拉鏈型脂肽的溫控開(kāi)關(guān)效應(yīng)

王斯佳 李夢(mèng)雅 徐首紅 劉洪來(lái)

拉鏈型脂肽的溫控開(kāi)關(guān)效應(yīng)

王斯佳§李夢(mèng)雅§徐首紅*劉洪來(lái)

(華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，結(jié)構(gòu)可控先進(jìn)功能材料及其制備教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237)

亮氨酸拉鏈型脂肽是由兩條肽鏈以螺旋結(jié)構(gòu)依靠疏水作用并列結(jié)合形成的二聚體，當(dāng)溫度升至其相變溫度時(shí)，其螺旋結(jié)構(gòu)解旋繼而變?yōu)闊o(wú)序鏈狀結(jié)構(gòu)。利用該類脂肽的溫敏性能，本文設(shè)計(jì)、合成得到一組具有溫敏性的拉鏈型脂肽，將其與磷脂混合制備溫敏性脂質(zhì)體。用圓二色譜測(cè)定磷脂雙分子層上脂肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定脂肽-脂質(zhì)體的粒徑及電位；熒光偏振法測(cè)定脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性；采用紫外分光光度計(jì)考察阿霉素(DOX)在37.0、45.0°C下的釋放行為。結(jié)果表明，含有脂肽的脂質(zhì)體具備較好的溫敏性，膽固醇含量、脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性，對(duì)脂肽的溫控開(kāi)關(guān)效應(yīng)有一定的影響。脂肽-脂質(zhì)體作為一種新型的溫敏性藥物載體展現(xiàn)了其較好的應(yīng)用前景。

亮氨酸；拉鏈型脂肽；脂質(zhì)體；溫敏性；藥物載體

1 引言

脂質(zhì)體由于其具備良好的生物相容性和被動(dòng)靶向性，從而被廣泛用作于藥物載體1－3。然而，傳統(tǒng)的脂質(zhì)體可以通過(guò)各種途徑進(jìn)入血液循環(huán)，這大大降低了藥物的功效，并且增加了其對(duì)健康組織及器官的危害性。因此，為了克服傳統(tǒng)脂質(zhì)體的這些缺點(diǎn)，近年來(lái)，研究者對(duì)傳統(tǒng)脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，得到了一些新型的脂質(zhì)體，如光敏感脂質(zhì)體4,5，pH敏感脂質(zhì)體6,7及溫度敏感脂質(zhì)體8,9等。

腫瘤的治療是醫(yī)藥界關(guān)注的重點(diǎn)之一10－13。傳統(tǒng)化療法不能實(shí)現(xiàn)高效的局部治療，對(duì)健康的細(xì)胞或組織也會(huì)造成不同程度的損害。然而溫度敏感脂質(zhì)體可以在局部受熱部位實(shí)現(xiàn)快速釋藥，從而具備了熱靶向性，進(jìn)而提高藥物的利用率。于是，本文旨在設(shè)計(jì)研究新型的溫度敏感脂質(zhì)體，將其與腫瘤熱療相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)更強(qiáng)的靶向性及控釋特性，以提高腫瘤治療效果。

亮氨酸拉鏈肽14是由特定的氨基酸序列組成，亮氨酸在每7個(gè)氨基酸中出現(xiàn)一次。在一定的溫度條件下其可以形成一個(gè)超螺旋盤繞線圈，并通過(guò)疏水作用力結(jié)合而成二聚體的立體結(jié)構(gòu)。當(dāng)升高溫度至其熔融溫度時(shí)，盤旋的線圈發(fā)生解離，形成無(wú)序的肽單體15,16。亮氨酸拉鏈肽響應(yīng)熱的構(gòu)型變化的性質(zhì)使其成為修飾溫度敏感脂質(zhì)體的一個(gè)備受關(guān)注的組分17。

本文設(shè)計(jì)、合成得到三種具備螺旋結(jié)構(gòu)的雙親性脂肽：C6-28AA(Lp1)，C10-28AA(Lp2)和C8-30AA(Lp3)，并將其與磷脂混合制備得到新型的溫度敏感脂質(zhì)體(Lp-Lipo)(示意圖1)。研究它們?cè)?5.0及37.0°C條件下，包裹抗癌藥物阿霉素的藥物釋放行為；同時(shí)，研究脂質(zhì)體不同膽固醇含量對(duì)脂肽溫敏性及釋藥情況的影響，進(jìn)而得到一種具有最佳抗癌效果的新型溫度敏感的藥物載體。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

