九節(jié)菖蒲中酚酸類成分的提取工藝研究

楊曉東，李福兵，梅 嬌，袁宏佳，劉興文，李 波（重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400700）

九節(jié)菖蒲中酚酸類成分的提取工藝研究

楊曉東＊，李福兵，梅 嬌，袁宏佳，劉興文，李 波#（重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400700）

目的：測定九節(jié)菖蒲中酚酸類成分含量并優(yōu)化其提取工藝。方法：采用高效液相色譜法測定九節(jié)菖蒲中單阿魏酰酒石酸、阿魏酸的含量；以2種指標性成分的總含量為指標，以提取溶劑的體積分數(shù)、提取溶劑量、提取次數(shù)和提取時間為因素，采用正交試驗法優(yōu)化提取工藝，并進行驗證試驗。結(jié)果：九節(jié)菖蒲藥材中單阿魏酰酒石酸和阿魏酸的含量分別為0.059%、0.002 5%。優(yōu)化后的提取工藝為將30%乙醇600m L加至20 g藥材中提取2次，每次90m in；驗證試驗中2種成分在提取物中的平均含量分別為0.297 1%（RSD＝3.64%，n＝3）、0.004 1%（RSD＝5.11%，n＝3）。結(jié)論：建立了九節(jié)菖蒲中單阿魏酰酒石酸、阿魏酸含量的測定方法；優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定、可行。

九節(jié)菖蒲；酚酸類成分；單阿魏酰酒石酸；阿魏酸；含量測定；提取工藝；高效液相色譜法；正交試驗

九節(jié)菖蒲為毛茛科銀蓮花屬植物阿爾泰銀蓮花（Anemone altaica Fisch.ex C.A.Mey.）的干燥根莖[1]，其味辛、性微溫，常見的功效有清熱除濕、活血祛瘀、消腫解毒等[2]，臨床中常利用其“化痰、開竅醒神”的功效，治療心腦血管疾病。根據(jù)文獻報道對九節(jié)菖蒲化學(xué)成分的研究結(jié)果，有機酸類尤其是酚酸類化合物是其主要化學(xué)成分，其中以單阿魏酰酒石酸和阿魏酸含量較高[3-4]。目前對九節(jié)菖蒲中酚酸類成分的活性研究較少，據(jù)文獻報道阿魏酸具有抗血栓、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗生育、調(diào)節(jié)免疫功能、利肝保膽等多種藥理作用[5-6]。為了研究九節(jié)菖蒲中總有機酸的藥效活性，筆者在本試驗中采用高效液相色譜法（HPLC法）測定九節(jié)菖蒲中酚酸類成分的含量；采用正交試驗法，以其中的主要指標性成分單阿魏酰酒石酸和阿魏酸為指標，優(yōu)化九節(jié)菖蒲中酚酸類化合物的提取方法，確定提取溶劑的種類、用量、提取時間、提取次數(shù)、提取溫度等參數(shù)[7-9]，得出最優(yōu)工藝，為后期研究九節(jié)菖蒲的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供條件。

1 材料

1.1 儀器

2695 HPLC儀，包括2489紫外檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；BSI型電子分析天平（北京Starsorius天平有限公司，精度為0.01mg）；KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，40 KHz，100 VA）；TDL-40B離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BF-2000F型定容氮吹儀（北京八方世紀科技有限公司）；DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 藥材與試劑

九節(jié)菖蒲藥材采自陜西省寶雞市（2013年9月12日），經(jīng)北碚區(qū)中醫(yī)院劉興文主任中藥師鑒定為銀蓮花屬植物阿爾泰銀蓮花的干燥根莖；阿魏酸、單阿魏酰酒石酸對照品（河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥化學(xué)實驗室制，批號分別為：20140912、20141102，純度：均大于98%）；甲醇、乙腈、三氟乙酸均為色譜純，甲酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測定九節(jié)菖蒲中單阿魏酰酒石酸和阿魏酸的含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-含0.1%三氟乙酸的水溶液（B）；流速為1.0m L/m in；檢測波長為323 nm；柱溫為30℃；進樣體積為10μL。梯度洗脫條件如下：0～8m in，15% A；8～15m in，15%～30%A；15～25m in，30%A。

