基于合成基因線路的智能藥物

彭曙光，謝震

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基于合成基因線路的智能藥物

彭曙光，謝震

清華大學(xué)清華信息科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室生物信息學(xué)研究部自動(dòng)化系教育部生物信息學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100084

彭曙光, 謝震. 基于合成基因線路的智能藥物. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(3): 456–466.Peng SG, Xie Z.Smart therapeutics based on synthetic gene circuits. Chin J Biotech, 2017, 33(3): 456–466.

合成生物學(xué)自誕生以來對生物學(xué)領(lǐng)域的研究產(chǎn)生了重要的影響。利用工程學(xué)思維與方法，合成生物學(xué)揭開了生命系統(tǒng)許多調(diào)控機(jī)制，改造并擴(kuò)展了一系列生物元件，同時(shí)帶來了廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，為疾病診斷與治療提供了新的思路。本文綜述了適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者細(xì)菌的合成基因線路并用于疾病診斷與治療領(lǐng)域的最新進(jìn)展，為未來智能藥物設(shè)計(jì)提供新的思路。

合成生物學(xué)，基因線路，基因治療，細(xì)胞治療，細(xì)菌療法

合成基因線路是由不同功能的生物分子和基因元件組成的自動(dòng)控制裝置，通過在活細(xì)胞中感受、整合和處理分子信號(hào)，行使特定生物功能。具體而言，合成基因線路可以分為3個(gè)模塊：1) 輸入，感知細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，比如利用腫瘤細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，僅在相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)其調(diào)控的基因；2) 運(yùn)算，對輸入進(jìn)行計(jì)算與處理，比如利用腫瘤細(xì)胞的兩個(gè)特異性啟動(dòng)子分別表達(dá)某種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的N端和C端，則只有兩個(gè)特異性啟動(dòng)子同時(shí)表達(dá)進(jìn)行“邏輯與”運(yùn)算時(shí)，才能形成完整的調(diào)控因子；3) 輸出，釋放生物信號(hào)以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的調(diào)控目標(biāo)，比如利用腫瘤細(xì)胞的兩個(gè)特異性啟動(dòng)子拆分表達(dá)的調(diào)控因子作用于下游基因元件從而表達(dá)自殺蛋白等完成靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。合成基因線路發(fā)展從最簡單的小型模塊開始，包括雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)(Toggle switch)[1-2]、振蕩器(Oscillators)[3-4]和細(xì)胞通訊[5-6]等，利用這些模塊化功能單元，研究人員根據(jù)目標(biāo)重新組合，設(shè)計(jì)能夠執(zhí)行復(fù)雜邏輯功能的新穎的基因線路，以應(yīng)對復(fù)雜的生物環(huán)境。

合成基因線路最主要的應(yīng)用之一便是生物醫(yī)學(xué)研究，即疾病診斷與治療(基因治療、細(xì)胞治療)。這些基于合成基因線路、能夠隨著外界環(huán)境的變化做出及時(shí)的響應(yīng)智能藥物不僅根植于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，細(xì)菌也是重要的設(shè)計(jì)底盤之一，而后者則更加簡單，也更加可控。過去研究中已經(jīng)證明利用合成基因線路可以處理多個(gè)輸入，識(shí)別和干擾RNA以殺死特定腫瘤細(xì)胞[7-8]。本綜述重點(diǎn)介紹近幾年基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌的、針對細(xì)胞表面抗原或者細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物所設(shè)計(jì)的具有治療作用的基因線路，其中也包括新的基因元件、細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)預(yù)期邏輯運(yùn)算與存儲(chǔ)的線路設(shè)計(jì)。

1 適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的合成基因線路

利用并改造一些經(jīng)典的細(xì)胞感知、響應(yīng)信號(hào)通路對于開發(fā)工程化治療性細(xì)胞是非常有用的，這些工程化的細(xì)胞可以自動(dòng)檢測所在部位的疾病或者損傷信號(hào)并精確地部署治療或修復(fù)功能。疾病或者損傷信號(hào)可能出現(xiàn)在細(xì)胞表面，如由抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)的抗原，也可能在細(xì)胞內(nèi)部，如腫瘤特異性miRNA。

1.1 以細(xì)胞表面抗原為靶點(diǎn)

