蝴蝶蘭小麻雀的組培快繁技術(shù)

漆子鈺+陳俊暉++林志剛 許麗秋 楊毅燕++吳沙沙+翟俊文+彭東輝

摘要：以蝴蝶蘭小麻雀花梗為外植體培養(yǎng)成的原球莖為材料，研究不同培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑和外源添加物對其增殖、分化和壯苗生根的影響。結(jié)果表明，原球莖增殖的最佳配方為1/2 MS+8.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L蛋白胨+25 g/L 蔗糖+5.2 g/L瓊脂，增殖系數(shù)最高（2.62）；原球莖分化的最佳配方為2.0 g/L花寶1號+0.2 mg/L 6-BA+01 mg/LNAA+100 mL/L椰汁+25 g/L蔗糖+5.2 g/L瓊脂，分化率100%，平均葉片數(shù)為3.54張/株，平均株高 4.04 cm；最適合蝴蝶蘭根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為2.0 g/L花寶1號+1.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+100 mg/L香蕉+25 g/L蔗糖+5.2 g/L瓊脂，在該培養(yǎng)基上生根率100%，生根數(shù)最多（3.52條），平均根長最長（35.37 mm）。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；原球莖；組織培養(yǎng)；培養(yǎng)基；正交設(shè)計

中圖分類號： S682.2+90.4+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0035-04

蝴蝶蘭屬蘭科（Orchidaceae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）的附生蘭，于1750年被發(fā)現(xiàn)，原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶[1]，因花朵的形狀酷似蝴蝶而得其名，別稱蝶蘭[2]。蝴蝶蘭花大色艷，可連續(xù)觀賞2～3個月，因此很容易吸引大眾的眼球。它與卡特蘭、萬代蘭、石斛蘭并稱為四大觀賞蘭，素有“蘭花皇后”之美稱[3]，具有極高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。

小麻雀是福建漳州鉅寶生物科技有限公司培育的蝴蝶蘭新品種，花徑5.5 cm，花葶高35 cm，花朵數(shù)在12朵/枝以上，屬黃色系品種。其唇瓣為胭脂紅，分枝多，與傳統(tǒng)蝴蝶蘭品種相比，花期長，達3～5個月，更加嬌小，并且具香味，觀賞性強，非常適合辦公桌擺放。本試驗以蝴蝶蘭小麻雀的原球莖為試驗材料，選用MS或花寶1號基本培養(yǎng)基，加入少量激素和外源添加物，對其增殖、分化、生根培養(yǎng)等方面進行研究，探索出蝴蝶蘭小麻雀組培苗繁殖的最佳生長條件，以期提高生產(chǎn)效率，降低培養(yǎng)成本，提高蝴蝶蘭小麻雀的市場競爭力。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用蝴蝶蘭小麻雀無菌原球莖由漳州鉅寶生物科技有限公司提供。

1.2試驗方法

1.2.1增殖培養(yǎng)

以增殖4次、[JP2]不帶葉的蝴蝶蘭原球莖為材料，采用L9（34）正交試驗設(shè)計[3]研究不同濃度MS基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、蛋白胨對蝴蝶蘭原球莖增殖培養(yǎng)的影響。添加25 g/L蔗糖和5.2 g/L瓊脂，每瓶接種3個原球莖，每個處理接種10瓶，3次重復(fù)。在光照時間12 h/d、光照度 1 000～1 500 lx、溫度（25±2） ℃下。培養(yǎng)45 d，統(tǒng)計增殖系數(shù)。[JP]

1.2.2分化培養(yǎng)

以原球莖為材料，誘導(dǎo)蝴蝶蘭小麻雀植株的分化。采用L9（34）正交試驗研究不同濃度基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA和椰汁對蝴蝶蘭種苗分化培養(yǎng)的影響（表1）。每瓶接種3個原球莖，每個處理接種10瓶，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同“1.2.1”節(jié)，培養(yǎng) 45 d后統(tǒng)計葉片數(shù)、生根數(shù)，測量株高、葉長、葉寬。

