間充質(zhì)干細(xì)胞上清對(duì)高糖慢性炎癥損傷的巨噬細(xì)胞表型極化的影響

靳麗媛，鄧子輝，張金英，楊 晨，司藝玲*，陳光輝*

(解放軍總醫(yī)院：1心血管內(nèi)科，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100853)

近年來，糖尿病已成為威脅全人類健康的主要慢性疾病，長期控制不佳的高血糖會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心、腦及腎臟并發(fā)癥，造成極高的死亡率[1-3]。在糖尿病并發(fā)癥的炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞是一種重要的參與其炎癥調(diào)節(jié)的免疫細(xì)胞[4-6]。巨噬細(xì)胞主要存在兩種亞型：經(jīng)典活化型(M1型)和選擇活化型(M2型)。在不同微環(huán)境中，炎癥介質(zhì)刺激巨噬細(xì)胞活化，轉(zhuǎn)化成不同的表型，同時(shí)分泌促炎或抗炎細(xì)胞因子參與炎癥調(diào)節(jié)[7]。正常情況下，巨噬細(xì)胞M1和M2處于動(dòng)態(tài)平衡以維持穩(wěn)態(tài)，當(dāng)發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的高糖慢性炎癥時(shí)，M1和M2比例失衡，造成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，分泌大量炎癥細(xì)胞因子，進(jìn)一步加重細(xì)胞和組織的炎癥損傷，若未能得到有效控制，將造成不可逆轉(zhuǎn)的心、腦、腎功能損害[5,6,8]。近年的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以通過分泌的物質(zhì)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，影響巨噬細(xì)胞功能，從而在多種免疫代謝疾病中起到治療作用[9,10]。在糖尿病并發(fā)癥的高糖慢性炎癥中，MSCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。故本研究擬利用高糖聯(lián)合脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)模擬糖尿病并發(fā)癥的慢性炎癥環(huán)境，探討高糖炎癥損傷條件下巨噬細(xì)胞的變化及MSCs培養(yǎng)上清對(duì)損傷的巨噬細(xì)胞表型極化的影響，旨在闡明糖尿病并發(fā)慢性炎癥的致病機(jī)理及MSCs的干預(yù)機(jī)制，為MSCs防治糖尿病并發(fā)癥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠15只：體質(zhì)量120～150 g，10只；體質(zhì)量80 g，5只。購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)環(huán)境為解放軍總醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑

DMEM高糖和低糖培養(yǎng)液以及10 000 U/ml青霉素-10 000μg/ml鏈霉素(HyClone公司，新西蘭)，胎牛血清(天津市灝洋生物技術(shù)公司)，LPS和Ⅰ型膠原酶(Sigma公司，美國)，50%葡萄糖和0.25%胰酶(Gibco公司，美國)。大鼠白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10和前列腺素E2(prosta-glandin E2，PGE2)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(R&D)，抗大鼠CD45和CD29(eBioscience公司，美國)，CD11b和CD90(BD公司，美國)，CD34、CD45、CD68、CD163和CD11c(AbD Serotec公司，英國)。

1.3 巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定

選取體質(zhì)量為120～150 g雄性SD大鼠，分離腹腔巨噬細(xì)胞[11]。細(xì)胞培養(yǎng)至36～48 h顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，穩(wěn)定生長的細(xì)胞可進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定。按照流式實(shí)驗(yàn)步驟，用特異白細(xì)胞CD45、中性粒細(xì)胞CD11b以及巨噬細(xì)胞特異CD68抗體進(jìn)行反應(yīng)，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)并分析陽性巨噬細(xì)胞的比例。

1.4 MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定

選取體質(zhì)量為80 g雄性SD大鼠，分離和培養(yǎng)腹股溝處脂肪MSCs[12]。待細(xì)胞密度接近90%，消化細(xì)胞進(jìn)行傳代，P3或P4代細(xì)胞顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定，采用MSCs陽性表面標(biāo)記抗體CD29和CD90，陰性表面標(biāo)記抗體CD34、CD45和CD11b避光反應(yīng)15 min，流式鑒定各表面標(biāo)記分子的陽性率。