以細(xì)胞表面抗原為靶點(diǎn)的智能藥物近年來取得很大的進(jìn)展。嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR) T細(xì)胞(CAR-T) 便是其中比較具有代表性的工作[9]。CAR-T是人為將特異性的抗原結(jié)合區(qū)即單鏈抗體(Single-chain variable fragment，scFv) 與跨膜區(qū)域和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)結(jié)合起來并組裝到患者的T細(xì)胞中去，使改造后的T細(xì)胞可以表達(dá)腫瘤抗原受體，不依賴于天然的抗原提呈機(jī)制，對特定的腫瘤抗原具有高度親和性，并能夠進(jìn)行特異性地殺傷[10]。

目前CAR-T的發(fā)展已歷經(jīng)3代(圖1A)，區(qū)別主要在于胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)，第一代的CAR-T胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)主要是免疫受體酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM，通常為CD3ζ或FcεRIγ)，第二代在此基礎(chǔ)上增加了共刺激分子CD28，第三代則是繼續(xù)增加了CD137 (4-1BB)等共刺激分子，其目的在于增強(qiáng)T細(xì)胞的活化能力和殺傷性能，并延長T細(xì)胞的存活時(shí)間[11-13]。

盡管CAR-T在臨床上已經(jīng)取得了良好的治療效果，但是其一旦失控極易引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴(Cytokine storm)，從而引起患者的高燒等一系列不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者多器官的衰竭；另外CAR-T在靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，由于多數(shù)抗原也會(huì)在正常組織中低水平表達(dá)，繼而帶來脫靶問題，從而對非腫瘤細(xì)胞組織造成損傷；以及CAR-T在實(shí)體瘤治療領(lǐng)域效果依然較差，一進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)，很快進(jìn)入失能狀態(tài)[14-15]。為了能夠人為干預(yù)調(diào)控CAR-T的活性，Wu等將嵌合抗原受體進(jìn)行了拆分(圖1B)，其中一部分由scFv和共刺激分子組成以及FK506結(jié)合蛋白(FKBP) 結(jié)構(gòu)域組成，另一部分由共刺激分子和FKBP-雷帕霉素結(jié)合域的T2089L突變體(FRB*) 以及CD3ζ構(gòu)成，僅在雷帕霉素的作用下，F(xiàn)KBP和FRB*才會(huì)融合在一起，拆分的兩部分才能重新結(jié)合，進(jìn)而開啟T細(xì)胞的活化與特異性的殺傷功能[16]。這種利用小分子控制的CAR-T，可以幫助醫(yī)生精確地控制T細(xì)胞作用的時(shí)間、地點(diǎn)和強(qiáng)度，從而緩解毒性。此外，Wei等曾在T細(xì)胞中利用細(xì)菌效應(yīng)蛋白作為反饋調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)T細(xì)胞響應(yīng)振幅，或者構(gòu)建可誘導(dǎo)的暫停開關(guān)短暫關(guān)閉T細(xì)胞的激活[17]，這也為調(diào)節(jié)T細(xì)胞響應(yīng)以及免疫風(fēng)暴提供了一種新的策略。

圖1 靶向細(xì)胞表面抗原的哺乳動(dòng)物細(xì)胞療法(A：三代CAR-T技術(shù)之間的區(qū)別；B：利用小分子控制CAR-T的活性[16]；C：可定制響應(yīng)的synNotch[19]；D：具有“邏輯與”運(yùn)算功能的synNotch線路[19]；E：synNotch與CAR-T聯(lián)用，提高CAR-T安全性[20])

