微生物胞外電子傳遞效率的合成生物學(xué)強化

李鋒，宋浩

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微生物胞外電子傳遞效率的合成生物學(xué)強化

李鋒1,2，宋浩1,2

1 天津大學(xué)化工學(xué)院系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072 2 天津大學(xué)天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心合成生物學(xué)研究平臺，天津 300072

李鋒, 宋浩. 微生物胞外電子傳遞效率的合成生物學(xué)強化. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(3): 516–534.Li F, Song H. Promoting efficiency of microbial extracellular electron transfer by synthetic biology. Chin J Biotech, 2017, 33(3): 516–534.

電活性微生物 (產(chǎn)電微生物和親電微生物) 通過與外界環(huán)境進(jìn)行雙向電子和能量傳遞來實現(xiàn)多種微生物電催化過程 (包括微生物燃料電池、微生物電解電池、微生物電催化等)，從而實現(xiàn)在環(huán)境、能源領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，并為開發(fā)有效且可持續(xù)性生產(chǎn)新能源或大宗精細(xì)化學(xué)品的工藝提供了新機(jī)會。但是，電活性微生物的胞外電子傳遞效率比較低，這已經(jīng)成為限制微生物電催化系統(tǒng)在工業(yè)應(yīng)用中的主要瓶頸。以下綜述了近年來利用合成生物學(xué)改造電活性微生物的相關(guān)研究成果，闡明了合成生物學(xué)如何用于打破電活性微生物胞外電子傳遞途徑低效率的瓶頸，從而實現(xiàn)電活性微生物與環(huán)境的高效電子傳遞和能量交換，推動電活性微生物電催化系統(tǒng)的實用化進(jìn)程。

電活性微生物，合成生物學(xué)，微生物電催化，微生物燃料電池，微生物電合成

環(huán)境污染和能源短缺已經(jīng)成為世界上的兩大難題。綠色可再生新能源是替代化石燃料，解決未來保護(hù)環(huán)境和能源短缺的可持續(xù)發(fā)展的必經(jīng)之路。以電活性微生物為主導(dǎo)的微生物電催化系統(tǒng)，包括微生物產(chǎn)電[1-2]、微生物電合成[3]、微生物非平衡電發(fā)酵[4-5]等)，作為一種新型的綠色新能源生產(chǎn)方式正嶄露頭角。微生物電催化過程是通過電活性微生物與外界環(huán)境進(jìn)行雙向電子和能量交換，實現(xiàn)環(huán)境、能源領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，如促使有機(jī)廢棄物降解和電能回收的微生物燃料電池 (Microbial fuel cells, MFC)[6-7]、用于生物制氫的微生物電解池 (Microbial electrolysis cells, MEC)[8-9]、用于實現(xiàn)CO2固定[10]和大宗精細(xì)化學(xué)品合成的非平衡電發(fā)酵和微生物電合成 (Microbial electrosynthesis, MES)[11-13]，以及微生物冶金[14]、生物傳感器[15-16]和生物電子 學(xué)等[17]。

雙向電子傳遞指電活性微生物與外界環(huán)境進(jìn)行“雙向”電子和能量交換，即微生物向外界環(huán)境釋放和從外界環(huán)境獲取電子的過程。目前發(fā)現(xiàn)電活性微生物近上百種[18]，主要可分為可釋放電子的產(chǎn)電微生物 (Exoelectrogens)和可直接從電極獲取電子并轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)還原力的親電微生物 (Electroautotrophic bacteria) 兩大類。由于電活性微生物的胞外電子傳遞效率低，這些微生物電催化系統(tǒng)普遍存在效率低下的缺點，距離實際應(yīng)用對電催化效率的要求相去較遠(yuǎn)，已成為限制其應(yīng)用的主要瓶頸。隨著合成生物學(xué)技術(shù)的引入，設(shè)計重構(gòu)與功能強化電活性微生物，以突破胞外電子傳遞效率低這個關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，將加速微生物電催化系統(tǒng)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進(jìn)程。

本綜述圍繞利用合成生物學(xué)改造非電活性細(xì)胞為電活性微生物、拓寬電活性微生物可利用的碳源譜、強化電活性微生物代謝活性、合成可溶性電子傳遞載體、提高胞內(nèi)還原當(dāng)量 (可釋放的電子源泉)，以及構(gòu)建介觀多細(xì)胞自更新活性生物膜提高“電極-細(xì)胞”間的電子跨膜傳遞速率，系統(tǒng)綜述了近5年左右國際上在改造雙向電子傳遞途徑方面的進(jìn)展。

1 電活性微生物的雙向電子傳遞的分子機(jī)制

目前為止，電活性微生物和電極間的3種電子傳遞機(jī)制獲得人們的廣泛認(rèn)可 (圖1A)：即直接的電子傳遞 (微生物在形成厚實的生物膜后，通過自身的細(xì)胞色素或?qū)щ姳廾珜崿F(xiàn)與電極間的直接接觸導(dǎo)電)、電子傳遞介質(zhì)介導(dǎo)的電子傳遞 (微生物通過自身分泌的氧化還原電子傳遞介質(zhì)實現(xiàn)和電極間的電子交換) 和間接的電子傳遞機(jī)制 (微生物通過自身代謝物如氫氣、甲酸實現(xiàn)和電極間的電子交換)[19-21]。在產(chǎn)電微生物的“放電”過程中，由底物氧化釋放的電子，按照電子傳遞鏈中血紅素蛋白氧化還原電位由低到高的順序，跨膜傳遞到胞外電子受體上。一系列串聯(lián)的血紅素蛋白，所表現(xiàn)出的重疊電勢確保了電子能順利地傳遞到胞外[20]。在模式產(chǎn)電微生物，如希瓦氏菌和泥菌中，主要通過生物膜 (厚達(dá)100 μm) 上的型-細(xì)胞色素 (由多種不同電勢血紅素蛋白組成) 進(jìn)行直接電子傳遞，并通過自身合成的核黃素等氧化還原導(dǎo)電介質(zhì)進(jìn)行電子傳遞[22]。此外，和還可以利用自身的細(xì)胞附屬物“納米天線”——導(dǎo)電鞭毛進(jìn)行遠(yuǎn)距離電子傳遞[23-25]。在生物電化學(xué)系統(tǒng)中，生物膜形成的速度、厚度和形態(tài)決定了直接電子傳遞的效率[26-27]。然而，在電子傳遞介質(zhì)介導(dǎo)的電子傳遞中，產(chǎn)電微生物自身分泌的可溶性的氧化還原性分子或可溶性離子，可以通過自身的氧化還原再生來完成胞外遠(yuǎn)距離的電子傳遞。產(chǎn)電微生物可以分泌多種可溶性的氧化還原性分子，如奧奈達(dá)希瓦氏菌分泌的黃素 (核黃素和黃素單核苷酸)[28]、綠膿假單胞菌分泌的吩嗪[29]、枯草芽孢桿菌分泌的核黃素和克雷伯氏菌分泌的醌類[30]等。而間接的電子傳遞指產(chǎn)電微生物利用自身代謝物 (氫氣、甲酸等) 來完成的胞外電子傳遞過程[3]。

