院成立合成微生物技術(shù)湖北省工程實驗室，先后獲得國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金以及萬人計劃青年拔尖人才項目和973項目資助。劉天罡教授及其課題組集中在代謝工程和合成生物學(xué)方向，致力于天然產(chǎn)物合成機制的解析以及在此基礎(chǔ)上的微生物藥物和化學(xué)品營養(yǎng)品的創(chuàng)新和高效制造，其建立的定向合成代謝策略在脂肪酸合成途徑、甲羥戊酸合成途徑以及聚酮合成途徑的高效構(gòu)建取得了一系列成果，多篇論文發(fā)表在、、、、、、、等期刊，并多次受邀在國內(nèi)外會議上作相關(guān)報告。還與工業(yè)界進(jìn)行密切合作，為多家企業(yè)解決了諸多實際問題。

Synthesis of soluble proinsulin in a cell-free protein synthesis system

Yuan Hu1, Yuchen Zhang2, Yancheng Xu1, and Tiangang Liu2

1,,,430071,,Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug DiscoveryMinistry of EducationSchool of Pharmaceutical SciencesWuhan UniversityWuhanHubeiChina

Proinsulin (Pins) is the precursor of insulin. The expression of proinsulin informs inclusion body, so that the recombinant protein should be processed with multiple steps to form active insulin. With the development in biotechnology, cell-free protein synthesis (CFPS) system is becoming a valuable tool in protein expression by decoupling the cell growth with protein production, which allows it to express proteins that would interfere with cell physiology. In this study, we synthesized soluble proinsulin in CFPS system in order to establish a new approach for both insulin expression and delivery. The soluble proinsulin was successfully expressed in CFPS system by fusing proinsulin with two types of fluorescent protein. The expression of Pins-mCherry was confirmed by Western blotting analysis, and the Pins-eGFP titer was (12.28±3.45) μg/mL in CFPS system. These results implicated that the proinsulin was expressed partially in soluble form. Here, for the first time, we successfully expressed soluble proinsulin in CFPS system by fluorescent protein fusion. These results provide useful information in developing new insulin expression and delivery method.

cell-free protein synthesis, proinsulin, fusion of fluorescentprotein, solubility, protein folding

November 17, 2016; Accepted: January 24, 2017

Yancheng Xu. Tel: +86-27-67813526; E-mail: xjl100901@whu.edu.cn;

Tiangang Liu. Tel: +86-27-68755086; E-mail: liutg@whu.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81370872), the Young Talents Program of National High-level Personnel of Special Support Program (The “Ten Thousand Talent Program”).

國家自然科學(xué)基金 (No. 81370872)，“萬人計劃”青年拔尖人才資助。