與嵌合抗原受體類似，Notch是另外一種簡單、直接的細(xì)胞通訊使用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)工具。Notch受體與其配體Delta家族蛋白表達(dá)在伴侶細(xì)胞的表面，Notch與Delta的結(jié)合導(dǎo)致膜蛋白的水解從而釋放Notch的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域[18]。這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核以激活發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的靶基因。并且Notch的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和胞外的配體都可以進(jìn)行替換，僅保留核心的跨膜區(qū)域，這為定制具有特異性功能的人工信號(hào)通路提供了良好的平臺(tái)?；谏鲜鰞?nèi)容，Morsut等設(shè)計(jì)了人工合成Notch (synNotch)，其胞外區(qū)域變成了單鏈抗體，保留了天然Notch的跨膜自剪切區(qū)域，胞內(nèi)區(qū)域則可以替換成轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域Gal4-VP64以及tTA等[19]。這種人工改造后的Notch 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)之后，可以特異性地識(shí)別與其配對的抗原細(xì)胞，釋放預(yù)先定制的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(hào)，轉(zhuǎn)錄激活下游基因，行使設(shè)計(jì)好的功能(圖1C)。而且synNotch具有良好的正交性，同一細(xì)胞表達(dá)兩種定制的Notch通路不會(huì)互相影響，進(jìn)而可以設(shè)計(jì)具有“邏輯與”運(yùn)算功能的信號(hào)通路，可以提高細(xì)胞通訊的特異性，使細(xì)胞決策更加準(zhǔn)確(圖1D)。同時(shí)，該研究組將synNotch與CAR-T聯(lián)用(圖1E)，提高了對腫瘤識(shí)別的特異性[20]。具體而言，腫瘤表達(dá)的特異性抗原A可以與synNotch上對應(yīng)的抗體相結(jié)合，釋放synNotch胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活信號(hào)tTA，tTA入核激活CAR，表達(dá)的CAR識(shí)別腫瘤另一種特異性抗原B，促進(jìn)T細(xì)胞的活化與增殖，并對腫瘤進(jìn)行特異性地殺傷。

最近，Roybal等利用synNotch改造T細(xì)胞，使之成為藥物遞送的工具[21]。改造后的T細(xì)胞在腫瘤抗原的刺激下可以誘導(dǎo)產(chǎn)生預(yù)設(shè)的細(xì)胞因子或者對T細(xì)胞分化具有決定性作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子從而控制分化的T細(xì)胞的種類，也可以釋放腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體。除此之外，該研究還嘗試了用synNotch信號(hào)通路誘導(dǎo)產(chǎn)生PD-1、CTLA-4抗體增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的功能，以及雙特異性單鏈抗體去激活T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。這種響應(yīng)可定制的智能藥物進(jìn)一步為疾病診斷和治療帶來更多可能。目前該設(shè)計(jì)僅僅是憑借簡單的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，下一步引入多功能的基因線路將會(huì)繼續(xù)擴(kuò)展其潛能和使用場景。

1.2 以細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物為靶點(diǎn)

除了利用細(xì)胞表面抗原來特異性區(qū)分靶向?qū)ο蟛⒃谔烊坏募?xì)胞信號(hào)通路基礎(chǔ)上做改造，使工程化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以靶向遞送藥物之外，利用細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物如腫瘤特異性啟動(dòng)子、miRNA設(shè)計(jì)構(gòu)建基因線路進(jìn)行特異性治療也是目前重要的研究方向。

活細(xì)胞的復(fù)雜控制需要借助能夠感知、測量多種內(nèi)源分子信號(hào)的合成基因線路。RNA干擾提供了一個(gè)通用的界面，允許合成基因線路模塊感測和整合哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的內(nèi)源性分子輸入。Li等利用模塊化的轉(zhuǎn)錄激活抑制子(TALER) 構(gòu)建雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)，并且利用細(xì)胞內(nèi)源miRNA來控制該開關(guān)，從而可以特異性區(qū)分開腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，提高對Hela細(xì)胞分類的精確度，該研究同時(shí)實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物合成生物學(xué)領(lǐng)域的重要目標(biāo)，工程化合成轉(zhuǎn)錄激活因子和抑制子來支持可擴(kuò)展的線路設(shè)計(jì)[22]。Haefliger等利用合成基因線路檢測、評(píng)估藥物對靶向miRNA的作用，該基因線路可以評(píng)估藥物的靶向效果以及是否具有脫靶副作用，比如干預(yù)基因表達(dá)或者其他RNA發(fā)揮作用，為精準(zhǔn)藥物研發(fā)評(píng)估提供了新的方法與平臺(tái)[23]。