2.1.2 對照品貯備液和樣品溶液的制備 （1）對照品貯備液：準確稱取單阿魏酰酒石酸和阿魏酸適量，分別溶于10m L量瓶中，加甲醇至刻度，作為各樣品的標準液。再分別從上述量瓶中取單阿魏酰酒石酸和阿魏酸各100μL，置于同一25m L量瓶中，加甲醇至刻度得混合對照品貯備液。貯備液中單阿魏酰酒石酸和阿魏酸的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.02mg/m L。（2）供試品溶液：將九節(jié)菖蒲藥材經(jīng)60℃干燥后粉碎成細粉，過60目篩。稱取生藥粉末1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入含5%甲酸的甲醇溶液25m L，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量；超聲（40 KHz，100VA）提取60min，取出放冷后再稱定質(zhì)量，用含5%甲酸的甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心（3 000 r/min，離心半徑7.5 cm）5min，取上清液，用0.45μm的脂溶性濾膜過濾，續(xù)濾液置于樣品小瓶中備用。2.1.3 專屬性試驗 分別取”2.1.2”項下的混合對照品貯備液和供試品溶液各10μL，進樣分析，結(jié)果其他峰不干擾指標性成分峰，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.1.4 標準曲線的建立 分別取上述對照品貯備液0.5、1.25、2.5、5.0、10.0m L，置于10m L量瓶中，以甲醇定容至10m L，得系列對照品溶液。取上述溶液在選定的色譜條件下分別進樣分析，每個質(zhì)量濃度樣品平行進樣3次，以3次峰面積平均值為縱坐標（y）、質(zhì)量濃度（mg/m L）為橫坐標（x）進行線性回歸，得單阿魏酰酒石酸和阿魏酸的回歸方程分別為y＝11 746x+11 217（r＝0.999 8）、y＝68 995x+3 830（r＝0.999 3），二者檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.005～0.100、0.001～0.020mg/m L。

2.1.5 精密度試驗 分別精密吸取0.05mg/m L的單阿魏酰酒石酸、0.01mg/m L的阿魏酸對照品溶液10μL，重復(fù)進樣6次，結(jié)果單阿魏酰酒石酸、阿魏酸的峰面積RSD分別為1.3%、1.2%（n＝5），表明該法精密度好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一九節(jié)菖蒲粉末樣品5份，每份1 g，照供試品溶液制備方法進行處理后進樣測定。結(jié)果，單阿魏酰酒石酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為2.1%、1.8%（n＝5），提示該法處理樣品重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取九節(jié)菖蒲供試品溶液，分別在放置0、2、4、8、12 h時測定單阿魏酰酒石酸、阿魏酸的峰面積并計算含量，結(jié)果二者含量的RSD分別為2.9%、2.5%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 分別精密吸取低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液適量，依次加入精密稱取的已測知含量的九節(jié)菖蒲粉末（9份，各1 g）的提取液中，3份為1組，制備成供試品溶液后進樣測定并計算回收率。結(jié)果單阿魏酰酒石酸的回收率分別為90.9%、93.4%、94.2%（RSD均不超過2.35%，n＝3），阿魏酸的回收率分別為95.0%、92.0%、90.0%（RSD均不超過2.51%，n＝3）。

2.1.9 樣品含量測定 精密稱取九節(jié)菖蒲粉末1 g，依法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣，計算單阿魏酰酒石酸和阿魏酸的含量（n＝3）。結(jié)果九節(jié)菖蒲藥材中單阿魏酰酒石酸和阿魏酸的含量分別為0.059%、0.002 5%（g/g）。

2.2 單因素試驗篩選提取條件

以指標性成分單阿魏酰酒石酸、阿魏酸的含量和得膏率（提取物干燥至干膏的質(zhì)量/提取藥材質(zhì)量之百分比）為初步指標，采用平行試驗考察影響提取工藝的因素水平，確定合適的因素水平范圍。先對提取溶劑乙醇的體積分數(shù)、提取溶劑量和提取時間（以沸騰開始計時，沸騰程度為微沸，后面試驗均以此為標準計時）3個因素的水平進行考察。

2.2.1 提取溶劑體積分數(shù) 將藥材適當粉碎后取20 g，提取次數(shù)確定為2次，其余條件見表1，分別考察提取溶劑乙醇不同的體積分數(shù)（30%、50%、70%、95%）的提取效果。提取液趁熱經(jīng)12層紗布過濾，濾液減壓濃縮干燥，得膏率及提取物中2種成分的含量見表1。

由表1可知，不同體積分數(shù)乙醇提取對指標性成分的含量均有一定的影響，30%乙醇提取時得膏率和指標性成分的含量均高于50%乙醇提取結(jié)果，故推測采用更低的體積分數(shù)提取效果可能更優(yōu)。因此在正交試驗中將提取溶劑的最低體積分數(shù)下調(diào)至10%，即正交試驗中乙醇體積分數(shù)設(shè)為10%、30%、50%3個水平。

2.2.2 提取時間 將藥材適當粉碎后取20 g，提取次數(shù)確定為2次，其余條件見表2，分別考察不同提取時間（煎煮40、60、80、100m in）的提取效果。提取后的操作同“2.2.1”項，結(jié)果見表2。

表1 提取溶劑體積分數(shù)考察結(jié)果Tab 1 Investigation results of volume fraction of extraction solvent