1.2.3生根培養(yǎng)

取長勢整齊、健壯且尚未生根的組培苗為材料，采用L9（34）正交試驗研究不同濃度基本培養(yǎng)基、NAA、6-BA和香蕉對蝴蝶蘭種苗生根培養(yǎng)的影響。每瓶接種3個材料，每個處理接種10瓶，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同“1.2.1”節(jié)，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根數(shù)、生根率，測量根長，篩選出適合蝴蝶蘭小麻雀生根培養(yǎng)基。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2010軟件計算平均值，SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析（general linear model procedures）和多重比較（student-newman-keuls）。各指標計算公式為：增殖系數(shù)=增殖后芽數(shù)/接種外植體數(shù)[4]；平均葉片數(shù)=植株葉片總數(shù)/總株數(shù)；平均生根數(shù)=生根根數(shù)/生根不定芽數(shù)；生根誘導(dǎo)率=生根株數(shù)/接種株數(shù)×100%；平均根長=所有植株總根長/總株數(shù)[5]。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理對蝴蝶蘭原球莖增殖的影響

對9個正交處理組進行極差分析可知，A-6（1/2MS+8.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L蛋白胨）增殖系數(shù)最高，為262，A-1（MS+2.0 mg/L 6-BA）增殖系數(shù)最低，僅為1.33（表2）。由極差分析可知，基本培養(yǎng)基對增殖系數(shù)的影響較大，NAA濃度對增殖系數(shù)影響較小，4種因素對增殖系數(shù)的影響表現(xiàn)為基本培養(yǎng)基>6-BA濃度=蛋白胨濃度>NAA濃度。最適宜的蝴蝶蘭小麻雀增殖的處理組合為1/4MS+8.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 g/L蛋白胨。通過組間效應(yīng)檢驗可知，基本培養(yǎng)基（P=0002）、6-BA濃度（P=0.004）、蛋白胨濃度（P=0.007）對原球莖增殖系數(shù)的影響極顯著，NAA濃度（P=0.277>0.05）對原球莖增殖系數(shù)的影響不顯著。原球莖增殖形態(tài)如圖1-A所示。

基本培養(yǎng)基、6-BA濃度和蛋白胨濃度對原球莖增殖培養(yǎng)的增殖系數(shù)的影響差異較大。MS與1/2 MS差異顯著（P=0.029<005），MS與1/4 MS差異極顯著（P=0.001<0.01），1/2MS、1/4MS間差異不顯著（P=0.177>0.05）?？梢?，低濃度的無機鹽有利于原球莖的增殖，當濃度高于1/2MS時對原球莖增殖產(chǎn)生抑制作用。2.0 mg/L 6-BA處理與 8.0 mg/L 6-BA處理差異極顯著（P=0.003<0.01），5.0 mg/L 6-BA處理與8.0 mg/L 6-BA處理差異顯著（P=0.022<0.05），2.0 mg/L 6-BA處理與5.0 mg/L 6-BA處理差異不顯著（P=0.496>0.05）。說明在一定范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度升高，有利于原球莖增殖。0 g/L蛋白胨與 0.5 g/L 蛋白胨差異極顯著（P=0.001<0.01），0 g/L蛋白胨處理與1.0 g/L蛋白胨差異顯著（P=0.012<0.05），0.5 g/L 蛋白胨處理與1.0 g/L蛋白胨差異不顯著（P=0.365>005），說明蛋白胨的參與對增殖有著明顯影響，且在一定范圍內(nèi)低濃度的蛋白胨有利于原球莖增殖。