近年來迅猛發(fā)展的CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有靈活強(qiáng)大的基因編輯和基因表達(dá)調(diào)控能力[24-25]，為生物學(xué)各分支方向的研究提供了強(qiáng)有力的工具，當(dāng)然也為合成基因線路的構(gòu)建提供了良好的元件，推動(dòng)了基因治療和細(xì)胞治療領(lǐng)域的發(fā)展。Moore等利用Cas9靶向自剪切遞送基因?yàn)楦涌煽氐貙Σ溉閯?dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因治療提供了新的策略[26](圖2A)。雖然Cas9系統(tǒng)存在一定的脫靶和失控問題，但已有相關(guān)研究者對此進(jìn)行改進(jìn)，除了對蛋白本身進(jìn)行突變，降低其與錯(cuò)配堿基的親和度[27-28]，從而降低脫靶效應(yīng)，也有研究者改造Cas9蛋白使之成為化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)型[29]，或者利用光誘導(dǎo)型二聚體CRY2和C1B1蛋白結(jié)合dCas9 (deactiveCas9) 蛋白使之僅在光照條件下才會(huì)激活靶基因[30]，可以進(jìn)行體外控制Cas9蛋白的活性。為了能夠讓細(xì)胞自動(dòng)控制Cas9是否行使功能，Liu等利用特異性啟動(dòng)子設(shè)計(jì)邏輯與基因線路進(jìn)行膀胱癌檢測[31]。兩個(gè)特異性啟動(dòng)子僅在膀胱癌細(xì)胞中才會(huì)同時(shí)具有活性，表達(dá)Cas9蛋白和guide RNA (gRNA)，最終使報(bào)告基因熒光素酶或者毒性蛋白表達(dá)(圖2B)。最近該研究組還結(jié)合核糖體開關(guān)(Riboswitch) 來控制gRNA序列是否裸露，進(jìn)一步來控制Cas9是否發(fā)揮功能[32]。除了用于感知小分子來控制Cas9的活性，他們還利用感知癌癥細(xì)胞高表達(dá)的NF-κB和β-catenin蛋白，來控制是否釋放gRNA序列，并最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。為了更加靈活地操控CRISPR-Cas9系統(tǒng)，對細(xì)胞進(jìn)行重編程，為細(xì)胞治療鋪平道路。Zalatan等構(gòu)建模塊化支架RNA，結(jié)合dCas9，實(shí)現(xiàn)預(yù)設(shè)的多基因轉(zhuǎn)錄程序，其中一些基因被激活而同時(shí)其他基因被抑制[33]。CRISPR相關(guān)的RNA支架提供了一個(gè)強(qiáng)大的方法來構(gòu)建合成基因表達(dá)程序，包括重新布線細(xì)胞命運(yùn)，定制工程化細(xì)胞響應(yīng)。Kiani等則通過控制表達(dá)不同長度的gRNA決定融合了轉(zhuǎn)錄激活因子VPR的Cas9蛋白是剪切還是激活或是抑制目的基因，為研究者靈活運(yùn)用Cas9功能提供了有力的工具[34]。除了直接控制Cas9蛋白或者gRNA序列，Ma等利用miRNA控制由TALE轉(zhuǎn)錄抑制子構(gòu)建的雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)從而表達(dá)不同類型的dCas9，最終在癌細(xì)胞激活靶向基因但在正常細(xì)胞中則關(guān)閉該基因，實(shí)現(xiàn)特異性治療的目標(biāo)[35](圖2C)。該工作在上述Li等工作的基礎(chǔ)上更進(jìn)一步，使雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)在miRNA控制范圍下可操控的基因種類更多，但是隨著多一級(jí)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控增加，該基因線路的噪聲也伴隨著被放大，Ma等也提出了解決策略，如利用miRNA進(jìn)行前饋調(diào)節(jié)[22,35]。近期，Gao等設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了一個(gè)靈活的基于dCas9的化學(xué)誘導(dǎo)的復(fù)雜基因調(diào)控平臺(tái)。他們利用兩個(gè)有效的化學(xué)誘導(dǎo)劑，與正交dCas9組合，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中介導(dǎo)有效的基因激活和抑制，獨(dú)立地控制同一細(xì)胞內(nèi)不同基因的表達(dá)。使用這個(gè)平臺(tái)，他們進(jìn)一步設(shè)計(jì)了基于dCas9的AND、OR、NAND和NOR邏輯運(yùn)算單元[36]。這項(xiàng)工作提供了一個(gè)強(qiáng)大的基于CRISPR-dCas9的平臺(tái)，適用于大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組工程的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄調(diào)控，為以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為底盤的細(xì)胞治療方法的開發(fā)提供了有力的工具。