表2 提取時間考察結(jié)果Tab 2 Investigation resultsofextraction time

表2結(jié)果顯示，不同的提取時間對指標性成分含量均有一定的影響，提取時間在80～100min后，得膏率雖有提高，但是指標性成分的含量反而下降。因此，正交試驗中將提取時間設(shè)為30、60、90m in 3個水平。

2.2.3 提取溶劑量 將藥材適當粉碎后取20 g，提取次數(shù)確定為2次，其余條件見表3，分別考察不同的提取溶劑量（400、500、600、700m L）的提取效果。提取后的操作同“2.2.1”項，結(jié)果見表3。

表3 提取溶劑量考察結(jié)果Tab 3 Investigation results of solvent amount of extraction solvent

表3結(jié)果顯示，不同的提取溶劑量對指標性成分的含量影響不大。綜合考察，在正交試驗中將提取溶劑量設(shè)為400、500、600m L 3個水平。

2.3 正交試驗優(yōu)化提取條件

2.3.1 因素與水平 根據(jù)“2.2”項試驗結(jié)果，選擇提取溶劑乙醇的體積分數(shù)（A）、提取溶劑量（B）、提取次數(shù)（C）和提取時間（D）為考察因素，以2種指標性成分的總含量為考察指標，設(shè)計L9（34）正交試驗。各因素與水平見表4。

2.3.2 試驗安排與結(jié)果 準確稱取九節(jié)菖蒲藥材9份，每份20 g，適當粉碎，分別按L9（34）表中的設(shè)計條件進行提取，提取液趁熱經(jīng)12層紗布過濾。分別合并提取液，減壓干燥，計算得膏率；再分別取一定量浸膏，用甲醇溶解后制備成供試品溶液進樣分析。試驗重復(fù)2次，測定指標性成分的含量取其平均值。試驗安排與結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表4 因素與水平Tab 4 Levelsand factors

表5 試驗安排與結(jié)果Tab 5 Arrangementand resultsof test

表6 方差分析結(jié)果Tab 6 Resultsof varianceanalysis

由方差分析結(jié)果可知，影響提取物中指標性成分含量的各因素主次關(guān)系為A＞D＞B＞C，因素A、D具有極顯著性影響（P＜0.01），因素B、C影響較小。

綜上，優(yōu)化后的九節(jié)菖蒲中酚酸類成分的提取工藝為A2B3C2D3，即藥材加入30%乙醇600m L回流提取90 min，提取2次。

2.3.3 驗證試驗 取3份九節(jié)菖蒲，每份500 g，適當粉碎，均按最優(yōu)工藝進行提取，提取液趁熱經(jīng)12層紗布過濾。分別合并提取液，減壓干燥，計算平均得膏率，測定指標性成分單阿魏酰酒石酸、阿魏酸的含量，結(jié)果見表7。

由表7可見，對較大投料量藥材進行提取時，提取物中2種指標性成分的含量均較單因素和正交試驗結(jié)果更高，且提取含量比較穩(wěn)定，提示最優(yōu)提取工藝穩(wěn)定、可行。

表7 驗證試驗結(jié)果Tab 7 Resultsof validation test

3 討論

經(jīng)查閱文獻，目前未見有關(guān)九節(jié)菖蒲中酚酸類成分含量測定方法的文獻報道。本試驗建立了同時測定九節(jié)菖蒲中單阿魏酰酒石酸、阿魏酸含量的HPLC方法，該方法操作簡便、準確、快速，可用于九節(jié)菖蒲中單阿魏酰酒石酸、阿魏酸的含量測定。在處理供試品時，作者比較了甲醇超聲提取、甲醇回流提取、甲酸-甲醇超聲提取[10]3種方法的處理效果，結(jié)果顯示甲酸-甲醇超聲提取60min時，提取液中單阿魏酰酒石酸和阿魏酸含量較高，故采用此種方法處理供試品。

在前期選用提取溶劑時，曾分別考察了以水和30%、50%、70%、95%乙醇為提取溶劑進行回流提取的效果，結(jié)果顯示用水提取時雜質(zhì)較多，且提取液中酚酸類成分含量少，故未選用水為溶劑。在九節(jié)菖蒲中淀粉等多糖類成分含量很高，故用低體積分數(shù)的乙醇提取時，得膏量較大，且由于酚酸類成分極性較大，故這類成分易溶于低體積分數(shù)的乙醇中；用50%、70%乙醇提取時得膏率和指標性成分含量均較低；用95%乙醇提取時所得極性雜質(zhì)很少，故總酚酸含量較高，但得膏率較低。

在“2.1.9”項下中樣品含量測得的是九節(jié)菖蒲藥材中單阿魏酰酒石酸和阿魏酸的含量，而后續(xù)各表中的含量測定結(jié)果是提取物（提取藥材后所得浸膏）中2種成分的含量，故二者數(shù)據(jù)差別較大。