自行設(shè)計(jì)的亮氨酸拉鏈型脂肽(Lp1:CH3-(CH2)4-CO-NH-VAQLEVK-VAQLESKVSKLESKVSSLESK-COOH,Lp2:CH3-(CH2)8-CO-NH-VAQLE VK-VAQLESKVSKLESK-VSSLESK-COOH,Lp3: CH3-(CH2)6-CO-NH-AS-VAQLEVK-VAQLESKVSK ESK-VSSLESK-COOH,＞95%，杰肽生物有限公司)；二硬脂酰基磷脂酰膽堿(DSPC，＞98%，Lipoid公司)，二棕櫚酰磷酯酰乙醇胺(DPPE，＞98%，Lipoid公司)；二油?；字Ｄ憠A(DOPC，＞98%，Sigma-Aldrich公司)；陽(yáng)離子膽固醇(Chol，＞98%，Avanti公司)；三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl，＞98%，Aladdin公司)；葡聚糖(G-50，＞95%)，阿霉素(DOX，＞98%)和1,6-二苯基-

示意圖1 脂肽的結(jié)構(gòu)及脂肽-脂質(zhì)體的溫控釋藥性能Scheme 1 Structure of Lp and thermo-controlled drug release of Lp-Lipo 1,3,5-己三烯(DPH，＞98%)購(gòu)于百靈威科技有限公司；甲醇、氯仿等分析級(jí)別的溶劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2.2 脂質(zhì)體的制備

單純脂質(zhì)體與磷脂/脂肽的混合脂質(zhì)體均利用薄膜分散法制備。首先，將一定比例的DSPC、DPPE、DOPC和Chol溶于氯仿/甲醇(體積比為2:1)的混合溶液，并加入至250 mL的圓底燒瓶中；若制備的是混合脂質(zhì)體，需在該混合溶液中加入脂肽。然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1001，上海愛(ài)朗儀器有限公司)將溶劑除去，得到脂質(zhì)薄膜。加入5 mL的Tris-HCl緩沖溶液(10 mmol·L－1，pH=7.4)，48.0°C條件下利用超聲儀(KQ-100TDB，昆山市超聲儀器有限公司)超聲30 min得到濃度6 mmol·L－1的脂質(zhì)體樣品。最終，利用含有200 nm聚碳酸酯濾膜的擠壓器(LiposoFast-Basic，Avestin，加拿大)對(duì)樣品進(jìn)行11次過(guò)濾，最終得到粒徑小于200 nm且分布均勻的樣品。

2.3 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)

脂質(zhì)體樣品的粒徑、多分散指數(shù)及表面電荷均利用動(dòng)態(tài)光散射(Zetasizer Nano-ZS，馬爾文，英國(guó))測(cè)量得到，其中多分散指數(shù)反映了粒徑分布的集中程度。

2.4 透射電子顯微鏡(TEM)

將20 μL磷鎢酸附染后的脂質(zhì)體樣品加入至銅網(wǎng)上，待樣品烘干后，采用透射電子顯微鏡(JEM-1400，JEOL，日本)對(duì)樣品進(jìn)行觀察測(cè)量。

2.5 圓二色譜(CD)

圓二色譜是利用分光光度計(jì)(Chirascan，Applied Photophysics Ltd，英國(guó))來(lái)測(cè)量多肽類物質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)18,19，其中含有一個(gè)熱電溫度控制系統(tǒng)。利用圓二色譜對(duì)含有脂肽的混合脂質(zhì)體(脂肽濃度固定為50 μmol·L－1)樣品進(jìn)行了一系列不同溫度下的構(gòu)象測(cè)量。將含有脂肽的樣品加入至規(guī)格為2 mm的石英比色皿，掃描范圍設(shè)定為260至190 nm，以1°C·min－1的速率從20.0°C升溫至70.0°C，每增加2.0°C記錄一次數(shù)據(jù)，得到最終的響應(yīng)溫度變化的圓二色譜圖。嵌入在脂質(zhì)體上的脂肽的相變溫度Tm通過(guò)光物理學(xué)軟件Glob3分析計(jì)算得到。