相對于產(chǎn)電微生物的胞外電子傳遞機(jī)制被科學(xué)家們研究得較透徹，人們對親電微生物的“充電”過程，即細(xì)胞從電極直接攝入電子的機(jī)制則研究得非常有限。親電微生物從外界電極獲取電子的機(jī)制主要也包括通過自身的細(xì)胞色素或?qū)щ姳廾珜崿F(xiàn)與電極間的直接攝取電子、通過自身分泌的氧化還原完成的電子介質(zhì)介導(dǎo)傳遞和微生物通過胞外的氫氣、甲酸、Fe2+或 NH3等完成的間接電子傳遞3種方式[19](圖1B)。電子的流出和進(jìn)入是否經(jīng)由相同的途徑進(jìn)行傳遞完成電子由胞外跨膜傳遞到胞內(nèi)的過程，還沒有被系統(tǒng)闡明。進(jìn)入細(xì)胞的電子被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)還原力 (NADH或NADPH)，可以用于固定CO2或催化產(chǎn)物合成[21]。

圖1 電活性微生物的雙向電子傳遞機(jī)制[19,21]

2 利用合成生物學(xué)改造電活性微生物

2.1 利用合成生物學(xué)改造非產(chǎn)電微生物為產(chǎn)電微生物

作為創(chuàng)造新生命的工具，合成生物學(xué)已經(jīng)被用來構(gòu)建新的產(chǎn)電微生物。加州大學(xué)勞倫斯伯克利國家實驗室的Ajo-Franklin課題組在埃希氏大腸桿菌中，異源表達(dá)了的胞外電子傳遞色素蛋白 (CymA、MtrA、MtrB、MtrC)，重構(gòu)了胞外電子傳遞路徑 (CymA-MtrCAB)[31]，成功地將改造成產(chǎn)電微生物。所構(gòu)建的產(chǎn)電可還原可溶的的金屬Fe3+離子和無機(jī)固體氧化物α-Fe2O3，其還原速度較原菌分別提高了8倍和4倍。其后期研究結(jié)果顯示，在表達(dá)有MtrCAB色素系統(tǒng)的大腸桿菌中繼續(xù)表達(dá)CymA蛋白或添加核黃素可促進(jìn)大腸桿菌的胞外電子傳遞和細(xì)胞生長[32]。導(dǎo)入MtrCAB-CymA色素系統(tǒng)的大腸桿菌輸出電流提高了8倍，電流的輸出雖然沒有影響到細(xì)胞生長和底物消耗，但對代謝流的分布產(chǎn)生影響，更有利于氧化型產(chǎn)物的生成[33]。

Yong等[34]也在改造大腸桿菌產(chǎn)電方面進(jìn)行了研究，在大腸桿菌中異源表達(dá)的合成“孔蛋白”基因，顯著增加了大腸桿菌的細(xì)胞膜通透性 (圖2A)，減少了電子傳遞介質(zhì)的傳遞的阻力，使電子傳遞介質(zhì)能自由穿梭細(xì)胞膜，從而使每個細(xì)胞的電催化性能獲得有效提升，提高了胞間電子跨膜傳遞速率，成功地將非產(chǎn)電微生物改造為產(chǎn)電微生物，揭示了電子傳遞介質(zhì)在電活性細(xì)胞內(nèi)外的傳遞阻力是限制胞外電子傳遞速率的重要步驟。同時，Yong等[35]通過敲除大腸桿菌中合成乳酸的乳酸脫氫酶基因，重定向胞內(nèi)可釋放電子，釋放了存儲在乳酸等中間代謝物中的電子 (圖2B)；通過敲除三羧酸循環(huán) (TCA) 的抑制基因，解除了Arc系統(tǒng)對TCA代謝通量的抑制調(diào)控，增加了TCA循環(huán)中多個核心酶的表達(dá)量，加快了TCA的代謝流，提高了胞內(nèi)釋放電子池 (NADH) 濃度，增加胞內(nèi)可釋放電子總量 (圖2C)[36]。從而顯著提高了大腸桿菌的胞外電子傳遞能力，成功將非產(chǎn)電的大腸桿菌理性改造成為有一定胞外電子傳遞能力的產(chǎn)電微生物。

圖2 合成生物學(xué)改造非產(chǎn)電微生物為產(chǎn)電微生物[34-36]

Schmitz等[37]在惡臭假單胞菌中導(dǎo)入合成綠膿菌素的全部基因簇，使得嚴(yán)格耗氧的惡臭假單胞菌在低溶氧條件下能夠合成吩嗪，并利用吩嗪作為電子介質(zhì)和電極進(jìn)行電子傳遞和能量交換，將嚴(yán)格好氧且不能進(jìn)行胞外電子傳遞的惡臭假單胞菌成功改造成可以利用電極進(jìn)行厭氧呼吸的產(chǎn)電菌。有效地解決了惡臭假單胞菌在工業(yè)上進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵時，因加大溶氧而導(dǎo)致的發(fā)酵罐起泡問題。這些通過合成生物學(xué)成功將非電活性微生物改造為電活性微生物的手段有可能推動微生物電催化技術(shù)的工業(yè)化發(fā)展。