2.2不同處理對蝴蝶蘭分化的影響

類原球莖增殖后，轉(zhuǎn)入含有適當植物生長調(diào)節(jié)劑的分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)類原球莖分化和植株再生（圖1-B）。蝴蝶蘭原球莖接種12 d后肉眼可見嫩綠色的新葉和綠色有絨毛的根。蝴蝶蘭分化階段，各處理葉長、葉寬無較大差異，其中第2組值最大，葉長4.99 cm，葉寬1.45 cm；第4組值最小，葉長4.44 cm，葉寬1.23 cm。9組處理原球莖都出現(xiàn)了分化現(xiàn)象，但生長情況不一，在后期生長過程中，B-1的葉片數(shù)最多，為3.63張；其次為B-8，平均葉片數(shù)為3.54張，葉片數(shù)最少的為B-7（2.68張）；平均株高最高為B-2組（4.17 cm），其次為B-8（4.04 cm），B-4組株高最低（3.21 cm）；而B-8的生根率和生根數(shù)均表現(xiàn)為最好，生根率達97.78%，生根數(shù)為2.2條（表3）。

通過組間效應(yīng)檢驗可知，NAA濃度（P=0.000<0.01）對葉片數(shù)影響極顯著，基本培養(yǎng)基（P=0.182>0.05）、6-BA濃度（P=0.735>0.05）、椰汁濃度（P=0.144>0.05）對葉片數(shù)的影響不顯著；NAA濃度（P=0.008<0.01）對株高影響極

顯著，基本培養(yǎng)基（P=0.032<0.05）對株高影響顯著，6-BA濃度（P=0.069>0.05）、椰汁濃度（P=0.136>0.05）對葉片數(shù)的影響不顯著；NAA濃度（P=0000<0.01）、基本培養(yǎng)基（P=0.003<0.01）對生根數(shù)影響極顯著，椰汁濃度（P=0030<0.05）對葉片數(shù)的影響顯著，6-BA（P=0.061>005）對生根數(shù)影響不顯著；基本培養(yǎng)基（P=0243>0.05）、6-BA濃度（P=0.324>0.05）、NAA濃度（P=0.057>005）、椰汁濃度（P=0.916>0.05）均對生根率影響不顯著。

2.3不同處理對蝴蝶蘭生根的影響

可知，蝴蝶蘭小麻雀生根培養(yǎng)的生根率在70%～100%，2 g/L花寶1號+0.05 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+100 g/L香蕉的處理材料全部生根，生根數(shù)最多（352條）、根最長（35.37 cm）；1/2MS+0.3 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+200 g/L香蕉生根數(shù)最少（1.24條），根長最短（5.75 mm）。根據(jù)各因素R值可知，4種處理因素對生根數(shù)影響的主次關(guān)系為NAA濃度>基本培養(yǎng)基>香蕉濃度>6-BA濃度。最適宜蝴蝶蘭小麻雀生根數(shù)的組合為 2 g/L 花寶1號+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+100 g/L 香蕉。4種處理因素對根長平均值影響的主次關(guān)系為NAA濃度>基本培養(yǎng)基>6-BA濃度>香蕉濃度，最適宜蝴蝶蘭小麻雀根長的組合為1 g/L花寶1號+0.05 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA。

基本培養(yǎng)基（P=0.001<0.01）、NAA濃度（P=0.000<0.01）、香蕉濃度（P=0.001<0.01）對生根數(shù)影響極顯著，6-BA濃度（P=0.380>0.05）對生根數(shù)的影響不顯著；基本培養(yǎng)基（P=0000<0.01）、NAA濃度（P=0.000<0.01）、6-BA濃度（P=0.000<0.01）對根長影響極顯著，香蕉濃度（P=0.924>0.05）對根長的影響不顯著。1/2MS與1、2 g/L花寶1號（P=0.014<0.05）間生根數(shù)差異顯著，1、2 g/L花寶1號之間差異不顯著（P=0.899>0.05）。可見，花寶1號相較1/2MS培養(yǎng)基更有利于蝴蝶蘭小麻雀生根培養(yǎng)，且在一定范圍內(nèi)，花寶1號濃度升高促進生根培養(yǎng)；0.05 mg/L NAA（P=0.000<0.01）、0.1 mg/L NAA（P=0.000<0.01）、0.3 mg/L NAA（P=0.000<0.01）三者之間差異極顯著，根據(jù)估算邊際均值得出，隨著NAA濃度升高，生根數(shù)值降低，表明低濃度的NAA可以促進蝴蝶蘭小麻雀的生根培養(yǎng)；0 g/L香蕉與100 g/L 香蕉（P=0.000<0.01）、200 g/L香蕉（P=0009<0.01）差異極顯著，100 g/L 香蕉與200 g/L 香蕉（P=0159>0.05）差異不顯著，添加香蕉可促進其生根培養(yǎng)。