2.6 熒光各向異性

選擇疏水性分子1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)作為熒光探針以檢測(cè)磷脂雙分子層的流動(dòng)性20,21。配置溶液濃度為2×10－7mol·L－1的DPH溶液，將其以n(lipids):n(DPH)=800:1的質(zhì)量比與脂質(zhì)體混合得到混合溶液，并將其放置于常溫下攪拌12 h。DPH熒光探針在脂質(zhì)體上的各向異性通過(guò)熒光光度計(jì)(LS-55，PerkinElmer，美國(guó))來(lái)測(cè)量。選擇激發(fā)波長(zhǎng)360 nm、發(fā)射波長(zhǎng)430 nm，且狹縫寬度均為10 nm進(jìn)行測(cè)量，其中溫度是通過(guò)一個(gè)連接的恒溫水浴來(lái)控制，測(cè)量從20.0°C進(jìn)行到70.0°C，每隔5.0°C記錄一次測(cè)量數(shù)據(jù)。最終的各向異性值是通過(guò)以下方程計(jì)算得到22,23：

其中，r代表各向異性。熒光發(fā)射強(qiáng)度定義為i，其下標(biāo)vv和vh分別代表激發(fā)偏振片與發(fā)射偏振片各自的方向。其中，G是一個(gè)矯正儀器偏振度的因子，定義為ihv/ihh。

2.7 阿霉素的裝載及釋放

包裹抗癌藥物阿霉素的脂質(zhì)體是通過(guò)硫酸銨梯度法制備得到。制備方法與2.2節(jié)類似，其中緩沖溶液變?yōu)榱蛩徜@溶液(200 mmol·L－1)；經(jīng)水化得到脂質(zhì)體樣品后，利用生理鹽水溶液對(duì)其進(jìn)行透析10次后，將其與一定量的阿霉素溶液(2.5 mg· mL－1)混合至50°C下孵化45 min，然后利用凝膠過(guò)濾的方法將未被包裹的阿霉素除去，得到裝載阿霉素的脂質(zhì)體。其中，分別取200 μL的未過(guò)濾和已過(guò)濾后的樣品與等量的曲拉通溶液加入至5 mL容量瓶定容后得到混合溶液，高溫下超聲30 min后，利用紫外分光光度計(jì)(UV)(UV-2450，島津，日本)測(cè)量?jī)烧呷芤涸?85 nm處的紫外吸收值，分別為A0、A1。阿霉素的包封率即為A1/A0，本研究的包封率均在80%(w)以上。

阿霉素的釋放實(shí)驗(yàn)是在37.0與45.0°C下進(jìn)行的。取定量的樣品放置于截留量為3500的透析袋中，外圍放置25倍體積的Tris-HCl緩沖溶液且控溫。每隔1 h，取3 mL的透析液，利用UV測(cè)量其在485 nm處的吸收值，記為At，24 h后停止測(cè)量，且每次測(cè)量結(jié)束后將透析液倒置于原處。阿霉素的累積釋放率為At/A1。

3 結(jié)果與討論

3.1 脂肽-脂質(zhì)體的物性

以n(DSPC):n(DPPE):n(Chol)=2:0.1:1的比例混合制備得到空白脂質(zhì)體Lipo，以n(lipid): n(lipopeptide)=100:1的比例分別加入三種脂肽Lp1、Lp2及Lp3制備得到脂肽-脂質(zhì)體Lp-Lipo。利用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量四種脂質(zhì)體的粒徑、分散系數(shù)及其表面電荷，如表1所示。結(jié)果顯示，脂質(zhì)體的粒徑均在200 nm左右，說(shuō)明脂肽的加入并不會(huì)影響脂質(zhì)體的粒徑分布，且較小的多分散指數(shù)(PDI)值證明其粒徑分布較為均一。同時(shí)，由于陽(yáng)離子膽固醇的存在，使脂質(zhì)體表面均帶有50 mV左右的正電荷。為了更加直觀地觀察脂質(zhì)體的真實(shí)形貌及大小，利用透射電鏡對(duì)其進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1(b)所示。從圖中可以看出，脂質(zhì)體是以球狀結(jié)構(gòu)存在的，且粒徑大小約200 nm，結(jié)果與DLS結(jié)果一致(圖1(a))。

