阿司匹林對阿爾茨海默病模型鼠學(xué)習記憶能力及海馬區(qū)炎性因子表達水平的影響

王士博，拓西平，張文俊，龔江波，王 越，于曉雯，楊 玲

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院老年病科，上海 200433)

2015年，全球約有阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者4680萬，而到2050年，預(yù)估每85人中將有1人遭受AD影響[1]。AD是最常見的老年癡呆類型，在其進程中β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)誘發(fā)的神經(jīng)炎性反應(yīng)可能是其主要病理學(xué)變化，而Aβ異常聚集可能是AD發(fā)病機制的啟動因子，神經(jīng)纖維纏結(jié)則可能更多地參與了AD的進展過程，神經(jīng)炎性反應(yīng)可引起促炎因子白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等生成增加，而抗炎因子IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor，TGF-β)等不足也可能促進神經(jīng)炎性反應(yīng)[2]，神經(jīng)炎性反應(yīng)在AD早期進程中可能發(fā)揮了核心作用[3]。神經(jīng)炎性反應(yīng)被認為是大腦內(nèi)先天免疫系統(tǒng)被激活，其主要功能就是保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)對抗感染性損害、外傷或疾病[4]。小神經(jīng)細胞激活在啟動炎性級聯(lián)反應(yīng)、釋放炎性因子和活性氧、引起tau蛋白異常磷酸化和神經(jīng)纖維纏結(jié)形成、促進神經(jīng)細胞破壞和凋亡等方面都發(fā)揮重要作用；而小神經(jīng)膠質(zhì)細胞還可通過吞噬作用清除腦內(nèi)Aβ多肽，因此，通過抗炎藥物抑制炎性反應(yīng)、保護神經(jīng)膠質(zhì)細胞，可改善神經(jīng)病理學(xué)變化中的潛在可能[5]。

有臨床研究表明長期服用阿司匹林(aspirin，Asp)的人群AD發(fā)病率較未服用者降低[6]。因此，本研究通過對SD大鼠側(cè)腦室注射Aβ25-35建立AD動物模型[7]，探討Asp干預(yù)對AD模型大鼠空間學(xué)習能力及海馬組織中抗/促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-4及IL-10表達水平的影響，以期能為AD的防治提供部分實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠40只，鼠齡11～12周，體質(zhì)量290～320 g，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。標準環(huán)境下飼養(yǎng)：溫度(23.0±0.5)℃，濕度(50.0±0.5)%，自然光線(晝夜比12∶12)，自由進食水。

1.2 試劑和儀器

Aβ25-35和Asp均購自美國Sigma公司；大鼠IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10定量酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均由欣博盛公司提供。Morris水迷宮實驗視頻分析系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)公司)；腦立體定向儀(Stoelting公司，美國)；5 μl微量注射器(杭州鎮(zhèn)海玻璃儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 Aβ25-35溶液和Asp液配制 將Aβ25-35溶于無菌生理鹽水(10 mmol/L)，密封后置于37℃，5%CO2恒溫箱內(nèi)孵育3 d，老化備用。將Asp顆粒研磨后加入雙蒸水，振蕩溶解配制成濃度為1 mg/ml和2 mg/ml的溶液。

1.3.2 分組及處理方法 40只大鼠隨機分為4組：對照組、AD模型組、低劑量Asp干預(yù)組和高劑量Asp干預(yù)組，10只/組。對照組和AD模型組大鼠自由飲用雙蒸水；低劑量和高劑量組大鼠分別自由飲用1 mg/ml、2 mg/ml的Asp溶液。3周后側(cè)腦室注射Aβ25-35，并繼續(xù)上述方法喂養(yǎng)3周。各組大鼠均自由進食。

1.3.3 AD大鼠模型建立 用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg)大鼠，固定于腦立體定向儀上，剪去頭頂部毛發(fā)，聚維酮碘消毒后切開皮膚，參照包新民的《大鼠腦立體定位圖》，選擇右側(cè)腦室為注射靶區(qū)，于前囟向后1.0 mm、中線向右旁開1.8 mm處，用三棱針鉆開顱骨，暴露硬腦膜，再用微量注射器自腦表面垂直進針3.9 mm，將10 mmol/L的Aβ25-35溶液5 μl緩慢注入側(cè)腦室(5 min)，留針2 min，緩慢撤針(5 min)，牙科粉覆蓋顱骨開口，消毒后縫合皮膚切口，肌注4萬單位青霉素鈉預(yù)防感染；對照組注入等體積無菌生理鹽水。