圖2 基于Cas9元件的的哺乳動(dòng)物細(xì)胞療法(A：利用Cas9靶向自剪切遞送基因[26]；B：利用特異性啟動(dòng)子控制Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)膀胱癌識(shí)別[31]；C：利用miRNA控制TALER構(gòu)建的雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)表達(dá)不同dCas9進(jìn)行多功能基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[35])

2 基于細(xì)菌的合成基因線路

合成基因線路在對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的改造中取得顯著效果，而其在以細(xì)菌為底盤的改造過程中同樣發(fā)揮重要作用，使改造后細(xì)菌可以靶向殺滅病菌或者靶向摧毀癌細(xì)胞以及檢測腫瘤發(fā)生。目前基于細(xì)菌的基因線路大都依賴群體感應(yīng)機(jī)制(Quorum sensing)。即細(xì)菌通過感知其周圍環(huán)境中的特定小分子，比如?；呓z氨酸內(nèi)酯(Acyl-homoserine lactone，AHL)，當(dāng)這種特定的小分子達(dá)到一定濃度/閾值之后，會(huì)打開鄰近細(xì)胞中啟動(dòng)子，激活相應(yīng)的基因，細(xì)菌便是利用這種機(jī)制來交流溝通，感知群體的大小，并作出相應(yīng)的決策。

2.1 靶向病菌的細(xì)菌療法

Gupta等利用改造后的大腸桿菌靶向殺滅綠膿桿菌[37]。研究者利用綠膿桿菌分泌AHL，當(dāng)AHL達(dá)到一定濃度便會(huì)啟動(dòng)大腸桿菌表達(dá)對綠膿桿菌具有特異性殺傷作用的CoPy蛋白，從而達(dá)到抑制綠膿桿菌生長的目的(圖3A)。Hwang等則更近一步，他們同時(shí)在大腸桿菌內(nèi)部添加了動(dòng)力馬達(dá)，當(dāng)被改造后的大腸桿菌感知到AHL時(shí)，便會(huì)開啟CheZ蛋白表達(dá)，使大腸桿菌游向綠膿桿菌，同時(shí)分泌抗生物膜蛋白與抗菌多肽殺滅綠膿桿菌[38](圖3B)。這種基于群體感應(yīng)機(jī)制改造后的細(xì)菌僅在特定條件下快速繁殖，一定程度上能夠限制其給正常組織帶來的傷害。

2.2 靶向腫瘤的細(xì)菌療法

改造后的細(xì)菌不僅可以用來靶向殺滅病菌，也可以特異性裂解腫瘤，使用細(xì)菌作為抗實(shí)體瘤的治療策略正在作為癌癥治療中具有巨大潛力的領(lǐng)域出現(xiàn)。已有研究表明厭氧菌可以侵潤實(shí)體瘤區(qū)域從而降低其生長速率抑制腫瘤生長，然而未經(jīng)改造的兼性厭氧菌也會(huì)對正常組織造成損傷，限制了其使用場景和治療效果。針對這一問題，Yu等將鼠傷寒沙門氏菌工程化改造得到了YB1菌株，使其必需基因置于缺氧條件的啟動(dòng)子下游，確保其僅在厭氧條件下存活，避免對正常組織的損傷[39]。在乳腺腫瘤攜帶的小鼠中，YB1在腫瘤內(nèi)繁殖，抑制腫瘤生長，同時(shí)也能在正常組織中迅速消除。Guo等在此基礎(chǔ)上，利用這種工程化的沙門氏菌(Sal-YB1) 靶向神經(jīng)母細(xì)胞瘤，期望解決其不良的預(yù)后問題[40]。經(jīng)Sal-YB1處理的小鼠中，腫瘤組織具有更多的Sal-YB1浸潤、壞死和收縮。Shi等為解決癌癥和感染性疾病的細(xì)菌治療方法缺乏安全和有效的載體的問題，開發(fā)了沙門氏菌菌株，以保持和安全地遞送質(zhì)粒載體到目標(biāo)組織。該載體被設(shè)計(jì)為允許治療因子(例如細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)，短發(fā)夾RNA或組合) 在真核細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中雙重轉(zhuǎn)錄，其中這種表達(dá)由自催化正反饋回路維持，還提供了引發(fā)系統(tǒng)和在細(xì)菌中保持質(zhì)粒的機(jī)制。這種持續(xù)的遞送和高基因表達(dá)水平對于治療功效是至關(guān)重要的[41]。最近，Shi等設(shè)計(jì)了一種名為ST8的鼠傷寒沙門氏菌菌株，其在腫瘤中積累的水平比親本專性厭氧菌株ST4高至少100倍[42]。此外，改造后的ST8遞送Ⅲ型分泌蛋白SopA融合的內(nèi)皮抑素，靶向腫瘤周圍的血管，通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS) 釋放血管生成抑制劑，以干擾生長因子在腫瘤中的促血管生成作用。具有結(jié)腸癌的小鼠在注射ST8后，通過誘導(dǎo)腫瘤壞死并抑制腫瘤內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞密度，顯示出有效的腫瘤抑制效果。

