柴葛退熱散超微粉碎工藝優(yōu)化Δ

劉亮鏡，祁 俊，朱應成，余 靜，張 強（.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖 24000；2.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校藥學院，安徽蕪湖 24003）

柴葛退熱散超微粉碎工藝優(yōu)化Δ

劉亮鏡1＊，祁 俊1，朱應成1，余 靜1，張 強2#（1.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖 241000；2.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校藥學院，安徽蕪湖 241003）

目的：優(yōu)化柴葛退熱散超微粉碎工藝；比較超微粉和普通細粉中有效成分的含量和顯微特征。方法：以柴葛退熱散中3種有效成分（葛根素、甘草苷和黃芩苷）的含量以及粉末d（0.5）為主要指標，以堆密度、休止角及顯微特征為參考指標，設計正交試驗對超微粉碎工藝中粉末的初始粒徑、水分及粉碎頻率進行優(yōu)化。比較超微粉與普通細粉（過65/80目篩）中3種有效成分的含量及顯微鏡下草酸鈣針晶的觀察結果。結果：超微粉優(yōu)化工藝為選擇初始粒徑為過65目篩、水分為2.5%的藥材粉末在粉碎頻率為60Hz下粉碎；驗證試驗中3份超微粉樣品的d（0.5）平均值為31.5μm（RSD＝0.45%，n＝3），其中葛根素、甘草苷和黃芩苷的含量分別為0.232、0.212、8.962mg/g（RSD分別為1.31%、1.62%、0.89%，n＝3），比普通細粉中3種有效成分含量（0.158、0.160、6.140 mg/g）約高30%～40%。超微粉中未見或僅少量可見普通細粉中常見的成束草酸鈣針晶。結論：優(yōu)化的超微粉碎工藝穩(wěn)定、可行；柴葛退熱散超微粉中3種有效成分的含量高于普通粉中含量，且因草酸鈣針晶的減少有可能減少其臨床不良反應。

柴葛退熱散；超微粉；粉碎工藝；正交試驗；高效液相色譜法；葛根素；甘草苷；黃芩苷；含量測定；顯微特征

柴葛退熱散是我院急診科結合《傷寒六書》中柴葛解肌湯和《太平惠民和劑局方》中的升麻葛根湯與十余年230多例患者的臨床療效總結而成的方劑。該方由柴胡、葛根、黃芩、升麻、薄荷、蘆根、甘草、鴨跖草、石膏、知母等10味藥組成，具有清熱解毒、解肌退熱的功效，臨床主要用于惡寒發(fā)熱、頭身疼痛、咽痛煩渴等外感發(fā)熱的治療。與常規(guī)機械粉碎工藝相比，經超微粉碎的藥材粒度更細，粒徑分布更均勻，溶出速率提高[1-2]。筆者采用氣流粉碎機組，通過正交設計研究柴葛退熱散的超微粉碎工藝，以葛根素、甘草苷和黃芩苷3個有效成分含量以及占總粒子量50%的粒子對應的粒徑[d（0.5）]為主要考察指標，優(yōu)化本方制劑的超微粉碎工藝參數(shù)，并比較超微粉與普通細粉中3個有效成分的含量和顯微特征，為本方超微粉研發(fā)及臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XP205電子天平、AE240電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；QYF-260氣流粉碎機組（昆山市超微粉碎機廠）；WKSJ-120粉碎機（青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司）；XDS-300雙目生物顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）；BT-9300H激光粒度分布儀（丹東市百特儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

石膏（安徽省萬生中藥飲片有限公司，批號：130709）；升麻、知母（亳州市中藥飲片廠，批號：1406018171、121001）；黃芩、葛根、柴胡（安徽井泉集團中藥飲片有限公司，批號：20150101、20140601、20140601）；甘草、薄荷（安徽省本草國藥飲片有限公司，批號：140721、141126）；蘆根（亳州蜀中藥業(yè)有限公司，批號：141106）；鴨跖草（亳州市京皖中藥飲片廠，批號：141002），上述藥材均由南京中醫(yī)藥大學藥學院潘揚教授鑒定為真品。

