慢性缺氧大鼠心肌HSP47 mRNA的表達(dá)及其與PⅠCP和PⅢNP含量的相關(guān)性研究

林夢嬌，田倪妮，魏 玲*，朱向情，楊曉華，田 青，曹 帥，阮光萍，潘興華*

(1昆明總醫(yī)院地方干部病房，昆明 650032；2昆明市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，昆明 650011；3云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032)

慢性缺氧是多種心血管疾病及心室重的誘因，是發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，尤其對(duì)于老年患者，慢性缺氧可致多種心血管疾病[1，2]。熱休克蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)是一種高度保守的分子蛋白，既往研究表明其是膠原的特異性分子伴侶，在膠原分泌、合成及其所致纖維化中起重要作用。慢性缺氧可引起明顯的肺動(dòng)脈高壓以及右心室重構(gòu)，甚至最終發(fā)展為心力衰竭[3，4]。本研究通過建立慢性缺氧SD大鼠模型，測定HSP47 mRNA表達(dá)量及Ⅰ型前膠原C端原肽(procollagen Ⅰ C-propeptide, PⅠCP)及Ⅲ型前膠原N端原肽 (procollagen Ⅲ N-propeptide，PⅢNP)的含量，探討其與心肌纖維化的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 低氧環(huán)境的建立和依據(jù)

參考Bonnet等實(shí)驗(yàn)[3-5]改良缺氧箱。缺氧箱箱體系統(tǒng)主要由動(dòng)物飼養(yǎng)箱體和箱內(nèi)氣路組成。氧氣濃度控制系統(tǒng)由高壓氮?dú)鈿馄?、電磁閥、氧濃度控制器、氣體流量控制器組成，置于箱體的上部。設(shè)置箱體內(nèi)的氧濃度后，整個(gè)系統(tǒng)由氧氣濃度控制系統(tǒng)自動(dòng)控制。智能控氧儀位于箱體上部，實(shí)時(shí)檢測箱體內(nèi)氧含量，并顯示在智能控氧儀屏幕上，當(dāng)箱體內(nèi)氧濃度高于設(shè)置值時(shí)，電磁閥開啟，充氮?dú)膺M(jìn)入箱體，充氣速度由氣體流量計(jì)控制，當(dāng)氧濃度低于設(shè)定值時(shí)電子閥自動(dòng)關(guān)閉，停止氮?dú)廨斎?。使箱體內(nèi)氧氣濃度保持在一定范圍內(nèi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

40只SPF級(jí)的雄性SD大鼠適應(yīng)性正常飼養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表完全隨機(jī)分為5組，每組8只。對(duì)照組不給于缺氧處理(A組)。各慢性缺氧組大鼠放入缺氧箱中，向箱中快速通入氮?dú)? 控制氣流流量(0.09～0.1)m3/h，箱內(nèi)氧氣濃度從20.95%開始下降，控制氧濃度為10%±0.5%，分別缺氧 7 d(B組)、14 d(C組)、21 d(D組)、28 d(E組)。每天早上8∶00～8∶30開箱放氣，清理糞便，補(bǔ)給食物和水，其他時(shí)間模型組大鼠均飼養(yǎng)于缺氧箱中。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 心肌組織總RNA的提取 從-80℃冰箱中取出心肌組織，移到液氮預(yù)先冷卻的研缽中，邊加液氮邊研磨至樣品成白色粉末。待液氮揮發(fā)完后，加入2 ml Trizol(Takara,9109)。將變成固體的Trizol研磨成粉末。繼續(xù)研磨至Trizol恢復(fù)成液體。將所得液體轉(zhuǎn)移入離心管。按Trizol說明書提取總RNA。將所得樣本的RNA分別移放置入RNase free離心管中，將離心管標(biāo)記后放入-80℃冰箱中凍存。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA 在200 μl薄壁聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)管中配制RT混合反應(yīng)液，反應(yīng)體系20 μl。在PCR儀上按照下面條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription, RT)： 25℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃孵化，最終可得到cDNA，并放入-20℃冰箱凍存。

1.3.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)Genebank中大鼠HSP 47的基因序列以及beta-actin內(nèi)參序列，用Primer premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出特異性高的引物序列。該引物的合成由昆明貝爾吉有限公司合成。引物片段約115 bp。

表1 目的基因及內(nèi)參引物Table 1 The primers of target gene and beta-actin

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 目的基因HSP47的擴(kuò)增條件： 20 μl反應(yīng)體系，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,q-PCR)反應(yīng)，50℃ 2 min起始模板變性，95℃ 3 min模板變性(循環(huán)數(shù)1)；95℃ 10 s退火，55℃ 1 min延伸(循環(huán)數(shù)38)；72℃ 5 min延伸(循環(huán)數(shù)1)；65℃ to 95℃制作溶解曲線。收集數(shù)據(jù)，測定樣品各管的Ct值，設(shè)定無cDNA樣品作為對(duì)照管。

1.3.5 患者血清中PⅠCP濃度的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法檢測本組40只SD大鼠血清中PⅠCP、PⅢNP濃度。將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體，先后加入受檢標(biāo)本、酶標(biāo)抗體，最后加底物顯色。用酶標(biāo)儀檢測。