2.2 利用合成生物學(xué)改造產(chǎn)電微生物

結(jié)合合成生物學(xué)的多基因表達(dá)調(diào)控策略，近幾年在強化產(chǎn)電微生物的底物攝取范圍和速度、提高胞內(nèi)可釋放電子池濃度、增強細(xì)胞間電子傳遞介質(zhì)的合成和構(gòu)建導(dǎo)電活性生物膜等方面的改造取得了重要進(jìn)展。不僅闡明了合成生物學(xué)如何打破產(chǎn)電微生物胞外電子傳遞途徑的瓶頸，實現(xiàn)產(chǎn)電微生物與環(huán)境的高效電子傳遞和能量交換，也推進(jìn)電活性微生物電催化系統(tǒng)的實用化進(jìn)程。

2.2.1 利用合成生物學(xué)提高底物攝取范圍和速度

產(chǎn)電微生物的底物 (電子供體) 攝取范圍和利用能力是限制其胞外電子傳遞能力的重要因素。底物的氧化攝取速度受到可用于運輸?shù)孜锏牡鞍追N類、運輸需要的能量ATP和可用的酶種類等生物因素控制。研究人員利用自適應(yīng)性進(jìn)化和重定向篩選等非合成生物學(xué)策略成功地拓寬了產(chǎn)電微生物的底物攝取范圍；如Sekar等通過一年多的自適應(yīng)進(jìn)化策略，激活了希瓦氏菌的木糖利用能力，使得可以利用木糖生長產(chǎn)電[38]。而理性定向的合成生物學(xué)策略不僅可以特定地拓寬產(chǎn)電微生物的底物利用范圍還能加快其底物攝取速度。如在中表達(dá)負(fù)責(zé)甘油和葡萄糖攝取的蛋白和相應(yīng)代謝酶類來拓寬底物的攝取范圍，使得希瓦氏菌在厭氧和有氧條件下能夠利用甘油或葡萄糖作為唯一的碳源和電子供體[39-40]。此外，由于厭氧條件下胞內(nèi)的乳酸一直受限于缺少足夠質(zhì)子動力勢的推動而吸入緩慢，Johnson等在中異源引入藻類的光合質(zhì)子泵系統(tǒng)[41]，加快了ATP的合成及底物乳酸的吸收速度，提高了電流輸出，加快了細(xì)胞生長。這些研究顯示了通過增加底物的攝取范圍或速度可以有效地提高電子傳遞通量。

另一方面，為了克服產(chǎn)電菌可用的碳源譜過窄的限制 (如僅能利用乳酸為碳源)，Yang等[42]利用合成生物學(xué)改造和混菌互利共生來實現(xiàn)混菌共培養(yǎng)，構(gòu)建了以木糖為底物的“發(fā)酵菌-產(chǎn)電菌”混菌產(chǎn)電生態(tài)系統(tǒng) (圖3A)。在大腸桿菌 (發(fā)酵菌) 中導(dǎo)入合成核黃素的代謝模塊，使其可以以木糖為碳源高產(chǎn)電子傳遞介質(zhì) (核黃素)，提高了希瓦氏菌 (產(chǎn)電菌) 的胞外電子傳遞效率，同時大腸桿菌的代謝副產(chǎn)物 (乳酸、甲酸等) 可以進(jìn)一步作為希瓦氏菌的電子供體和碳源；同時進(jìn)一步改造希瓦氏菌的細(xì)胞壁極性，增強產(chǎn)電菌和電極的疏水性作用，顯著增強-型細(xì)胞色素介導(dǎo)的直接接觸胞外電子傳遞的能力。而最近Lin等[43]通過敲除釀酒酵母(發(fā)酵菌) 乙醇合成途徑，使前體物更多流向乳酸生成方向來促進(jìn)乳酸的生成。利用釀酒酵母降解葡萄糖高產(chǎn)乳酸，間接地為希瓦氏菌提供碳源和電子供體。此外，進(jìn)一步改造希瓦氏菌，提高其細(xì)胞膜的電子傳遞介質(zhì)通透性和細(xì)胞疏水性，促進(jìn)產(chǎn)電細(xì)胞和電極間的緊密結(jié)合。成功構(gòu)建了以葡萄糖為底物的混菌產(chǎn)電生態(tài)系統(tǒng) (圖3B)。所構(gòu)建的“發(fā)酵菌-產(chǎn)電菌”混菌產(chǎn)電生態(tài)系統(tǒng)，不僅解決了單一產(chǎn)電菌僅能利用非常有限的碳源 (乳酸和乙酸) 這一限制微生物電催化系統(tǒng)使用范圍的重要問題，同時也進(jìn)一步解釋了現(xiàn)實生態(tài)環(huán)境中不同電活性微生物互相分享彼此的電子傳遞介質(zhì)，提供自身產(chǎn)物作為其他電活性細(xì)胞底物的種群互利現(xiàn)象。

圖3 合成生物學(xué)改造產(chǎn)電微生物的底物利用范圍[42-43]