葛根素（批號：110752-201313，純度：95.5%）、甘草苷（批號：111610-201106，純度：93.7%）、黃芩苷對照品（批號：110715-201318，純度：93.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為超純水；水合氯醛、稀甘油固定液按2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定自制。

2 方法與結果

2.1 柴葛退熱散混合細粉制備

按處方規(guī)定比例稱取一定量凈藥材，采用WKSJ-120粉碎機粉碎，分別過50目、65目和80目篩，未過粗末繼續(xù)粉碎至完全通過。據此方法制備超微粉碎工藝考察水平中初始粒度因素下3個水平的樣品。

2.2 粉末休止角的測定

[3]方法，采用固定圓錐底法測定休止角，每個樣品測定3次，取平均值。休止角越小，表明粉末的流動性越好。

2.3 粉末堆密度的測定

參考文獻[3]方法測定堆密度（單位：g/m L）。每個樣品測定3次，取平均值。一定質量的粉末，粒度越小，堆密度越小，流動性更弱。

2.4 粉末d（0.5）的測定

分別取樣品適量，用超純水作分散劑，攪拌均勻后超聲5m in，加入高速循環(huán)樣品池中。在樣品折射率為1.696、介質折射率為1.333、分析模式為單峰模式下測定其d（0.5）。

2.5 粉末顯微特征觀察

查閱相關資料，柴葛退熱散藥材中顯微特征主要為針晶束、方晶、纖維和導管[4]。由于方中知母和鴨跖草中含有草酸鈣針晶，而有報道此針晶具有毒性作用，能夠刺激咽喉產生不良反應[5-7]，因此觀察粉末中的草酸鈣針晶的多少有利于選擇粉碎程度。分別取樣品適量，置于載玻片上，以水合氯醛液透化和稀甘油分別裝片，蓋玻片固定后置于顯微鏡下觀察。

2.6 含量測定

2.6.1 溶液制備 （1）對照品貯備液及混合對照品溶液制備。精密稱取葛根素、黃芩苷和甘草苷對照品適量，加甲醇制備成質量濃度分別為0.668、8.309、0.800mg/m L的對照品貯備液，再稀釋制備成含葛根素26.72μg/m L、黃芩苷332.36μg/m L、甘草苷16.00μg/m L的混合對照品溶液。（2）供試品溶液制備。精密稱取柴葛退熱散約5.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇100m L，稱定質量，水浴回流30m in，放冷，再稱定，用30%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。（3）陰性對照溶液制備。按處方中各藥材的比例制備缺葛根、甘草、黃芩的陰性對照品180 g，再按上述供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.6.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-甲醇（B）-0.1%磷酸（C），梯度洗脫；流速：1.0m L/min；檢測波長：237 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Thegradientelution program

在上述色譜條件下，取“2.6.1”項下混合對照品、陰性對照溶液及2種供試品溶液（分別由普通65目篩細粉樣品及正交試驗中3號超微粉樣品制備而成）進樣分析。結果，葛根素、黃芩苷、甘草苷3個成分峰之間及與相鄰峰之間分離良好，理論板數(shù)以甘草苷計不低于4 000，分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

2.6.3 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液2、3、5、10、15、20μL，分別注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標（y）、進樣量（μg）為橫坐標（x），繪制標準曲線。3種成分的線性關系考察結果見表2。

2.6.4 檢測限、定量限考察 按相關方法進行考察。結果葛根素、甘草苷和黃芩苷的定量限分別為0.668、0.800、1.662 ng（信噪比為10），檢測限分別為0.200、0.240、0.499 ng（信噪比為3）。