1.3.4 Morris水迷宮行為學(xué)測定 各組大鼠于第6周結(jié)束后進行Morris水迷宮實驗(隱匿平臺獲得實驗)，測試程序為定位航行試驗：歷時5 d，前2 d為訓(xùn)練適應(yīng)期，后3 d記錄實驗成績，將受試大鼠按順時針方向依次由E、S、W、N 4 個點入水，面向池壁放入水中，記錄尋找和爬上平臺所需的時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在120 s內(nèi)找到平臺，記錄其實際逃避潛伏期；如果在120 s仍未找到平臺，則由實驗者將其引上平臺并停留20 s，逃避潛伏期記錄為120 s。

1.3.5 海馬組織提取及IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10定量ELISA測定 用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg)大鼠，快速去頭并取出完整大腦，在冰盒上去除皮層組織，暴露并分離出海馬，保存到2.0 ml 冷凍管的液氮中。大鼠海馬勻漿離心后取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書所示方法，使用酶標儀測定樣品在450 nm的吸光度(absorbance，A)，根據(jù)標準品結(jié)果繪制標準曲線，直線回歸分析得出其回歸方程。將標本的A代入所得方程，可得出相應(yīng)炎性因子的數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較

第1天Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，AD模型組逃避潛伏期較對照組顯著延長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，表明造模成功。與對照組相比，AD模型組和低劑量Asp干預(yù)組第1、2、3天的逃避潛伏期均顯著延長，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與AD模型組相比，高劑量Asp干預(yù)組第1、2、3天以及低劑量Asp干預(yù)組第3天的逃避潛伏期均顯著縮短，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表1)。

2.2 各組大鼠海馬組織中促炎因子表達水平比較

與對照組相比，AD模型組的IL-1β和TNF-α表達水平均顯著升高(P<0.001)，提示AD模型組海馬區(qū)炎性反應(yīng)較顯著；低劑量Asp干預(yù)組的TNF-α表達水平顯著升高(P<0.01)。與AD模型組比較，高劑量Asp干預(yù)組的IL-1β和TNF-α表達水平均顯著降低(P<0.01)，低劑量Asp干預(yù)組的IL-1β表達水平顯著降低(P<0.01)。高、低劑量Asp干預(yù)組間IL-1β和TNF-α的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；圖1)。

2.3 各組大鼠海馬組織中抗炎因子表達水平比較

與對照組相比，AD模型組的IL-4和IL-10表達水平均顯著降低(P<0.05)，提示AD模型組海馬區(qū)炎性反應(yīng)顯著，低劑量Asp干預(yù)組的IL-4表達水平下降明顯(P<0.01)。與AD模型組相比，高劑量Asp干預(yù)組的IL-4和IL-10表達水平均顯著升高(P<0.05)，提示高劑量Asp干預(yù)組大鼠海馬區(qū)炎性反應(yīng)受到抑制。高、低劑量Asp干預(yù)組間IL-4和IL-10的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；圖2)。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較Table 1 Comparison of escape latency among groups in 3 days (n=10, s,

Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001; compared with model group,#P<0.05,##P<0.01

圖1 各組促炎因子表達水平比較Figure 1 Comparison of levels of pro-inflammatory cytokines among groups A: IL-1β; B: TNF-α. IL-1β: interleukin-1β; TNF-α: tumor necrosis factor α. Compared with control group, **P<0.01, ***P<0.001; compared with model group, ##P<0.01

圖2 各組抗炎因子表達水平比較Figure 2 Comparison of levels of anti-inflammatory cytokines among groups A: IL-4; B: IL-10. IL-4: interleukin-4; IL-10: interleukin-10. Compared with control group, **P<0.01, ***P<0.001; compared with model group, #P<0.05,##P<0.01