2.2.2 利用合成生物學(xué)提高胞內(nèi)可釋放電子池濃度

產(chǎn)電微生物的胞內(nèi)電子池容量大小 (即電子載體NAD(H/+)總量和NADH/NAD+的比例) 是決定其所能釋放電流大小的根本因素。NADH/NAD+的比例受到胞內(nèi)輔因子合成模塊的代謝通量和胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的直接影響。在提高產(chǎn)電微生物的胞內(nèi)電子池，Yong等[44]通過表達(dá)中NAD+合成酶基因，提高了胞內(nèi)的電子池NAD(H/+)總量的同時也促進(jìn)胞內(nèi)電子傳遞介質(zhì)綠膿菌素的合成，二者協(xié)同作用提高了單個細(xì)胞的電催化活性，促進(jìn)了的胞外電子傳遞效率；Han等[45]通過在梭狀芽孢桿菌中異源表達(dá)甲酸脫氫酶基因，改變了胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，促進(jìn)了胞內(nèi)還原力的生成，提高了內(nèi)NAD(H/+)總量和NADH/NAD+的比值，拓寬了胞內(nèi)可釋放電子池的同時提高了胞內(nèi)還原當(dāng)量，在單細(xì)胞水平上揭示了胞內(nèi)可釋放電子池的形成和積累是決定細(xì)胞胞外電子傳遞通量的速控步驟，闡明了胞內(nèi)代謝決定了胞外電子傳遞能力的分子機(jī)制。這些電活性微生物改造策略直接導(dǎo)致了胞外電子傳遞通量和單細(xì)胞產(chǎn)電能力的大幅提高，揭示了胞內(nèi)可釋放電子池的濃度與胞外電子傳遞速率存在正相關(guān)關(guān)系。

2.2.3 利用合成生物學(xué)改造胞間電子傳遞介質(zhì)

產(chǎn)電微生物通過自身特有的胞外電子傳遞鏈將胞內(nèi)代謝釋放的電子傳到細(xì)胞外，然后通過直接接觸導(dǎo)電或自身分泌的電子傳遞介質(zhì)間接將電子傳遞到胞外電子受體上。據(jù)統(tǒng)計，在可以分泌電子傳遞介質(zhì)的產(chǎn)電微生物體內(nèi)，以可溶性的氧化還原性分子或電容性粒子介導(dǎo)的電子傳遞是最主要的胞外電子傳遞方式，其輸送的電量占總電量的70%?90%[46]。因此，電子傳遞介質(zhì)的合成與傳遞是決定胞外電子傳遞速率的根本因素。利用合成生物學(xué)改造產(chǎn)電微生物胞內(nèi)可溶性電子傳遞介質(zhì) (核黃素、吩嗪和醌類) 的合成和傳遞，可以較大地提高產(chǎn)電微生物的胞外電子傳遞速率。

眾所周知，主要依賴于核黃素進(jìn)行遠(yuǎn)距離胞外電子傳遞，而其自身所能合成的核黃素量又極低。為解決這一限制胞外電子傳遞的主要因素，Yang等[47]通過合成生物學(xué)的多基因表達(dá)策略，將枯草芽孢桿菌中編碼核黃素合成的核心基因簇 () 引入希瓦氏菌中，改造后的經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，黃素 (核黃素和黃素腺嘌呤二核苷酸) 產(chǎn)量獲得顯著提高 (25.7倍)，直接提高了電子傳遞介質(zhì)介導(dǎo)胞外電子傳遞效率。核黃素含量的提高又進(jìn)一步促進(jìn)了希瓦氏菌在電極表面生物膜的形成，間接地提高了-細(xì)胞色素和納米天線直接介導(dǎo)的電子傳遞效率。生物電化學(xué)實驗結(jié)果顯示，核黃素合成模塊的成功引入，分別從單個細(xì)胞導(dǎo)電水平的提升和電極上附著的生物量增多兩個角度來顯著提高產(chǎn)電細(xì)胞的雙向電子傳遞性能，使得電子進(jìn)入細(xì)胞和傳出細(xì)胞的速度各自提高13.2和15.5倍 (圖4)，成功揭示了可以通過合成生物學(xué)手段來改造用于電合成的親電極微生物，提高親電微生物的電子攝取速率，為電合成的菌株開發(fā)指明方向。Yong等[48]通過精確調(diào)控“群體感應(yīng)系統(tǒng)”中的關(guān)鍵調(diào)控基因和的表達(dá)，促進(jìn)了中吩嗪-1-羧酸和綠膿菌素等電子介質(zhì)的合成，促進(jìn)了電子傳遞介質(zhì)介導(dǎo)的胞外電子傳遞，使得的胞外電子傳遞效率提高了1.6倍。為進(jìn)一步提高的電子傳遞效率，Yong等[29]又通過直接表達(dá)綠膿菌素合成相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶基因，顯著提升了綠膿菌素的合成量，進(jìn)一步促進(jìn)了胞外電子傳遞效率的提高[27,44]，上述實驗結(jié)果表明電子傳遞介質(zhì)在電活性細(xì)胞內(nèi)外的傳遞阻力是限制胞外電子傳遞速率的重要步驟。

圖4 改造產(chǎn)電微生物的胞間電子傳遞介質(zhì)

2.2.4 利用合成生物學(xué)改造電活性生物膜

微生物分泌的黏附素、多糖、蛋白和DNA等聚合物導(dǎo)致細(xì)胞間相互交聯(lián)形成的導(dǎo)電細(xì)胞群體，即生物膜[49]。微觀研究表明，生物膜的形成是一個包括初始期、形成期、成熟期、穩(wěn)定期和分解期的穩(wěn)定循環(huán)過程[27]。產(chǎn)電性微生物生物膜的形成受電極材料、環(huán)境條件和生物膜自身的厚度影響。此外，外膜型細(xì)胞色素系統(tǒng)和群體感應(yīng)系統(tǒng)也在產(chǎn)電微生物 (、和) 的生物膜形成中也起著重要的作用。在電催化系統(tǒng)中，高活性的生物膜往往更有利于電子的傳遞。而野生型產(chǎn)電微生物的生物膜普遍厚度較薄，包含的細(xì)胞量較小，不利于電子的傳遞。因此，生物膜的形成是限制胞外電子傳遞效率的重大挑戰(zhàn)。