2.6.5 精密度、重復性、穩(wěn)定性和準確度考察 按相關方法進行操作，結果精密度考察中3種成分峰面積的RSD均不超過0.21%（n＝6）；重復性考察中3種成分平均含量的RSD均不超過1.8%（n＝6）；24 h內穩(wěn)定性考察中供試品溶液中3種成分峰面積的RSD均不超過1.0%（n＝6）；準確度考察中葛根素、甘草苷和黃芩苷的平均回收率分別為103.1%、100.3%、100.3%（RSD分別為1.0%、1.3%和1.0%，n＝6）。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

表2 3種成分線性關系考察結果Tab 2 Detection results of linear relationships of 3 ingredients

2.6.6 含量測定 取柴葛退熱散普通細粉（通過65目篩）和超微粉，按“2.6.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，分別用外標法計算樣品中葛根素、甘草苷和黃芩苷3個成分的含量。結果，普通細粉中葛根素、甘草苷和黃芩苷的平均含量分別為0.158、0.160、6.140mg/g（RSD分別為1.1%、1.7%、0.2%，n＝3）；超微粉含量測定結果見“2.8”項。

2.7 正交試驗優(yōu)化超微粉碎工藝

2.7.1 因素與水平 根據已完成的預試驗結果，以粉碎后超微粉中葛根素、甘草苷、黃芩苷的含量和d（0.5）的綜合得分為主要指標，另以粉末的流動性（休止角）、堆密度為參考指標，以細粉的初始粒度和水分（水分檢測方法參考文獻[8]）、粉碎頻率為影響因素，各因素設3水平，設計L9（34）正交試驗優(yōu)化超微粉碎工藝（采用氣流粉碎機進行粉碎）。

在綜合得分中，葛根素、甘草苷、黃芩苷的含量和d（0.5）4個指標的權重系數(shù)分別為0.3、0.3、0.3、0.1。由于含量欲求最大值，而d（0.5）則是越小越好，因此需對4項指標進行規(guī)格化：對于欲求最大值的指標，如含量等，其規(guī)格化方程為di＝（Yi－Ymin）/（Ymax－Ymin）；對于欲求最小值的指標，如d（0.5）等，其規(guī)格化方程為di＝（Ymax－Yi）/（Ymax－Ymin）。其中Ymax和Ymin分別為各指標可被接受的最大值和最小值（本試驗中分別取9個試驗的最大值和最小值）[9]。綜合得分＝[某組葛根素規(guī)格化值/最高組葛根素規(guī)格化值×0.3+某組甘草苷規(guī)格化值/最高組甘草苷規(guī)格化值×0.3+某組黃芩苷規(guī)格化值/最高組黃芩苷規(guī)格化值×0.3+某組d（0.5）規(guī)格化值/最高組d（0.5）規(guī)格化值×0.1]×100。

因素與水平見表3。

表3 因素與水平Tab 3 Factorsand levels

2.7.2 正交試驗結果 正交試驗安排及各指標結果見表4，方差分析結果見表5、表6，顯微觀察結果見圖2（80目細粉和正交試驗3號、4號超微粉樣品）。

表4 正交試驗安排與結果Tab 4 Arrangementand resultsoforthogonal test

表5 綜合得分方差分析結果Tab 5 Results of variance analysis for com prehensive scores

表6 d（0.5）方差分析結果Tab 6 Resultsof varianceanalysis for d（0.5）

圖2 超微粉與普通細粉顯微觀察結果Fig 2 The photom icrograph of ultrafine powder and ordinary powder

對綜合得分進行方差分析，結果各因素影響大小為水分（A）＞粉碎頻率（C）＞初始粒度（B）；對d（0.5）進行方差分析，結果因素C影響最大。

經顯微觀察發(fā)現(xiàn)，超微粉與普通細粉比較，超微粉中未見或僅少量可見普通細粉中常見的成束草酸鈣針晶。在正交試驗3號和7號樣品的粉末中均未發(fā)現(xiàn)針晶束，5號樣品中發(fā)現(xiàn)極少量的針晶束，4號樣品可見散在針晶（如圖2D），其余5份均易觀察到針晶束。3號、5號和7號樣品的粉碎頻率均為60Hz，可能在此頻率下樣品因粉碎粒度較小，針晶束被破壞而不能被觀察到。經綜合考慮后確定最優(yōu)工藝為A1B2C1，即藥材水分為2.5%，初始粒徑為過65目篩，粉碎頻率為60 Hz。