3.2 脂肽-脂質(zhì)體的溫敏性

利用圓二色譜，測(cè)定嵌在磷脂雙分子層上的脂肽隨溫度變化的構(gòu)象變化。如圖2所示，三種脂肽在20.0°C下的圓二譜圖，均具備192 nm的正峰及208、222 nm處的負(fù)峰，這是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)，說(shuō)明常溫下，在脂質(zhì)體雙層膜中的三種脂肽均以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在。隨著溫度的升高，脂肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；對(duì)于Lp1-Lipo與Lp3-Lipo，當(dāng)溫度升高至70.0°C時(shí)，其螺旋含量大大降低，向無(wú)規(guī)卷曲狀轉(zhuǎn)變，其相變溫度Tm由分析軟件

表1 脂質(zhì)體的粒徑、分布系數(shù)及其表面電位Table 1 Diameters,polydispersity index and

zeta-potentials of liposomes

Liposome Lipo

Lp1-Lipo Lp2-Lipo Lp3-Lipo d/nm 192.5 188.7 186.6 193.8 Zeta/mV

圖1 脂質(zhì)體的粒徑分布(a)及TEM圖(b)Fig.1 Size distribution(a)and transmission electron mictroscopy(TEM)images(b)of liposomes

55.1 56.0 46.5 48.7 PDI:polydispersity PDI 0.121 0.142 0.156 0.129 Global 3計(jì)算得到，分別為45.5、45.0°C；對(duì)于Lp2-Lipo，從圖2(b)可以看出，即使在高溫條件下，Lp2依然保持螺旋狀態(tài)，此時(shí)計(jì)算得到的溫度45.4°C并不代表其真正的相變溫度。對(duì)比Lp1-Lipo與Lp2-Lipo發(fā)現(xiàn)，烷烴鏈的增長(zhǎng)，大大增加了脂肽螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而影響了其相變行為；對(duì)于Lp2-Lipo與Lp3-Lipo，將兩個(gè)烷烴變?yōu)閮蓚€(gè)氨基酸(丙氨酸與絲氨酸)，降低了脂肽的穩(wěn)定性，使得Lp3-Lipo在高溫下發(fā)生了更為徹底的相變。所以，烷烴鏈的長(zhǎng)短以及氨基酸的端基修飾均會(huì)影響脂肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，烷烴鏈越長(zhǎng)，脂肽的螺旋結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定24,25；同時(shí)，在N端修飾丙氨酸與絲氨酸，會(huì)大大降低脂肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而使其具有更好的溫敏性能。

3.3 脂肽-脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性

為了更好地理解磷脂分子與脂肽之間的相互作用，選擇DPH作為熒光探針，測(cè)定脂肽-脂質(zhì)體隨溫度變化的脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性。由于DPH為疏水性分子，所以測(cè)量得到的結(jié)果顯示了磷脂雙分子層疏水部分的擾動(dòng)。結(jié)果如圖3所示，無(wú)論是空白脂質(zhì)體還是脂肽-脂質(zhì)體，其各向異性值均隨著溫度的升高而降低，且在52.0°C附近出現(xiàn)了最為顯著的變化，這是因?yàn)樵诖藴囟确秶?，磷脂分子發(fā)生了凝膠態(tài)向液晶態(tài)的轉(zhuǎn)變26。對(duì)比圖3中的四條曲線，發(fā)現(xiàn)，在低于脂質(zhì)體的相變溫度時(shí)，脂肽的加入對(duì)脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性影響不大；而隨著溫度的升高，脂肽的作用就突顯出來(lái)：Lp1與Lp3的加入增加了膜的流動(dòng)性，而Lp2的加入大大提高了膜的穩(wěn)定性。正如3.2節(jié)中所述，由于Lp1與Lp3在升溫過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，從而導(dǎo)致其對(duì)磷脂分子的擾動(dòng)，進(jìn)而增加了膜的流動(dòng)性；相反，由于Lp2疏水端較長(zhǎng)的烷烴鏈，導(dǎo)致其二級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，即使在高溫條件下結(jié)構(gòu)也基本不發(fā)生改變，從而抑制了周圍磷脂分子的流動(dòng)，增加了脂質(zhì)體膜的穩(wěn)定性。