3討論

在類原球莖的誘導(dǎo)階段，李會珍的研究表明，添加低濃度6-BA、NAA對類原球莖的增殖和生長有利，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10%香蕉+2%蔗糖為原球莖增殖最佳培養(yǎng)基，原球莖多，個大飽滿，分散性好，低濃度6-BA有利于類原球莖增殖[6]，在改良KC、1/3MS、MS等3種基本培養(yǎng)基中，隨著6-BA濃度的升高，增殖倍數(shù)呈降低趨勢[7]。周俊輝的研究表明，高濃度（10～50 mg/L）6-BA有利于蝴蝶蘭類原球莖增殖，較低濃度（0.1～0.5 mg/L）6-BA有利于蝴蝶蘭類原球莖的分化；當6-BA使用濃度在 1.0～3.0 mg/L時，增殖情況無明顯差異，NAA濃度對原球莖增殖分化影響不明顯[8]。這可能跟試驗品種或所選的基本培養(yǎng)基不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的無機鹽和蛋白胨有利于蝴蝶蘭品種小麻雀增殖，高濃度的6-BA和附加一定濃度的蛋白胨有助于蝴蝶蘭小麻雀的增殖。

添加細胞分裂素和生長素后對原球莖的分化有促進作用[9-10]。陳勇等認為，只添加激素0.1 mg/L NAA的 1/2MS 培養(yǎng)基適合原球莖分化，其分化率可達到100%，而在經(jīng)常使用的高質(zhì)量濃度NAA和低質(zhì)量濃度6-BA組合對蝴蝶蘭原球莖分化有一定的抑制作用；此外，相較于蘋果汁、馬鈐薯汁

和香蕉泥，添加15%椰子汁的原球莖分化苗長勢最佳[11]。聶菁等研究顯示，添加3 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA，蝴蝶蘭原球莖分化率最高，達96.67%[12]。王芳等認為，單獨使用NAA時，NAA濃度與平均葉片數(shù)（0.2～3.0 mg/L）成正比，與6-BA配合使用時，低濃度的NAA促進葉片數(shù)的發(fā)生[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，NAA在蝴蝶蘭小麻雀分化階段對葉片數(shù)和株高均有重要影響，并且在培養(yǎng)基中添加100 mL/L椰汁有利于叢生芽的分化與芽苗生長，且減輕了褐化現(xiàn)象。