2.8 驗證試驗

按優(yōu)化的超微粉碎工藝進行3次驗證試驗。按處方比例稱取30 kg凈藥材3份，先經粉碎機初步粉碎，再按優(yōu)化條件進行超微粉碎，測定粉末各指標，并觀察粉末中草酸鈣針晶。結果，3份粉末d（0.5）平均值為31.5μm（RSD＝0.45%，n＝3），未觀察到或只觀察到少量散在的草酸鈣針晶；葛根素、甘草苷、黃芩苷平均含量分別為0.232、0.212、8.962 mg/g（RSD分別為1.31%、1.62%、0.89%，n＝3）；這提示優(yōu)化的超微粉碎工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

3.1 提取方式的考察

參照2015年版《中國藥典》（一部）中葛根、甘草和黃芩含量測定方法[10]，在前期試驗中曾比較了30%乙醇和70%乙醇為提取溶劑時葛根素、甘草苷和黃芩苷的含量差異，結果采用30%乙醇提取時對含量較低的葛根素和甘草苷提取效果較好，但對黃芩苷影響不大，因此選用30%乙醇為提取溶劑。另外，還比較了超聲和回流兩種提取方式的效果，結果發(fā)現(xiàn)超微粉采用回流提取30m in時3種成分的提取率優(yōu)于超聲提取，綜合考慮選擇30%乙醇回流提取30min。通過回收率試驗證明3個成分均能提取完全，故采用此提取方法作為供試品溶液的制備方法。

3.2 流動相和檢測波長的選擇

查閱文獻[11-14]，同時對葛根素、甘草苷和黃芩苷進行高效液相色譜法測定，以3種成分的分離效果為指標對流動相組成進行了篩選。結果，含甲醇的流動相對甘草苷的分離效果不理想，含乙腈的流動相對黃芩苷的分離效果不好。因此，在分離葛根素和甘草苷時加入少量乙腈以改善甘草苷與鄰峰的分離度；當甘草苷出峰后選擇甲醇-磷酸鹽緩沖液為流動相，最終有效分離了黃芩苷。對柴葛退熱散供試品溶液及3種對照品進行全波長掃描時，為了能在同一色譜圖上反映3種成分，選擇葛根素和甘草苷均有較大吸收的237 nm為檢測波長。

3.3 相關因素水平與指標的選擇

正交設計中3個因素的選擇是根據預試驗以及氣流粉碎機組的性能原理而確定的。由于水分對粉碎工藝影響較大，故在具體操作中，考慮到方中的薄荷含有揮發(fā)性成分，選擇先將除薄荷外的其余方中藥材粉碎，并將此時未干燥的普通粉末的水分7.5%確定為水分因素中最高考察水平。由于薄荷的處方量和含水量較小，對整體水分影響不大，故將薄荷單獨機械粉碎后加入上述粉末中，再進行正交試驗，以最大限度保存有效成分。

本方劑型為散劑，2015年版《中國藥典》對散劑無休止角和堆密度考察的要求。本試驗測定休止角和堆密度主要是為了觀察超微粉粉體學特征變化，為其他如分裝等工藝或改變劑型提供參考，故在正交試驗中未將其列入綜合評價指標中。在4個考察指標中，葛根素、甘草苷、黃芩苷3種成分均為方中主要成分，故權重相同；而d（0.5）可反映粉體中草酸鈣針晶的存在狀態(tài)，由于筆者將對本方中草酸鈣針晶的藥理作用做進一步研究，此試驗不以其為重點指標，因此此指標權重設置較小。