由于在單因素試驗中已將得膏率納入考察指標，且得膏率與2種指標性成分的含量呈一定正相關(guān)，故正交試驗中未再將得膏率作為考察指標，僅以2種指標性成分的總量為指標。

阿魏酸是弱有機酸，化學(xué)穩(wěn)定性不高，其水溶液形態(tài)的藥物制劑有效期一般不到2年[11]，因其在水溶液中穩(wěn)定性差，見光時分解更快，特別是其在高溫下被破壞更明顯[12]，故提取時間應(yīng)對阿魏酸的含量有極顯著影響。但是由于其含量相對單阿魏酰酒石酸較低，故對總酸含量有影響但程度不大，這與正交試驗結(jié)果一致。

綜上，本試驗首次對九節(jié)菖蒲中單阿魏酰酒石酸、阿魏酸的含量進行了測定，并以單阿魏酰酒石酸、阿魏酸的含量為指標，通過正交試驗優(yōu)化了九節(jié)菖蒲中酚酸類成分的提取工藝，為后續(xù)九節(jié)菖蒲的藥理活性研究和藥效學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] 王國強.全國中草藥匯編[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：22.

[2] 張慶文，葉文才，車鎮(zhèn)濤，等.安徽銀蓮花的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2001，26（9）：612-614.

[3] 王彥志，牛堃杰，曾光，等.九節(jié)菖蒲的化學(xué)成分研究[J].中醫(yī)學(xué)報，2013，28（5）：700-701.

[4] 王彥志，曾光，張萌，等.九節(jié)菖蒲的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2014，14（5）：1219-1222.

[5] 洪倩.阿魏酸抗輻射活性及其作用機制研究[D].北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2012.

[6] 歐仕益.阿魏酸的功能與應(yīng)用[J].廣州食品工業(yè)科技，2002，18（4）：50-53.

[7] 林海成，祝洪艷，何忠梅，等.正交試驗優(yōu)選酸棗仁總皂苷提取工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，12（5）：42-45.

[8] 金汝城，李貴文，馬素麗，等.當歸中阿魏酸提取工藝的優(yōu)化研究[J].中成藥，2008，30（4）：516-519.

[9] 王強，劉運權(quán)，王濤，等.不同產(chǎn)地天山雪蓮中綠原酸和蘆丁含量測定及其煎煮提取工藝[J].中國藥房，2016，27（25）：3539-3541.

[10] 黃羅生，郭健新，劉詠梅，等.HPLC測定阿魏酸含量的探討[J].中成藥，2004，26（2）：50-52.

[11] 李行利，周祖坤.阿魏酸水溶液穩(wěn)定性研究[J].中成藥，1993，15（8）：5-6.

[12] 陳勇，程志勇，韓鳳梅.當歸注射液的質(zhì)量探討[J].湖北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2000，22（3）：278-281.

（編輯：劉 萍）

Study on the Extraction Technology of Phenolic Acids from Anemone altica

YANG Xiaodong，LI Fubing，MEI Jiao，YUAN Hongjia，LIU Xingwen，LI Bo（Dept.of Pharmacy，Chongqing Beibei Traditional Chinese Medicine Hospital，Chongqing 400700，China）

OBJECTIVE：To determine the content of phenolic acids from Anemone altica，and optim ize its extraction technology.METHODS：HPLC was used to determ ine the contents of mono-ferulyl tartaric acid and ferulic acid from A.altica；using the total contents of 2 index components as index，volume fraction of extraction solvent，extraction solvent volume，extraction times and extraction time as factors，orthogonal testwas used to optim ize extraction technology，and verification testwas conducted.RESULTS：The contents of mono-ferulyl tartaric acid and ferulic acid were 0.059%，0.002 5%，respectively；the optimal extraction technology was as follow as 30%ethanol 600 m L added to 20 g medicinalmaterial，extracted tw ice，90min every time.In verification test，the average contents of 2 components in extractwere 0.297 1%（RSD＝3.64%，n＝3），0.004 1%（RSD＝5.11%，n＝3）.CONCLUSIONS：A method for contents determination of mono-ferulyl tartaric acid and ferulic acid from A.altica is established；optim ized extraction technology is stable and feasible.

Anemone altica；Phenolic acids；Mono-ferulyl tartaric acid；Ferulic acid；Content determ ination；Extraction technology；HPLC；Orthogonal test

R284.2

A

1001-0408（2017）13-1848-04

2016-10-13

2017-02-07）

＊副主任中藥師。研究方向：中藥制劑技術(shù)與新藥研究。電話：023-63223413。E-mail：bbyxd@126.com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：中藥飲片鑒別及藥用植物研究。電話：023-68355109

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.34