Liu等[51]在中分別通過誘導(dǎo)和組成型兩套方案異源表達(dá)了大腸桿菌中用于合成第二信使分子 (c-di-GMP) 的二鳥苷環(huán)化酶基因，改造后的細(xì)胞生長狀況和野生型相當(dāng)，但在有氧和厭氧條件下，經(jīng)電鏡觀察，極易在電極表面形成更加致密的電活性生物膜。致密的生物膜顯著地增強了以型細(xì)胞色素介導(dǎo)的直接胞外電子傳遞效率，同時也促進(jìn)了以核黃素為電子介質(zhì)的間接胞外電子傳遞效率。首次揭示生物膜的細(xì)胞量與產(chǎn)電效率呈線性關(guān)系，為采用合成生物學(xué)方法與納米生物技術(shù)方法提高電催化效率的設(shè)計策略奠定了理論基礎(chǔ)。Nguyen等[50]開發(fā)的自組裝生物功能材料平臺，可用于改造電活性微生物的生物膜結(jié)構(gòu)，讓細(xì)胞的表面布滿“導(dǎo)電鱗甲”，為整體提高產(chǎn)電微生物胞外電子的傳遞性能，甚至親電微生物的電子攝取能力提供理論可能。生物膜的形成不僅有助于電活性微生物與電極之間的電子傳遞，也將較大地推動雙向電子傳遞 (即電子進(jìn)、出細(xì)胞) 效率，這一限制微生物燃料電池和微生物電合成關(guān)鍵科學(xué)問題的解決。

2.3 工程化產(chǎn)電微生物的應(yīng)用

以產(chǎn)電微生物為主導(dǎo)的微生物電催化系統(tǒng)，作為一種新型的綠色新能源生產(chǎn)方式在環(huán)境、能源領(lǐng)域方面獲得廣泛應(yīng)用，如用于廢水處理、生物冶金、土壤修復(fù)、環(huán)境監(jiān)測、生物計算和生物傳感器方面的微生物燃料電池 (MFC)，用于生物制氫、海水淡化和鹵素還原的微生物電解電池 (MEC)。而最近產(chǎn)電微生物在非平衡發(fā)酵產(chǎn)高附加值化學(xué)品、生物計算和生物傳感器等方面也扮演越來越重要的角色。

2.3.1 非平衡電發(fā)酵應(yīng)用

非平衡電發(fā)酵[4,39,52-53]是一種由產(chǎn)電微生物的胞外電子傳遞特性——依靠胞外電極 (陽極) 進(jìn)行無氧呼吸演變而來的全新發(fā)酵模式，實現(xiàn)了利用胞外能量代謝“拉動”胞內(nèi)物質(zhì)代謝的發(fā)酵過程，在厭氧條件下，通過將胞內(nèi)過剩的還原力轉(zhuǎn)化成電子釋放到胞外電極來調(diào)控胞內(nèi)的氧化還原平衡，提升底物降解速度的同時減少副產(chǎn)物的生成，提高產(chǎn)物產(chǎn)率的同時也回收部分電能。為加快厭氧條件下利用甘油產(chǎn)乙醇的速率和產(chǎn)率，F(xiàn)lynn等[39]在體內(nèi)引入來自大腸桿菌的甘油代謝模塊和運動假單胞菌乙醇生成模塊，結(jié)合自身的胞外電子傳遞機(jī)制，將胞內(nèi)過剩的還原力釋放到胞外電極上，調(diào)節(jié)了胞內(nèi)氧化還原平衡，較大地提升了底物甘油的降解速度，縮短發(fā)酵周期；同時降低副產(chǎn)物乙酸的生成量，提高產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)率和純度，實現(xiàn)產(chǎn)電微生物利用甘油產(chǎn)高純度乙醇的非平衡電發(fā)酵模式。

Sturm-Richter等[52]利用改造的大腸桿菌和甲烷桿菌構(gòu)建出混菌共培養(yǎng)的非平衡電發(fā)酵模式。首先在大腸桿菌中引入的胞外電子傳遞路徑，將大腸桿菌改造成可進(jìn)行胞外電子傳遞的模式發(fā)酵菌；然后結(jié)合甲烷桿菌共發(fā)酵來降解副產(chǎn)物甲酸產(chǎn)甲烷和CO2，減弱底物抑制，加快底物降解。所構(gòu)建的混菌非平衡發(fā)酵模式有效地提高了厭氧條件下甘油產(chǎn)乙醇的發(fā)酵速率和產(chǎn)率。Speers等[54]則利用同為嚴(yán)格厭氧的電活性微生物和進(jìn)行混菌共培養(yǎng)，非平衡發(fā)酵甘油產(chǎn)乙醇，的代謝副產(chǎn)物乙酸可以作為的電子供體和碳源，由此來降解副產(chǎn)物抑制，拉動底物降解。由于電活性微生物羅爾斯通真氧產(chǎn)堿菌在氮饑餓、TCA循環(huán)或有氧呼吸受抑制等生長受抑制的狀態(tài)下能合成聚羥基丁酸酯 (PHB)，為維持菌株處于氮饑餓的生長抑制狀態(tài)，Nishio等[53]利用胞外電極替代可以引起氮饑餓解除的硝酸鹽作為電子受體，加速了果糖非平衡發(fā)酵產(chǎn)PHA的速率。此外，Zhu等[55]通過添加胞外電極和胞間電子傳遞介質(zhì)，將丙酸梭菌胞內(nèi)過剩的NADH變成電子釋放到胞外，抑制了丙酰輔酶A脫氫酶的活性，阻斷了丙酰輔酶A向丙酸合成的方向轉(zhuǎn)化，促使大量積累的丙酰輔酶A向附加值更高的丙烯酸轉(zhuǎn)化，減少了副產(chǎn)物丙酸的生產(chǎn)，提高了l利用乳酸產(chǎn)丙烯酸的產(chǎn)率。