3 討 論

AD是一種多病因、發(fā)病機制尚不完全清楚的神經(jīng)退行性疾病，以認知功能損傷、進行性日?；顒幽芰靵y及神經(jīng)精神病學(xué)癥狀和行為異常為主要臨床特征。Aβ和tau蛋白過度磷酸化分別為細胞外老年斑和細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要成分，這些蛋白的共同特征是生理活性丟失和毒性增加，可促進神經(jīng)退行性變[8]。盡管其發(fā)病機制仍不清楚，但有證據(jù)表明神經(jīng)炎性反應(yīng)在AD進程中發(fā)揮重要作用[9]。且隨著AD患者腦內(nèi)神經(jīng)炎性反應(yīng)的不斷進展，抗炎反應(yīng)對促炎因子的刺激持續(xù)缺乏，抗炎因子表達水平下降，促炎因子表達水平升高，致使抗炎/促炎因子平衡失調(diào)，進一步促進炎性反應(yīng)的發(fā)展。

本實驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，高劑量Asp干預(yù)組大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α的表達水平較AD模型組均顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這與胡毓洪等[10]的研究結(jié)果一致；而IL-4和IL-10的表達水平較AD模型組均有不同程度升高，其中高劑量Asp干預(yù)組與AD模型組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。IL-4是一種參與調(diào)解AD患者腦內(nèi)神經(jīng)炎性反應(yīng)過程并發(fā)揮重要作用的多態(tài)性抗炎因子。有研究顯示IL-4誘導(dǎo)小神經(jīng)膠質(zhì)細胞通過促進CD36和Aβ裂解酶基因表達而清除Aβ[11]；而用IL-4治療AD動物模型后，Aβ積累減少，認知功能損害減輕[12]。文獻報道[13,14]，在IL-4基因表型(-590 C/T和-1098 T/G)中，-590T等位基因被認為具有保護作用，而-1098T在高加索人群中則可能是一個危險因素。IL-10是一種強有力的抗炎因子，在細胞存活和神經(jīng)元的內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，可能參與調(diào)節(jié)IL-1β和IL-6的生成及減少炎性反應(yīng)[15]。有報道稱[3]，在預(yù)曝光的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，IL-10抑制由Aβ或脂多糖誘導(dǎo)的促炎因子生成；而另有研究顯示[16,17]，在AD小鼠模型中，抗炎細胞因子IL-10通過小神經(jīng)膠質(zhì)細胞抑制Aβ清除，加劇認知能力下降。但關(guān)于IL-10基因多態(tài)性的研究數(shù)據(jù)顯示，-1082GG基因表型(與高IL-10生成相關(guān))和-1082AA基因表型(與低 IL-10 生成相關(guān))與AD發(fā)病率或AD進展的高風險相關(guān)[18]，但Moraes等[19]認為IL-10 -1082AA和降低AD風險之間相關(guān)。這些研究表明探索IL-4和IL-10與AD之間的關(guān)系將有助于理解它們在AD進程中發(fā)揮的作用，為防治AD提供參考。

Asp是經(jīng)典的非甾體類抗炎藥，其對AD的重要性在于抗炎作用。我們前期實驗通過Asp干預(yù)Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元炎性反應(yīng)，使炎性因子IL-1β和TNF-α表達水平下降，同時可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor κB，NF-κB)活化水平減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)[20]。有研究表明[21]，長時間Asp治療可使AD大鼠受損記憶得到一定恢復(fù)，同時改善突觸功能障礙。Asp誘生型脂氧素A4對AD小鼠作用的研究顯示，NF-κB活化、促炎因子和趨化因子表達均減少，而IL-10表達水平增加[22]。我們的研究結(jié)果也顯示，通過Asp干預(yù)可使大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期較模型組縮短，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示Asp干預(yù)對Aβ誘導(dǎo)的AD模型大鼠空間學(xué)習記憶能力可能具有一定的保護和改善功能。盡管多項研究認為沒有充足證據(jù)支持Asp對AD有防治作用[23,24]，但Wang等[25]則肯定了Asp對AD的積極影響，尤其是長期使用Asp可顯著減低人群AD的發(fā)生率。本研究結(jié)果表明Asp對AD干預(yù)的起始時間、持續(xù)時間以及藥物劑量是影響是否獲益及獲益程度的因素。

本研究提示，促炎/抗炎因子之間的微妙平衡可能決定了炎性反應(yīng)在AD進程中的角色，Asp干預(yù)使AD大鼠空間學(xué)習記憶能力得以改善，同時可能通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化水平和炎性反應(yīng)，使IL-4 和IL-10表達水平提高。Asp在AD防治中的作用尚存爭議，更為科學(xué)的臨床試驗設(shè)計仍是今后研究中不可忽視的內(nèi)容。

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