圖3 基于群體感應(yīng)的細(xì)菌療法(A：利用改造后的大腸桿菌在群體感應(yīng)機(jī)制的控制下靶向殺滅綠膿桿菌[37]；B：改造后的大腸桿菌感知到AHL達(dá)到閾值后表達(dá)CheZ蛋白，游向綠膿桿菌同時(shí)分泌抗生物膜蛋白與抗菌多肽殺滅綠膿桿菌[38]；C：沙門氏菌優(yōu)先在腫瘤組織中累積并表達(dá)抗腫瘤蛋白抑制腫瘤[43]；D：大腸桿菌在群體感應(yīng)機(jī)制的控制下周期性裂解并釋放攜帶藥物[44])

與Yu等策略不同，Swofford等利用群體感應(yīng)線路結(jié)合非致病性的沙門氏菌來治療癌癥[43]。沙門氏菌分泌抗腫瘤蛋白可以幫助清除腫瘤，然而其在正常的組織中也會(huì)表達(dá)進(jìn)而帶來副作用。不過因?yàn)樯抽T氏菌優(yōu)先在腫瘤組織中累積，這些研究人員將群體感應(yīng)線路應(yīng)用到沙門氏菌的改造中，僅當(dāng)在沙門氏菌達(dá)到一定密度之后才會(huì)開啟抗腫瘤蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了治療蛋白在腫瘤組織中選擇性表達(dá)的目標(biāo)(圖3C)。Din等為了更好地控制細(xì)菌種群的數(shù)量以及釋放細(xì)菌所攜帶藥物，他們在群體感應(yīng)的基礎(chǔ)上，增添了正負(fù)反饋機(jī)制，使細(xì)菌種群數(shù)量具有非常魯棒的振蕩的動(dòng)力學(xué)特征[44]。改造后的大腸桿菌可以分泌并感知小分子AHL，這些小分子結(jié)合細(xì)菌產(chǎn)生的LuxR進(jìn)一步促進(jìn)AHL的合成，當(dāng)AHL達(dá)到一定閾值便會(huì)開啟噬菌體裂解基因(φX174E) 合成，引起細(xì)菌死亡，并釋放所攜帶的基因編碼的藥物，菌群數(shù)量急劇下降，AHL濃度也達(dá)到最低點(diǎn)，一個(gè)振蕩周期至此結(jié)束，細(xì)菌開啟下一輪快速繁殖(圖3D)。這種振蕩性的給藥方式將會(huì)減輕細(xì)胞負(fù)擔(dān)，如果下一步能夠做到振蕩性供給多種藥物，將有可能解決腫瘤的耐藥性問題。

2.3 基于細(xì)菌線路的疾病、病菌檢測

除了利用細(xì)菌來作為靶向給藥的運(yùn)載工具，Danino等將改造后的大腸桿菌口服給藥，并通過尿液來無創(chuàng)地檢測肝癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移[45]。這些改造后的細(xì)菌會(huì)特異地在轉(zhuǎn)移瘤中擴(kuò)增，表達(dá)LacZ并裂解熒光素，釋放到泌尿系統(tǒng)中，最終可以通過尿液進(jìn)行檢測。在Borrero等的工作中，乳酸乳球菌被工程化以檢測和抑制萬古霉素抗性糞腸球菌的生長。一旦檢測到由糞腸球菌產(chǎn)生的性信息素cCF10，工程改造的乳酸乳桿菌產(chǎn)生enterocinA、hiracin JM79和enterocin P，從而抑制糞腸球菌生長[46]。