2.3.2 生物計算和生物傳感器應(yīng)用

合成生物學(xué)改造胞外電子傳遞鏈的工作主要在生物傳感器和生物計算中獲得重要應(yīng)用。Hu 等[17]通過理性重構(gòu)細(xì)胞內(nèi)的“基因電路”，選擇和優(yōu)化啟動子和核糖體結(jié)合位點，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄、翻譯水平上對希瓦氏菌的胞外電子傳遞基因的精準(zhǔn)調(diào)控，構(gòu)建了AND“邏輯門”控制的智能可控型MFC，這種生物電信號輸出可能成為設(shè)計生物電化學(xué)傳感器和生物智能計算的有效輸出信號 (圖5A)。同上，Li等[56]以lasI/rhlI 突變的為底盤，構(gòu)建了基于QS系統(tǒng)雙信號分子控制的AND “邏輯門”智能型MFC (圖5B)。Webster等[15]通過利用氧化砷敏感型啟動子控制希瓦氏菌胞外電子傳遞鏈的表達(dá)，構(gòu)建了可以檢測到環(huán)境中濃度極低的氧化砷智能微生物傳感器，其在環(huán)境監(jiān)測和污染物防控中獲得重要推廣。Franks等[16]基于合成生物學(xué)方法，提出將可以進(jìn)行光和電等可視化胞外輸出的微生物和可以還原重金屬離子的微生物傳感器結(jié)合，構(gòu)建出可以快速、高效檢測環(huán)境中重金屬離子的微生物傳感器。因此利用合成生物學(xué)改造電活性微生物的電子傳遞鏈可以用于環(huán)境生物傳感器開發(fā)，尤其在有毒污染物高度特異性檢測方面的潛在應(yīng)用。

2.4 利用合成生物學(xué)改造親電微生物

近幾年，電合成因具有直接以CO2為原料、能量轉(zhuǎn)換較光合作用效率更高 (10?100倍以上)、電能來源多樣 (如風(fēng)電、光伏發(fā)電) 等優(yōu)勢，微生物電合成的出現(xiàn)使得利用親電微生物合成高附加值化學(xué)品成為目前研究的熱點。微生物電合成指親電微生物利用難并網(wǎng)的電能來固定還原CO2或者低還原度的化合物生產(chǎn)高附加值電燃料和化學(xué)品的生物催化過程。然而，由于不同親電微生物的具體電子進(jìn)入機(jī)制目前尚未研究清楚，按照電子進(jìn)入細(xì)胞的方式不同，大致可將電合成分為直接攝取電子電合成、電子介質(zhì)介導(dǎo)攝取電子的電合成和間接攝取電子電合成。相對于產(chǎn)電微生物的被廣泛改造，利用合成生物學(xué)改造親電微生物的只有[57-58]和MR-1[59]兩種。

圖5 產(chǎn)電微生物在生物計算和生物傳感器應(yīng)用[17,56]

2.4.1 基于直接攝取電子的微生物電合成

雖然產(chǎn)電微生物和因特有的“異化金屬還原路徑”能夠還原固體金屬氧化物而被人類廣泛研究，但最近研究表明它們也可以通過自身的型細(xì)胞色素系統(tǒng)從電極上直接攝取電子。為了扭轉(zhuǎn)和的胞外電子鏈的傳遞方向，使其能夠用于電合成高附加值化合物，Bond等[60]給MR-1施加–0.36 V電壓，電子可以直接通過MtrCAB路徑跨過細(xì)胞外膜和周質(zhì)空間逆流到細(xì)胞內(nèi)膜的甲基萘醌池內(nèi)，并進(jìn)一步返流到細(xì)胞周質(zhì)空間還原延胡索酸合成琥珀酸。最近，Jeon等[59]在MR-1中異源表達(dá)了異丁醇合成路徑 (Ehrlich pathway) 的酮基異戊酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因，直接以電極為電子供體，促進(jìn)了異丁醇產(chǎn)量的提高 (19.3 mg/L)。Soussan等[61]發(fā)現(xiàn)可以通過自身的型細(xì)胞色素介導(dǎo)，直接從陰極表面攝取電子還原CO2和琥珀酸生產(chǎn)甘油。

目前發(fā)現(xiàn)的親電微生物，大多數(shù)都以直接攝取電子的方式從電極上獲得電子。Nevin等[65]發(fā)現(xiàn)一些自養(yǎng)型的親電微生物 (梭菌、鼠孢菌和熱醋穆爾氏菌等產(chǎn)乙酸菌) 因具有高效還原CO2的Wood–Ljungdahl路徑和直接從電極獲得電子的能力，可以直接利用電子還原CO2產(chǎn)乙酸、甲酸和2-羰基丁酸等高附加值化合物。其中，Choi等[66]發(fā)現(xiàn)巴氏梭菌可以直接從電極上攝取電子來促進(jìn)丁醇和1,3-丙二醇的產(chǎn)量。Nevin等[62]利用太陽能電池板接受太陽能轉(zhuǎn)化來的電能，讓直接利用電子固定CO2為乙酸。在此基礎(chǔ)上，近兩年UC-Berkeley的楊培東課題組通過構(gòu)建親電微生物與無機(jī)催化劑相結(jié)合 (–CdS)的“人工光合葉片”系統(tǒng)，直接將光能轉(zhuǎn)化為電能來固定CO2合成高附加值化學(xué)品[63,67-68]。Valdes等[69]發(fā)現(xiàn)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌可以直接依靠氧化Fe2+和S2–釋放的電子固定CO2和N2。此外，Gong等[64]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌可以直接從電極上獲得電子還原CO2產(chǎn)甲烷。Gong等構(gòu)建的混菌電合成體系，利用陽極的H2S作為電子供體 (降解H2S為SO42–釋放出8個電子)，來給陰極的提供還原力，從而固定CO2合成有機(jī)物。其在陽極處理含硫廢水的同時完成了陰極CO2還原，120 h內(nèi)庫倫效率達(dá)90%，展示了一定工業(yè)應(yīng)用前景。