圖2 Lp1-Lipo(a),Lp2-Lipo(b)及Lp3-Lipo(c)隨溫度變化的構(gòu)象變化Fig.2 Temperature-dependent conformational changes of Lp1-Lipo(a),Lp2-Lipo(b)and Lp3-Lipo(c)

圖3 DPH在空白脂質(zhì)體及脂肽-脂質(zhì)體中隨溫度變化的各向異性值Fig.3 Fluorescence anisotropy of DPH in Lipo and Lp-Lipo measured as a function of temperature

3.4 脂肽-脂質(zhì)體的體外模擬釋藥

利用硫酸銨梯度法將抗癌藥物阿霉素包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，包封率可達(dá)80%(w)。通過(guò)測(cè)量四種脂質(zhì)體在37.0與45.0°C下阿霉素的累積釋放量，研究脂質(zhì)體膜上脂肽的溫敏性能。如圖4所示，37.0°C時(shí)，無(wú)論是空白脂質(zhì)體還是脂肽-脂質(zhì)體，釋放量均較小，保持在10%(w)左右，這是因?yàn)榇藴囟认碌闹姆肿颖３致菪Y(jié)構(gòu)，磷脂分子也處在凝膠態(tài)，且大量膽固醇的存在，均會(huì)使得脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，從而造成較少量的藥物的泄漏。但是對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Lp3-Lipo的藥物泄漏量略大于空白脂質(zhì)體，而Lp2-Lipo的藥物泄漏量略小于空白脂質(zhì)體，此結(jié)果與3.3節(jié)中膜的流動(dòng)性相一致。37.0°C下Lp3的加入降低了膜的穩(wěn)定性，相反Lp2卻提高了膜的穩(wěn)定性，這證明了在低溫時(shí)，藥物阿霉素的泄漏只與脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性有關(guān)。而45.0°C時(shí)，脂肽-脂質(zhì)體的累計(jì)釋放量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于空白脂質(zhì)體，這說(shuō)明在溫?zé)釛l件下，脂肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，螺旋結(jié)構(gòu)的解離，在脂質(zhì)體膜上形成孔道，從而大大提高藥物的釋放，證明了脂肽具有溫敏性。對(duì)比三種脂肽-脂質(zhì)體的釋藥情況發(fā)現(xiàn)，正如圖2的圓二色譜結(jié)果所示，由于Lp2的疏水尾鏈烷烴鏈最長(zhǎng)，疏水作用力過(guò)大，使得其兩條肽鏈很難發(fā)生相變而分離，從而導(dǎo)致其溫敏性較差，最終導(dǎo)致其作用在脂質(zhì)體上的藥物釋放最少；而其中Lp3的溫敏性最好，Lp1次之，最終導(dǎo)致溫?zé)釛l件下Lp3-Lipo的藥物釋放量最大且最快。以上結(jié)果證明了在45.0°C條件下，脂肽-脂質(zhì)體的藥物釋放主要依賴于雙層膜中嵌入的脂肽的溫敏性。綜上，脂肽-脂質(zhì)體具備良好的溫敏性釋藥效果，其中Lp3-Lipo效果最佳，展現(xiàn)了其作為一種新型的溫敏性藥物載體的良好的應(yīng)用潛能。

3.5 膽固醇對(duì)脂肽-脂質(zhì)體釋藥性能的影響

膽固醇在生物膜中起著至關(guān)重要的作用，其具有雙親性，不僅可以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，而且與磷脂具備良好的相容性，從而起到調(diào)節(jié)脂質(zhì)體膜流動(dòng)性與通透性的作用，被稱為脂質(zhì)體膜的“緩沖劑”27,28。為了研究膽固醇含量對(duì)脂質(zhì)體膜性能和脂肽溫敏性能的影響，研究了摩爾比n(lipid): n(Chol)為8:1，4:1及2:1條件下的Lp-Lipo的體外釋藥情況。