1.5 分組

分別以及聯(lián)合利用高濃度葡萄糖(33 mmol/L)和LPS (1 μg/ml)體外處理大鼠腹腔巨噬細(xì)胞 12 h。依據(jù)是否采用MSCs干預(yù)分為干預(yù)組和非干預(yù)組，考察各損傷條件下兩組巨噬細(xì)胞表型的差異。MSCs干預(yù)方法為加入MSCs上清0.5 ml換取 0.5 ml 原培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，此后收集細(xì)胞上清進(jìn)行細(xì)胞因子的ELISA檢測，收集細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測

MSCs處理48 h后，吹打收集巨噬細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗2次，用流式抗體CD68特異標(biāo)記巨噬細(xì)胞、 CD163標(biāo)記M1型、CD11c標(biāo)記M2型，避光室溫孵育細(xì)胞20 min，PBS洗滌，重懸后進(jìn)行檢測分析。

1.7 ELISA檢測

處理48 h后收集細(xì)胞上清，凍存于-80℃，檢測前離心20 min(3000轉(zhuǎn)/min)，收集上清進(jìn)行細(xì)胞因子IL-6、IL-10和PGE2的ELISA檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)及鑒定

由大鼠腹腔分離的巨噬細(xì)胞經(jīng)2 h后換液純化，培養(yǎng)2～3 d，觀察細(xì)胞形態(tài)呈類圓形或不規(guī)則形(圖1A)。P3～P4代MSCs呈長梭形，且聚集呈旋渦狀穩(wěn)定生長(圖1B)。

流式細(xì)胞檢測結(jié)果示CD68陽性的細(xì)胞比例為99.39%，說明腹腔分離的細(xì)胞中巨噬細(xì)胞純度高，可以用作下一步分組干預(yù)試驗(yàn)(圖2A)。MSCs陰性標(biāo)記CD34、CD45和CD11b的陽性率均<0.5%，陽性標(biāo)志CD29和CD90的陽性率均>99.0%，符合MSCs的表型，可用作后續(xù)試驗(yàn)(圖2B)。

2.2 MSCs對(duì)高糖、炎癥環(huán)境中巨噬細(xì)胞表型變化

的影響

在各非干預(yù)組中，與正常條件下相比，高糖、LPS和高糖+LPS損傷條件下的M1型巨噬細(xì)胞比例和M1/M2值均顯著增高，而M2型巨噬細(xì)胞的比例則顯著減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MSCs干預(yù)后，在LPS和高糖+LPS的損傷條件下，與非干預(yù)組相比，干預(yù)組的M1型巨噬細(xì)胞的比例和M1/M2值均顯著降低(均P<0.05)，而M2型巨噬細(xì)胞的比例均增加(PLPS<0.05，P高糖+LPS=0.063；圖3)。

2.3 ELISA檢測結(jié)果

在各非干預(yù)組中，與正常條件下相比，高糖、LPS和高糖+LPS損傷條件下的IL-6水平均顯著增加，而IL-10和PGE2水平均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MSCs干預(yù)后，在高糖、LPS和高糖+LPS的損傷條件下，與非干預(yù)組相比，干預(yù)組的IL-6水平均顯著降低，而IL-10和PGE2的水平均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖4)。

圖1 原代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察Figure 1 Primarily cultured Cells under light microscope A: macrophages (×40); B: mesenchymal stem cells (×10)

圖2 培養(yǎng)細(xì)胞的流式細(xì)胞細(xì)胞術(shù)鑒定Figure 2 Identification of the cultured cells by flow cytometry A: macrophages; B: mesenchymal stem cells

圖3 各組巨噬細(xì)胞分型比例Figure 3 The proportion of M1, M2 macrophages and M1/M2 among groups (n=8) MSCs: mesenchymal stem cells; HG: high glucose; LPS: lipopolysaccharide. Compared with normal condition, *P<0.05; compared with non-treated group,#P<0.05;△P=0.063

圖4 各組細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的濃度Figure 4 The concentration of cytokines in different groups of cell supernatant (n=3) MSCs: mesenchymal stem cells; HG: high glucose; LPS: lipopolysaccharide. Compared with normal condition, *P<0.05; compared with non-treated group, #P<0.05