2.4.2 基于電子載體介導(dǎo)的攝取電子微生物電合成

大量的研究工作顯示，一些人工的氧化還原電子傳遞介質(zhì) (甲基紫 (MV)、中性紅 (NR)、二磺酸蒽醌 (AQDS)) 具有很強的氧化還原活性，可以促進(jìn)微生物從電極上攝取電子，提高電合成的效率[22]。其中MV因進(jìn)不去細(xì)胞內(nèi)膜只能在周質(zhì)空間發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)。其標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)電動勢和H2接近，可以作為氫化酶的氧化還原伴侶，用于H2的生產(chǎn)和氧化研究[70-72]。最近的研究顯示，還原型的AQDS也可以用于提高拜氏梭菌的H2產(chǎn)量[73]。不同于MV的作用機(jī)制，中性紅 (NR) 通過緊貼到微生物細(xì)胞膜上，和胞內(nèi)的NAD+或延胡索酸還原酶發(fā)生氧化還原反應(yīng)來加快電子的攝取速度[74-75]。Choi等[76]發(fā)現(xiàn)MV和NR可以促進(jìn)酪丁酸梭菌的丁酸產(chǎn)率提高，并進(jìn)一步揭示了MV是通過間接提高電子從鐵氧還原蛋白池到NADH池的速度，而NR是通過直接加快電極上電子到NADH池的流速，來改變胞內(nèi)可用NADH的濃度來提高丁酸的合成。此外，一些親電微生物自身分泌的電子氧化還原傳遞介質(zhì) (如spp. 合成的吩嗪和合成的核黃素) 也可以加快電子的攝取效率。這些自身合成電子傳遞介質(zhì)優(yōu)點在于：同一種電子傳遞介質(zhì)可以被多種親電微生物使用；它們可以在周質(zhì)的多個位點 (細(xì)胞周質(zhì)空間和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)) 進(jìn)行電子傳遞反應(yīng)。Aulenta等[77]發(fā)現(xiàn)脫鹵擬球菌spp. 可以分泌一種類似氰鈷胺素 (維生素B12) 的導(dǎo)電介質(zhì)，來提高細(xì)菌從陰極攝取電子和自身生長的速度，促進(jìn)三氯乙烯的脫氯過程。Boussicault等[78]發(fā)現(xiàn)來自細(xì)胞裂解或者胞外DNA降解的單個嘌呤和嘧啶堿基也可作為電子介質(zhì)促進(jìn)陰極電子的攝取?？傊鲜隼硬粌H有助于解釋親電微生物攝取電子傳遞機(jī)理，更提供了一種新的調(diào)控親電微生物的生長、代謝和電合成的策略。

2.4.3 基于間接攝取電子的微生物電合成

作為首個被用來工程化的親電微生物，已被廣泛用于電合成研究。因其不能直接從電極上攝取電子，UCLA的Liao[58]和Harvard的Nocera等[57]分別將電子轉(zhuǎn)換成甲酸和氫氣等可接受的電子供體形式，然后再利用工程化的來固定CO2電合成生物燃料。其中，Liao等[58]分三步完成系統(tǒng)設(shè)計：1) 首先改造：在敲除的PHB合成路徑相關(guān)基因 (、、、和) 的基礎(chǔ)上，繼續(xù)在纈氨酸合成路徑上異源表達(dá)的乙酰醇酸合成酶基因，的酮醇酸還原異構(gòu)酶基因和二羥酸脫水酶基因，在異丁醇合成路徑上表達(dá)中的酮基脫羧酶基因和中的乙醇脫氫酶基因，改造獲得1株可以單獨利用氫氣或甲酸作唯一能源發(fā)酵產(chǎn)生物燃料的工程菌LH74D。 2) 通過電化學(xué)系統(tǒng)將電子和CO2轉(zhuǎn)化兼具碳源和電子供體屬性的甲酸。3) 工程菌LH74D在100 h內(nèi)可以利用陰極生產(chǎn)的甲酸為唯一的碳源和能源進(jìn)行生長，合成濃度為140 mg/L的生物燃料。同上，Nocera等[57]在敲除的PHB合成路徑關(guān)鍵基因和的基礎(chǔ)上，同源表達(dá)編碼酮基硫解酶基因和乙酰乙酰基輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因，異源表達(dá)來自sp. 的基因乙酰乙酸脫羧酶和乙醇脫氫酶，使得乙酰輔酶A重定向于合成異丙醇，構(gòu)建得到可以成功利用CO2和H2進(jìn)行生長的工程菌Re2133-pEG12。然后利用無機(jī)催化劑磷酸鈷電解水產(chǎn)生的H2為其提供還原力固定CO2，合成的異丙醇濃度高達(dá)216 mg/L。以上這些將合成生物學(xué)成功應(yīng)用于開發(fā)高效親電微生物的案例表明，工程化的高效電活性微生物已經(jīng)成為微生物電催化技術(shù)的核心部件，將為未來電合成微生物的改造起到重要參考作用。

3 基因組工具箱開發(fā)

基因組工具箱是未來研究電活性微生物怎樣和環(huán)境進(jìn)行電子交換，以及設(shè)計優(yōu)化電活性微生物為人類服務(wù)的基礎(chǔ)。過去十年，人類已經(jīng)完成了電催化模式細(xì)胞和的測序工作，極大方便了人們對電子傳遞分子機(jī)制的理解和相關(guān)代謝模塊的設(shè)計和研究。例如，F(xiàn)redrickson[79]總結(jié)了的傳感、調(diào)控、代謝系統(tǒng)，并用動力學(xué)模型對其生長、底物消耗和產(chǎn)物的分泌進(jìn)行了詳細(xì)描述。但相關(guān)基因工具箱的缺乏仍舊限制了人類對電活性微生物的開發(fā)和探索速度。相對于模式產(chǎn)電菌和，其他的電活性微生物可用的基因工具則更少。如[80]雖然已經(jīng)可以利用其基于基因測序獲得的代謝模塊，但有關(guān)其合成生物學(xué)改造的文獻(xiàn)卻很少。最近，的遺傳轉(zhuǎn)化和異源表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)成功[81]，其基因組序列的進(jìn)一步公開加快了其工程化的可能性。此外，由于受限于可操作的基因工具數(shù)量(雙質(zhì)粒系統(tǒng)的開發(fā))，關(guān)于只有相關(guān)基因組序列可知?？捎玫幕蚬ぞ呤巧钊胙芯考?xì)胞代謝和胞外電子傳遞的基礎(chǔ)。然而，大多已描述的胞外電子傳遞路徑并未被詳細(xì)闡明，尤其是關(guān)于電子如何進(jìn)入電活性微生物進(jìn)行電合成的機(jī)制仍存有異議。因此，作為限制進(jìn)一步探索和挖掘電活性微生物的瓶頸，在電活性微生物中開發(fā)高效的基因組編輯工具 (如CRISPR-Cas9[82]、sRNA[83])、新的DNA組裝方法 (Gibison大片段重組[84])、快捷準(zhǔn)確的DNA從頭合成方法來豐富合成生物學(xué)基因組編輯工具箱，是突破現(xiàn)狀和進(jìn)一步深入研究和改造電活性微生物為人類服務(wù)的重要手段。