培養(yǎng)基中添加NAA[14]、IBA[15]等激素有利于蝴蝶蘭試管苗的試管壯苗。林宗鏗等利用正交設(shè)計方法對蝴蝶蘭生根壯苗的研究發(fā)現(xiàn)，與蔗糖、NAA和多效唑相比，無機營養(yǎng)是影響叢生芽發(fā)根率的主要因素，蝴蝶蘭大粉紅花雜交種（P. ‘New Eagle×P. ‘Happy Valentine）最佳生根壯苗培養(yǎng)基為 3.5 g/L 花寶1號+1 mg/L NAA+100 g/L香蕉泥+2 g/L蛋白胨+1 g/L活性炭+25 g/L蔗糖[16]。劉海姍研究表明，蝴蝶蘭最適的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+05 mg/L IBA+20 g/L蔗糖；同時在繼代過程中，可嘗試將添加的細胞分裂素濃度高低交替使用，避免體內(nèi)積累太多激素而影響生根效果[17]。本研究結(jié)果表明，NAA濃度對蝴蝶蘭的生根數(shù)和根長有著重要的影響，花寶1號有利于蝴蝶蘭小麻雀生根培養(yǎng)，香蕉泥的添加可促進蝴蝶蘭生根培養(yǎng)，外源添加物能促進蝴蝶蘭幼苗的生長和根系的發(fā)育，而香蕉泥的促進作用最為顯著，這與張敏等的研究結(jié)果[18-19]一致，香蕉泥單獨處理會促進根的生長，同時香蕉泥和椰汁的混合物為生根壯苗的最佳組合。

參考文獻：

[1]董國興. 蝴蝶蘭[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2004.

[2]張淑娟. 看圖養(yǎng)蝴蝶蘭[M]. 福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，2005.

[3]黃勝琴，郭建軍，葉慶生，等. 溫度對蝴蝶蘭成花誘導(dǎo)的研究初探[J]. 中山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，42（4）：132-134.

[4]吳承禎. 試驗設(shè)計與分析——原理·操作·案例[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2004：95-115.

[5]卓孝康，蘭思仁，彭東輝，等. 大苞鞘石斛胚組織培養(yǎng)及植株再生研究[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報，2014，34（4）：289-296.

[6][JP2]林夏斌，黃華達，黃懷妹，等. 白花擬萬代蘭（Vandopsis undulata）組培苗的增殖、生根與煉苗[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：56-59.[JP]

[7]樊家榮. 激素和添加物對蝴蝶蘭組培快繁的影響[J]. 合肥學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，23（4）：51-54.

[8]周俊輝，葉超宏，陳旭高. 蝴蝶蘭原球莖增殖培養(yǎng)的研究[J]. 仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2002，15（3）：13-17.

[9]Ehattarcharjee S. Effect of growth regulating substan ce on in vitro seed germination of phalaenopsis hybid[J]. Indian Agriculturist，1999，43（1/2）：79-83.

[10]陳兆貴，譚俊. 不同激素配比對鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響研究[J]. 惠州學(xué)院學(xué)報，2006，26（3）：11-14.

[11]周根余，謝薇，程磊. 影響鐵皮石斛原球莖生長的若干因素[J]. 江西科學(xué)，1999，17（4）：231-235.

[12]陳勇，林開縣，王君暉. 蝴蝶蘭的快速繁殖和規(guī)?；耘嗉夹g(shù)研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），2004，31（1）：84-87，97.

[13]聶菁，劉麗鳳，任海虹，等. 蝴蝶蘭類原球莖誘導(dǎo)、增殖及植株再生條件初步研究[J]. 山西大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，39（2）：318-324.

[14]王芳，文峰，武斌，等. 激素對蝴蝶蘭快速繁殖的影響[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，26（4）：68-71.

[15]陳瑤瑤，莊衛(wèi)東，馬曉娟，等. 植物生長調(diào)節(jié)劑對不同蝴蝶蘭品種叢生芽增殖與生根的影響[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，26（5）：762-765.

[16]林宗鏗，黃德貴. 應(yīng)用正交設(shè)計方法探討蝴蝶蘭叢生芽生根壯苗的條件[J]. 福建熱作科技，2002，27（1）：4-5，11.

[17]劉海姍. 蝴蝶蘭組培苗生產(chǎn)成本研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2008.

[18]張敏，黃利斌，蔣澤平. 蝴蝶蘭組織培養(yǎng)生根影響因子的篩選[J]. 江蘇林業(yè)科技，2011，38（1）：20-22.

[19]郭春梅，涂小云，岳李心，等. 不同土豆添加量對蝴蝶蘭“光芒四射”增殖生長的影響[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2015（7）：82-83.