3 結(jié)論和展望

合成生物學(xué)旨在使生物元件標(biāo)準(zhǔn)化，并將其開發(fā)為可用于各種應(yīng)用場景和基礎(chǔ)科學(xué)中即插即用的模塊。合成生物學(xué)的發(fā)展將有助于人們開發(fā)針對腫瘤、糖尿病、單基因遺傳病等疾病的新型治療方法。在基礎(chǔ)科學(xué)方面，合成生物學(xué)允許開發(fā)可量化的模型，其概括自然界中的一些復(fù)雜現(xiàn)象，通過這些模型使我們能夠更好地了解類似的過程，如晝夜節(jié)律和發(fā)育開關(guān)是怎樣被監(jiān)管的。合成生物學(xué)還為我們提供了各種各樣的工具，可以被模塊化地重組以檢測感興趣的觸發(fā)并且給出響應(yīng)報(bào)告。

基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者細(xì)菌的智能藥物有很多的潛力。正如上述討論的以合成基因線路為基礎(chǔ)的設(shè)計(jì)平臺(tái)，在疾病診斷與治療中有很大的潛能。當(dāng)然，目前基于合成基因線路的治療手段并非完美無缺，依舊存在一些問題。比如工程化細(xì)胞的功能，在面對時(shí)間和環(huán)境的變化下，是否可以一直魯棒地工作是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，這是因?yàn)槟壳霸O(shè)計(jì)的合成基因線路通常在最佳的體外生長環(huán)境下進(jìn)行測試和響應(yīng)，對于預(yù)期復(fù)雜環(huán)境可能無法精確復(fù)現(xiàn)。另外，細(xì)胞異質(zhì)性帶來的噪聲也會(huì)在一定程度上影響基因線路的預(yù)期效果[47]，模塊化的基因線路下游元件也會(huì)向上游模塊施加負(fù)載從而負(fù)面影響基因線路功 能[48]，從而導(dǎo)致了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中組裝基因線路的功能預(yù)測不準(zhǔn)確。這些都是以合成基因線路為基礎(chǔ)的智能藥物開發(fā)所需要考慮和解決的問題。隨著合成生物學(xué)研究在動(dòng)物模型和臨床中的應(yīng)用，新的、有效的體外系統(tǒng)應(yīng)該盡快開發(fā)，以更好地模擬改造后細(xì)胞所面臨的錯(cuò)綜復(fù)雜的情況，從而加速智能藥物的研發(fā)與評(píng)估。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

謝震 現(xiàn)任清華信息科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室、生物信息學(xué)研究部和清華大學(xué)合成與系統(tǒng)生物學(xué)中心研究員。2011年入選“青年千人”計(jì)劃。主要研究方向包括建立哺乳動(dòng)物合成生物學(xué)使能技術(shù)平臺(tái)，研究基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、基因線路的設(shè)計(jì)與控制原理，以及在基因治療、細(xì)胞治療上的應(yīng)用?，F(xiàn)任雜志助理主編，農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因安全委員會(huì)委員。

Smart therapeutics based on synthetic gene circuits

Shuguang Peng, and Zhen Xie

MOE Key Laboratory of Bioinformatics and Bioinformatics Division, Center for Synthetic and System Biology, Department of Automation, Tsinghua National Laboratory for Information Science and Technology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Synthetic biology has an important impact on biology research since its birth. Applying the thought and methods that reference from electrical engineering, synthetic biology uncovers many regulatory mechanisms of life systems, transforms and expands a series of biological components. Therefore, it brings a wide range of biomedical applications, including providing new ideas for disease diagnosis and treatment. This review describes the latest advances in the field of disease diagnosis and therapy based on mammalian cell or bacterial synthetic gene circuits, and provides new ideas for future smart therapy design.

synthetic biology, gene circuits, gene therapy, cell therapy, bacterial therapy

November 3, 2016; Accepted:January 5, 2017

Zhen Xie. Tel: +86-10-62794294; E-mail: zhenxie@tsinghua.edu.cn

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2014CB745200), Basic Research Program of Tsinghua National Lab for Information Science and Technology (Z.X.).

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (No. 2014CB745200)，清華信息科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目資助。