4 前景展望

過去幾年中，隨著人類對胞外電子傳遞機(jī)制理解的不斷加深，以及電活性微生物在生物產(chǎn)電、生物產(chǎn)氫、CO2固定和化學(xué)品生物電合成等領(lǐng)域的不斷應(yīng)用，使得微生物電催化逐漸發(fā)展成為一個新興的生物技術(shù)。但如下幾個主要科學(xué)及技術(shù)瓶頸仍極大限制著微生物電催化系統(tǒng)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用：1) 電活性微生物較低的電子傳遞效率和電催化活性 (細(xì)胞攝取和利用電子的能力較低、CO2固定和轉(zhuǎn)化效率低、過電勢高) 仍然難以滿足工業(yè)需求。比如，雖然由于測序的完成以及基因工具的不斷開發(fā)，推進(jìn)了sp. 在合成氣發(fā)酵中的研究[85-86]，但對電合成時sp.電生理、電催化的分子機(jī)制尚缺乏深入研究。2) 對大多數(shù)電活性微生物在產(chǎn)電和電合成過程中，胞外電子傳遞和攝取的機(jī)制仍舊不清晰[87-88]，比如，對導(dǎo)電菌毛蛋白納米線和生物膜的電子傳遞機(jī)制仍存在較大爭議[24,89-91]，從而較難實現(xiàn)提高電子傳遞效率的理性設(shè)計。3) 針對非模式的電活性微生物不斷被發(fā)現(xiàn)，但對其電活性生理及物質(zhì)、能量代謝的分子機(jī)制缺乏系統(tǒng)理解，同時能用的代謝工程和合成生物學(xué)工具仍然非常有限，急需系統(tǒng)開發(fā)改造這些電活性微生物基因組水平的調(diào)控和編輯工具。

展望未來，要創(chuàng)造出工業(yè)可用的高效電活性微生物，促進(jìn)電活性微生物的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用獲得更快的發(fā)展，我們將在以下幾個方面進(jìn)行深入研究：1) 深入研究電活性微生物的電子傳遞路徑及其調(diào)控、組裝分子機(jī)制，從而不斷提高電活性微生物的胞外電子傳遞通量和效率。2) 研究電活性微生物的物質(zhì)和能量代謝的耦合關(guān)系，使電子能定向高效合成特定產(chǎn)物。3) 不斷擴(kuò)充現(xiàn)有的合成生物學(xué)工具箱、尋找新的可進(jìn)行基因組編輯的電活性微生物。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

宋浩 天津大學(xué)化工學(xué)院教授 (制藥工程、生物工程方向)、博士生導(dǎo)師。2004年獲得美國休斯頓大學(xué)化學(xué)工程博士學(xué)位。2004?2009年在美國得克薩斯大學(xué)和杜克大學(xué)從事合成生物學(xué)博士后研究，2009?2013年在新加坡南洋理工大學(xué)做助理教授。2013年入選國家“青年千人”計劃，并加入天津大學(xué)化工學(xué)院、系統(tǒng)生物技術(shù)教育部重點實驗室。研究興趣為合成生物學(xué)與代謝工程，主要側(cè)重在微生物電催化過程 (微生物電合成、微生物-多酶燃料電池等)、微生物生態(tài)系統(tǒng)和生物制藥。承擔(dān)多項國家課題，包括重大863項目、973子課題、國家自然科學(xué)基金和多項公司橫向課題等。發(fā)表了近70篇SCI文章，包括、、、等。

Promoting efficiency of microbial extracellular electron transfer by synthetic biology

Feng Li1,2, and Hao Song1,2

1 Key Laboratory of Systems Bioengineering (Ministry of Education), School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China 2 SynBio Research Platform, Collaborative Innovation Centre of Chemical Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China

Electroactive bacteria, including electrigenic bacteria (exoelectrogens) and electroautotrophic bacteria, implement microbial bioelectrocatalysis processesbi-directional exchange of electrons and energy with environments, enabling a wide array of applications in environmental and energy fields, including microbial fuel cells (MFC), microbial electrolysis cells (MEC), microbial electrosynthesis (MES) to produce electricity and bulk fine chemicals. However, the low efficiency in the extracellular electron transfer (EET) of exoelectrogens and electrotrophic microbes limited their industrial applications. Here, we reviewed synthetic biology approaches to engineer electroactive microorganisms to break the bottleneck of their EET pathways, to achieve higher efficiency of EET of a number of electroactive microorganisms. Such efforts will lead to a breakthrough in the applications of these electroactive microorganisms and microbial electrocatalysis systems.

electroactive bacteria, synthetic biology, microbial electrocatalysis, microbial fuel cells, microbial electrosynthesis

November 1, 2016; Accepted:January 13, 2017

Hao Song. Tel: +86-22-60977327; E-mail: hsong@tju.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21376174, 21621004), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2014CB745103), Tianjin Science & Technology Council (No. 13JCYBJC40700).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 21376174, 21621004)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃) (No. 2014CB745103) ，天津市科委 (No. 13JCYBJC40700) 資助。

2017-01-23

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170123.1554.001.html