1.3.6 HE和MASSON組織切片染色 用HE和MASSON染色法對(duì)對(duì)照組及慢性缺氧組大鼠心肌組織進(jìn)行切片染色，觀察鏡下改變。

1.3.7 HSP47 mRNA相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法 本實(shí)驗(yàn)采用定量PCR中的公式法進(jìn)行相對(duì)定量，實(shí)時(shí)連續(xù)測定基因擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的熒光，以達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增時(shí)的循環(huán)周數(shù)(Ct)值進(jìn)行校正。方法如下：用下列公式計(jì)算各組大鼠的HSP47 mRNA相對(duì)表達(dá)量，以beta-actin作為對(duì)照，A組作為基準(zhǔn)，其余各組作為目的基因，目的基因mRNA的表達(dá)量均表達(dá)成基準(zhǔn)的N倍(N=2-△△Ct)，其中△Ct= Ct(目的基因)- Ct(beta-actin)，△△Ct=△Ct樣品-△Ct基準(zhǔn)。各組△Ct的比較間接反映出各組真實(shí)拷貝數(shù)間的關(guān)系，各樣本Ct值越大，說明目的基因拷貝數(shù)越少。重復(fù)3次取Ct平均值。本實(shí)驗(yàn)中，Bio-rad CFX96自帶程序計(jì)算方法同上，獲得目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析或 Tamhane 方差分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用 Pearson 直線相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因熒光定量PCR產(chǎn)物鑒定

目的基因HSP47 mRNA引物片段長度為115 bp,beta-actin引物片段長度為135 bp左右?；驐l帶無引物二聚體且清晰無雜帶(圖1)，因此引物的設(shè)計(jì)合理，PCR引物及擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高。

圖1 熱休克蛋白47mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物Figure 1 Heat shock protein 47 mRNA amplification product

2.2 HSP47 mRNA在不同實(shí)驗(yàn)分組心肌中的相對(duì)表達(dá)量

與對(duì)照組比較，模型C組、D組、E組的HSP47 mRNA表達(dá)量明顯增多(P<0.01)， 模型B組HSP47 mRNA表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。亞組間兩兩比較：與B組比較，C組、D組、E組的HSP47 mRNA表達(dá)量明顯增多(P<0.01)；與C組比較，D組、E組的HSP47 mRNA表達(dá)量明顯增多(P<0.01)；與D組比較，E組的HSP47 mRNA表達(dá)量明顯增多(P<0.01)。

圖2 熱休克蛋白47 mRNA在不同缺氧組心肌中的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 Relative expression of heat shock protein 47 mRNA in different hypoxia groups

A: control group; B: chronic hypoxia for 7 d; C: chronic hypoxia for 14 d; D: chronic hypoxia for 21 d; E: chronic hypoxia for 28 d. Compared with group A,**P<0.01； compared with group B,##P<0.01; compared with group C,△△P<0.01； compared with group D,▲▲P<0.01

2.3 ELISA法檢測血清及心肌中的PⅠCP和PⅢNP濃度

與對(duì)照組比較，模型B組、C組、D組、E組的血清、心肌組織PⅠCP、PⅢNP含量明顯增多(P<0.01)。亞組間兩兩比較：與B組比較，C組、D組、E組的血清、心肌組織PⅠCP、PⅢNP含量明顯增多(P<0.01)；與C組比較，D組、E組的血清、心肌組織PⅠCP、PⅢNP含量明顯增多(P<0.01)；與D組比較，E組的血清、心肌組織PⅠCP、PⅢNP含量明顯增多(P<0.01；表2)。

2.4 心肌HSP47mRNA與血清、心肌的PⅠCP和PⅢNP相關(guān)性分析

心肌HSP47mRNA與血清和心肌的PⅠCP、PⅢNP呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；表3)。

2.5 心肌組織HE染色和MASSON染色

正常心肌細(xì)胞在HE染色和MASSON染色下(圖3A，3B)呈短柱狀，細(xì)胞核呈橢圓形、深染、染色質(zhì)均勻。慢性缺氧大鼠HE染色下(圖3C,3D)心肌細(xì)胞彌漫空泡變，心肌間質(zhì)廣泛纖維化。MASSON染色下膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。

表2各組大鼠血清和心肌的PⅠCP和PⅢNP濃度的比較

GroupSerumPⅠCPPⅢNPMyocardiumPⅠCPPⅢNPA69．25±8．171．16±0．01153．66±7．613．85±0．02B78．32±10．001．17±0．01160．41±1．743．85±0．01C95．10±9．59??##1．51±0．02??##181．50±10．84??##4．10±0．01??##D115．85±9．16??##△△1．83±0．01??##△△216．15±11．50??##△△4．24±0．01??##△△E235．64±10．43??##△△▲▲2．48±0．02??##△△▲▲279．78±6．54??##△△▲▲5．05±0．02??##△△▲▲

PⅠCP: procollagen Ⅰ C-propeptide; PⅢNP: procollagen Ⅲ N-propeptide. Compared with group A,**P<0.01； compared with group B,##P<0.01； compared with group C,△△P<0.01； compared with group D,▲▲P<0.01