3.4 粉碎粒度的影響

比較超微粉與過65目篩的普通細粉中3種成分的含量，結果發(fā)現(xiàn)超微粉中3種成分含量平均比普通細粉中含量高30%～40%。但正交試驗結果顯示超微粉中葛根素、甘草苷、黃芩苷含量并不隨藥材粉碎粒度的減小而增加，而是存在一個臨界粒徑，加之每味中藥材臨界粒徑不同，故出現(xiàn)了上述結果，即過了臨界粒徑后溶出成分不會隨著粒徑減小而顯著性增加，這與相關文獻[15-16]報道相似。同時這也解釋了d（0.5）方差分析結果中誤差項正常、而綜合得分的方差分析時誤差項較大的現(xiàn)象，提示葛根、甘草和黃芩3味藥材的超微粉碎臨界粒徑存在差異，最終使總體差異并不明顯。因此，對復方藥材粉末的最優(yōu)粒度還需進一步研究。

柴葛退熱散為臨床急診方，對于急診發(fā)熱患者，其發(fā)揮藥效越快越好，而超微粉由于其細胞壁被破碎可增加有效成分的溶出，有利于快速起效，故更適用于急診患者。另外，通過針晶的減少可以預測超微粉碎的粉末有可能會減少直接口服后的不良反應，但該方中知母和鴨跖草所含草酸鈣針晶是否具有刺激性還需進一步研究驗證。綜上，筆者認為，將中藥進行超微粉碎是對臨床急診應用中藥復方的一種有益的補充，可為中藥在急診中的應用提供依據，有利于中藥的現(xiàn)代化。

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Optim ization of Ultrafine Pulverization Technology in Chaige Tuire Powder

LIU Liangjing1，QI Jun1，ZHU Yingcheng1，YU Jing1，ZHANG Qiang2（1.Preparation Division，Wuhu Hospital of Traditional Chinese Medicine，AnhuiWuhu 241000，China；2.School of Pharmacy，Anhui College of Traditional Chinese Medicine，AnhuiWuhu 241003，China）

OBJECTIVE：To optim ize the ultrafine pulverization technology in Chaige tuire powder；to compare the content and microcharacteristics between ultrafine powder and ordinary powder.METHODS：Using contents of 3 active ingredients（puerarin，glycyrrhizin and baicalin）and powder d（0.5）asmain indexes，bulk density，angle of repose and m icrocharacteristic as reference indexes，orthogonal test was designed to optimize the initial particle size，moisture and pulverized frequency in ultrafine pulverization technology.Contents of 3 active ingredients of ultrafine powder and ordinary powder（over 65/80 mesh sieve）and observation results of calcium oxalate crystal underm icroscope were compared.RESULTS：The optim ized technology was as follow as over 65mesh sieve，moisture of 2.5%preliminary powder in 60 Hz of frequency for pulverization.In verification test，d（0.5）average value of 3 ultrafine powder samples was 31.5μm（RSD＝0.45%，n＝3）；contents of puerarin，glycyrrhizin and baicalin were 0.232 mg/g（RSD＝1.31%，n＝3），0.212 mg/g（RSD＝1.62%，n＝3），8.962 mg/g（RSD＝0.89%，n＝3），respectively，which were increased about 30%-40%than in ordinary pow der（0.158，0.156 69，6.140 mg/g）.There were no or little bundles of calcium oxalate crystal that is common in ordinary powder.CONCLUSIONS：Optimized ultrafine pulverization technology is stable and feasible；contents of 3 active ingredients in Chaige tuire ultrafine powder are higher and calcium oxalate crystal are litter than ordinary powder，which possibly reduces the adverse reactions in clinical application.

Chaige tuire powder；Ultrafine powder；Pulverization technology；Orthogonal test；HPLC；Puerarin；Glycyrrhizin；Baicalin；Content determ ination；M icrocharacteristics

R983

A

1001-0408（2017）13-1837-05

2016-08-08

2016-09-18）

（編輯：劉 萍）

蕪湖市科技計劃項目（No.2014hm31）

＊主管中藥師，碩士。研究方向：中藥制劑分析。E-mail：liulj1@ 126.com

#通信作者：講師。研究方向：中藥制劑分析。E-mail：396138270@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.31