圖4 空白脂質(zhì)體及脂肽-脂質(zhì)體在37.0及45.0°C條件下的釋藥動(dòng)力學(xué)Fig.4 Drug release dynamic of Lipo and Lp-Lipo at 37.0 and 45.0°Csolid:45.0°C,hollow:37.0°C

圖5 45.0°C條件下DPH在含有不同膽固醇含量的脂肽-脂質(zhì)體中的各向異性值Fig.5 Fluorescence anisotropy of DPH in Lp-Lipo with different amounts of Chol at 45.0°C

圖6 膽固醇含量(n(Lipids):n(Chol)=8:1/4:1/2:1)對(duì)三種脂肽-脂質(zhì)體的釋藥動(dòng)力學(xué)的影響Fig.6 Drug release dynamic of Lp-Lipo containing different amounts of Chol(n(Lipids):n(Chol)=8:1/4:1/2:1) solid:45.0°C,hollow:37.0°C

表2 脂肽-脂質(zhì)體在37.0和45.0°C條件下24 h的藥物累積釋放量Table 2 Total release percentage of DOX from various Lp-Lipo at 37 and 45.0°C over 24 h

圖5顯示了在45.0°C條件下不同膽固醇含量的脂質(zhì)體加入三種脂肽后的各向異性值。首先，從圖中可以看出，當(dāng)n(lipid):n(Chol)為8:1和4:1時(shí)，其膜的流動(dòng)性基本不變，而當(dāng)膽固醇含量增加至n(lipid):n(Chol)=2:1時(shí)，各向異性值有較大程度的增加，說(shuō)明在該實(shí)驗(yàn)條件下，膽固醇含量增加至一定量時(shí)，才會(huì)對(duì)脂質(zhì)體膜起到穩(wěn)定的作用。然后對(duì)比每種膽固醇含量下的三種脂肽-脂質(zhì)體的各向異性，發(fā)現(xiàn)，Lp2相較于Lp1與Lp3，具有穩(wěn)定膜的功能，原因如3.2節(jié)中所述，Lp2在脂質(zhì)體中發(fā)生相變后引起的自身空間結(jié)構(gòu)變化最小，溫敏性最差，所以造成的擾動(dòng)最小，抑制了磷脂分子的運(yùn)動(dòng)?？傮w而言，不同的脂肽分子，在不同含量的膽固醇的影響下，溫?zé)釛l件下會(huì)發(fā)生不同程度的構(gòu)象變化，從而對(duì)磷脂分子的熱運(yùn)動(dòng)造成不同的影響。

為了更加直觀地分析膽固醇含量對(duì)于脂肽-脂質(zhì)體的溫敏性釋藥的影響，分別測(cè)定了三種膽固醇含量的三種脂肽-脂質(zhì)體的釋藥動(dòng)力學(xué)，結(jié)果如圖6所示。表2列出了其在37.0與45.0°C下24 h后的藥物累積釋放量。首先，無(wú)論是何種組分的脂質(zhì)體，45.0°C下的釋藥量均大于37.0°C的，這證明了三種脂肽均具有較好的溫敏性能，且溫敏性能較為穩(wěn)定。然后對(duì)比不同膽固醇含量的脂質(zhì)體之后，發(fā)現(xiàn)，n(Lipids):n(Chol)為4:1時(shí)的藥物釋放量均最大，與何種脂肽無(wú)關(guān)。對(duì)于n(Lipids): n(Chol)為2:1而言，正如圖5所示，膽固醇的增加，大大提高了脂質(zhì)體膜的穩(wěn)定性，一方面，會(huì)使得脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)更加致密，減少藥物的釋放；另一方面，過(guò)于穩(wěn)定的膜，會(huì)阻礙脂肽在溫?zé)釛l件下的雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋和分離，從而導(dǎo)致藥物釋放減少。而對(duì)于n(Lipids):n(Chol)為8:1而言，膽固醇分子較少，在溫?zé)釛l件下，磷脂分子的熱運(yùn)動(dòng)不會(huì)受到過(guò)多的限制，所以當(dāng)脂肽螺旋結(jié)構(gòu)解旋，雙鏈分離開(kāi)形成孔道時(shí)，可能會(huì)因?yàn)橹車字肿拥囊琢鲃?dòng)性而彌補(bǔ)孔道，從而導(dǎo)致藥物的釋放相對(duì)較低。顯然，n(Lipids):n(Chol)為4:1時(shí)，膽固醇作為脂質(zhì)體的流動(dòng)緩沖劑，既可以限制磷脂分子的劇烈運(yùn)動(dòng)，又不會(huì)阻礙脂肽分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。所以，當(dāng)n(Lipids):n(Chol)為4:1時(shí)，有利于脂肽實(shí)現(xiàn)其最佳的溫敏性能。綜合以上結(jié)果分析得到，無(wú)論是脂肽分子的溫敏性(分子結(jié)構(gòu)影響)，還是脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性(膽固醇含量影響)，都會(huì)影響脂肽-脂質(zhì)體的藥物釋放；當(dāng)n(Lipids):n(Chol)為4:1，且選擇Lp3脂肽，得到的脂肽-脂質(zhì)體具有最佳的溫敏性，可以實(shí)現(xiàn)最大最快的藥物釋放。