3 討 論

近年的研究表明，炎癥是糖尿病患者產(chǎn)生胰島素抵抗以及心臟病、腦卒中、腎病和其他相關(guān)并發(fā)癥的主要原因之一[6]。在糖尿病并發(fā)癥的高糖慢性炎癥中，巨噬細(xì)胞不同表型起著重要的炎癥調(diào)節(jié)作用。受到炎癥刺激后的巨噬細(xì)胞可發(fā)生表型極化，參與炎癥過程的調(diào)節(jié)，M1型巨噬細(xì)胞可分泌促炎類細(xì)胞因子，如IL-6、IL-1β等，促進(jìn)炎癥發(fā)生、加重組織損傷；M2型巨噬細(xì)胞可分泌抗炎類細(xì)胞因子，如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β、MMP-12等，發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)組織的修復(fù)[6-8]。糖尿病心臟并發(fā)癥的晚期階段，機(jī)體自身免疫炎癥調(diào)節(jié)受損，由循環(huán)單核細(xì)胞募集的巨噬細(xì)胞逐漸替代駐地M2細(xì)胞群，M1與M2比例失衡，M1促炎型巨噬細(xì)胞增多并分泌促炎因子，造成持續(xù)性炎癥損害，誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡及間質(zhì)性炎癥。因此，如果能夠增加駐地M2型巨噬細(xì)胞的擴(kuò)增與更新，則可促進(jìn)損傷的修復(fù)[8,13,14]，這是近年來從免疫調(diào)節(jié)角度探索提高糖尿病并發(fā)癥治療效果的研究熱點(diǎn)。

本試驗(yàn)采用33 mmol/L高糖聯(lián)合1 μg/ml LPS的方法干預(yù)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，模擬體內(nèi)的高糖及慢性炎癥環(huán)境，結(jié)果顯示，在各非干預(yù)組中，與正常條件下相比，各損傷條件下的M1型巨噬細(xì)胞比例、M1/M2值和IL-6水平均顯著增高，而M2型巨噬細(xì)胞比例以及IL-10和PGE2水平均顯著降低。此結(jié)果驗(yàn)證了在高糖、炎癥環(huán)境中，巨噬細(xì)胞向M1促炎表型轉(zhuǎn)化的推論。

多項(xiàng)臨床前和臨床試驗(yàn)證明，MSCs可減輕胰島素抵抗，促進(jìn)胰島β細(xì)胞的再生及功能修復(fù)[15]；同時(shí)在胰島素抵抗的脂肪中MSCs可有效減輕炎癥[16]。但是，有關(guān)MSCs對(duì)糖尿病并發(fā)癥的治療效果及其作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。本研究采用大鼠腹股溝脂肪MSCs上清0.5ml干預(yù)各損傷組細(xì)胞，結(jié)果顯示，在LPS和高糖+LPS的損傷條件下，與非干預(yù)組相比，干預(yù)組的M1型巨噬細(xì)胞的比例和M1/M2值均顯著降低，而M2型巨噬細(xì)胞的比例均增加，ELISA結(jié)果也顯示，在各損傷條件下，與非干預(yù)組相比，干預(yù)組的IL-6水平均顯著降低，而IL-10和PGE2的水平均顯著增加，表明高糖慢性炎癥環(huán)境中MSCs上清具有明顯的促進(jìn)巨噬細(xì)胞從促炎的M1型向抗炎的M2表型轉(zhuǎn)化的作用，在減輕炎癥損傷的同時(shí)促進(jìn)炎癥的修復(fù)，從而能夠調(diào)節(jié)炎癥損傷的程度，改善細(xì)胞和組織的功能。

綜上所述，體外高糖聯(lián)合LPS誘導(dǎo)能夠模擬糖尿病慢性炎癥并發(fā)癥的局部微環(huán)境，在此環(huán)境下，巨噬細(xì)胞向M1型極化明顯，同時(shí)分泌大量促炎因子，造成細(xì)胞及組織炎癥損傷；而MSCs上清可以促進(jìn)高糖慢性炎癥環(huán)境中巨噬細(xì)胞由M1亞型向M2亞型極化，同時(shí)分泌大量抗炎細(xì)胞因子IL-10和PGE2。本研究在一定程度上解釋了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，為MSCs應(yīng)用于臨床提供了理論依據(jù)，開辟了有效防治糖尿病并發(fā)癥發(fā)生及進(jìn)展的篇章。

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