表3 心肌HSP47 mRNA與血清和心肌的PⅠCP和PⅢNP相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of cardiac HSP47 mRNA and PⅠCP and PⅢNP in serum or myocardium

PⅠCP: procollagen Ⅰ C-propeptide; PⅢNP: procollagen Ⅲ N-propeptide; HSP47: heat shock protein 47

圖3 大鼠心肌組織HE和MASSON染色Figure 3 HE staining and MASSON staining of myocardial tissue A: control group(HE ×200); B: control group(MASSON ×200); C: chronic hypoxia group(HE ×400); D: chronic hypoxia group (MASSON ×400)

3 討 論

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是指心肌正常組織結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的以細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為主要表現(xiàn)的疾病[5，6]。心肌過量纖維化是心室重構(gòu)的重要標(biāo)志，心肌纖維化導(dǎo)致心臟僵硬度增加、心臟順應(yīng)性降低，心臟傳導(dǎo)阻滯，心臟收縮及舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生[7，8]。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)是由Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、Ⅵ型膠原構(gòu)成，其中以Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原為主[9]。 心肌膠原中含Ⅰ型膠原約80%，因其纖維比較粗、僵硬度很大以及抗?fàn)坷δ茌^強(qiáng)，從而在維持室壁強(qiáng)度上起重要的作用。心肌膠原中含Ⅲ型膠原約11%，Ⅲ型膠原的纖維比較細(xì)，且其彈性和伸展性比較好。在維持心肌組織正常結(jié)構(gòu)和心臟功能完整性方面，Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原的比例具有很重要的意義[6]。研究表明[10，11]。PⅠCP C基末端肽可作為Ⅰ型膠原蛋白合成的標(biāo)志物，PⅢNP N基末端肽可作為Ⅲ型膠原蛋白合成的標(biāo)志物，因此在實(shí)驗(yàn)中檢測PⅠCP和PⅢNP 濃度就可反映膠原含量以及膠原合成和降解的情況，故PⅠCP和PⅢNP可成為MF重要的指標(biāo)。HSP47作為熱休克蛋白家族中唯一的膠原特異性分子伴侶，與膠原前體的加工、折疊、合成、分泌等過程密切相關(guān)，特別是與Ⅰ型膠原的分泌有關(guān)。HSP47與膠原合成密切相關(guān)，兩者表達(dá)有時(shí)間和空間上的一致性[12]，這種一致性在培養(yǎng)細(xì)胞[13]、胚胎組織發(fā)育[14]和組織纖維化中均得到了證實(shí)。因此可通過觀察HSP47 mRNA的表達(dá)量來間接反映心肌纖維化程度。所以通過檢測血清、心肌的PⅠCP、PⅢNP的濃度、心肌HSP47 mRNA表達(dá)聯(lián)合組織病理學(xué)(HE染色、Masson)檢測可以反映出缺氧導(dǎo)致心肌纖維化的程度。

本研究應(yīng)用ELISA法檢測血清、心肌PⅠCP、PⅢNP的濃度，應(yīng)用q-PCR技術(shù)檢測各組大鼠HSP47 mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，模型組中的血清、心肌的PⅠCP、PⅢNP濃度和心肌HSP47 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯增多(P<0.01)；模型組內(nèi)兩兩比較，血清、心肌的PⅠCP、PⅢNP的濃度和心肌HSP47 mRNA相對(duì)表達(dá)量均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且隨缺氧時(shí)間增加而增多。對(duì)正常組大鼠和慢性缺氧組大鼠心肌組織做組織切片同樣證實(shí)：正常心肌細(xì)胞在HE染色和MASSON染色下呈短柱狀，細(xì)胞核呈橢圓形、深染、染色質(zhì)均勻。慢性缺氧大鼠HE染色下心肌細(xì)胞彌漫空泡變，心肌間質(zhì)廣泛纖維化。MASSON染色下膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，膠原纖維連接呈網(wǎng)狀。大量研究證明HSP47在膠原蛋白分泌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)與膠原特異性結(jié)合，參與膠原的折疊、裝配、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)，與膠原合成密切相關(guān)，兩者表達(dá)有時(shí)間和空間上的一致性[12]。本研究中HSP47 mRNA相對(duì)表達(dá)量與血清和心肌中PⅠCP、PⅢNP濃度均隨缺氧時(shí)間的增加而增多，并且相關(guān)性分析顯示，心肌HSP47 mRNA與血清和心肌的PⅠCP、PⅢNP、CVF呈高度線性正相關(guān)(P<0.05)，說明了HSP47 mRNA相對(duì)表達(dá)量與膠原合成一致，與朱慧等[15]的結(jié)果一致。HSP47 mRNA的表達(dá)量與膠原合成密切相關(guān)，可以間接反映心肌纖維化程度，提示HSP47作為心肌膠原分子伴侶在慢性缺氧心臟重構(gòu)、心肌纖維化中起重要作用，為治療缺氧所導(dǎo)致的心力衰竭提供了新的方法。

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