4 結(jié)論

設(shè)計(jì)了一系列的具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的雙親性脂肽Lp1，Lp2及Lp3，在溫?zé)釛l件下，脂肽可以由雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋為無(wú)規(guī)則卷曲狀的單鏈，從而使其具備良好的溫敏性能。將這一系列脂肽與磷脂混合制備得到的脂肽-脂質(zhì)體，一定的溫?zé)釛l件下，利用脂肽的溫敏性在脂質(zhì)體膜上形成孔道，從而實(shí)現(xiàn)所載藥物的釋放。研究結(jié)果表明，Lp3具備最佳的溫敏性能，同時(shí)n(Lipids):n(Chol)比為4:1時(shí)，更有利于脂肽分子溫敏性的實(shí)現(xiàn)，得到的脂肽-脂質(zhì)體可以實(shí)現(xiàn)最大最快的藥物釋放，這說(shuō)明脂肽分子的結(jié)構(gòu)以及脂質(zhì)體膜的性質(zhì)均會(huì)影響脂肽的溫控開(kāi)關(guān)效應(yīng)，進(jìn)而影響脂肽-脂質(zhì)體的溫敏性釋藥行為。脂肽-脂質(zhì)體作為一種新型的藥物載體，具有較好的發(fā)展應(yīng)用前景。且該研究也為設(shè)計(jì)新型的溫敏性藥物載體提供了良好的理論基礎(chǔ)。

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Thermo-Controlled On-Off Switch of Zipper-Structured Lipopeptides

WANG Si-Jia§LI Meng-Ya§XU Shou-Hong*LIU Hong-Lai
(Key Laboratory for Advanced Materials and Institute of Fine Chemicals of the Education Ministry of China,College of Chemistry and Molecular Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,P.R.China)

The leucine zipper lipopeptide is a dimer composed of two lipopeptides with α-helical structures that interact through hydrophobic forces.When heated to its phase transition temperature,the helixes unwind and form a disordered conformation.Based on the thermo-sensitivity of these leucine zipper lipopeptides,we designed and synthesized a series of zipper-structured lipopeptides and then mixed them with lipids to form thermo-sensitive hybrid liposomes.Circular dichroism was used to investigate the secondary structure of the lipopeptides anchored in the liposomal bilayer.Dynamic light scattering measurements were used to assess the diameters and zeta potentials of the liposomes.Fluorescence polarization was measured to study the fluidity of the liposomal bilayer.An ultraviolet spectrophotometer was used to stimulate Doxorubicin(DOX)release in vitro at 37.0 and 45.0°C.We found that Lp-Lipo(hybrid of lipopeptide and liposome)displayed higher thermosensitivity than pure liposome.The cholesterol content and fluidity of the liposomal bilayer affected the thermocontrolled on-off switch of the lipopeptides.Lp-Lipo shows great potential as a novel thermo-sensitive drug carrier.

Leucine;Zipper-structured lipopeptide;Liposome;Thermo-sensitivity;Drug carrier

.Email:xushouhong@ecust.edu.cn;Tel:+86-21-64251942.

§These authors contributed equally.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21276074).國(guó)家自然科學(xué)基金(21276074)資助項(xiàng)目

O647

10.3866/PKU.WHXB201701062

Received:December 12,2016;Revised:January 6,2017;Published online:January 6,2017.*