脂聯(lián)素在膝骨關節(jié)炎患者軟骨中的表達與軟骨損傷程度的關系

陳 亮，劉玉杰，魏 民

(解放軍總醫(yī)院骨科 北京 100853)

人口老齡化以及代謝疾病和肥胖人數(shù)的增多使得骨關節(jié)炎(osteoarthritis， OA)的發(fā)病率逐年增高，但目前研究人員對OA的病因還沒有充分的認識[1,2]。生化、 遺傳、機械因素對OA的發(fā)病和進展都可產生影響，脂肪組織分泌的一些細胞因子在OA的發(fā)生和發(fā)展中也起著重要作用[3,4]，瘦素、脂聯(lián)素是脂肪細胞因子當中研究最廣泛的兩種，相比瘦素的促炎性作用，脂聯(lián)素兼有促炎性和抗炎性作用[5]。1995年，Scherer首次報道脂聯(lián)素(adiponectin)是結構類似補體C1q的一種激素。膝關節(jié)是OA患者最常發(fā)病的關節(jié)，本文探討了脂聯(lián)素在膝關節(jié)OA軟骨中的表達水平以及對于OA的作用。

1 對象與方法

1.1 對象

選取解放軍總醫(yī)院骨科2016年6月至12月因OA行人工全膝關節(jié)置換術18例患者的關節(jié)軟骨樣本，其中女性15例，男性3例，年齡(67.67±7.84)歲。OA診斷標準：美國風濕病學會標準[6]。納入標準：年齡>50歲；符合OA診斷標準；患者有不同程度的內翻畸形。排除標準：除OA以外的骨或關節(jié)疾病如類風濕性關節(jié)炎患者；膝關節(jié)有外傷或手術史。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 膝關節(jié)評分 根據(jù)美國紐約特種外科醫(yī)院(hospital for special surgery, HSS)[7]膝關節(jié)評分標準對膝關節(jié)進行評價。HSS評分項目包括疼痛、活動度、肌力、穩(wěn)定、屈曲畸形等。運用計算機(Picture Achieving and Communication Systems，PACS)系統(tǒng)軟件測量患者下肢全長位X線片上膝關節(jié)的內翻角度，股骨頭中心至膝關節(jié)中心的連線，膝關節(jié)中心至踝關節(jié)窩中心的連線，兩條線的夾角即為內翻角度，每例患者測量3次取平均值。內翻畸形的診斷標準為股骨頭中心與踝關節(jié)中心的連線偏離膝關節(jié)中心。體質量指數(shù)(body mass index，BMI)計算方法：體質量(千克)÷身高(米)的平方[8]。

1.2.2 脛骨平臺軟骨損傷分級和取樣 把內、外側脛骨平臺各在矢狀軸上分別分成三等份，靠近髁間嵴的一側為近側，遠離髁間嵴的一側為遠側，兩者之間為中側。根據(jù)Outerbridge[9]標準評定脛骨平臺軟骨損傷程度，Ⅰ級: 軟骨變軟或出現(xiàn)空泡；Ⅱ級：軟骨出現(xiàn)破損，破損不累及全層的50%；Ⅲ級：軟骨出現(xiàn)破損，累及超過全層50%；Ⅳ級： 裸露軟骨下骨。 外側脛骨平臺和內側脛骨平臺軟骨均取自遠側，距軟骨下骨邊緣<0.5 cm，每例接受膝關節(jié)置換術患者取內側脛骨平臺Ⅳ級損傷軟骨和外側脛骨平臺非Ⅳ級損傷軟骨。

1.2.3 脂聯(lián)素表達水平的檢測 RNA提取試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司。反轉錄試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司。Thermo ST 16R臺式高速離心機購自賽默飛世爾科技有限公司，實時熒光定量PCR儀Mx3000P購自安捷倫科技有限公司。(1)RNA的提?。河醚心パ兴檐浌浅史勰睿浌欠勰┲屑尤隩RIzon試劑，裂解5 min后，往管中添加0.2 ml三氯甲烷，靜置5 min后，4℃，12 000轉/min，離心15 min。離心后RNA主要在上層水相里。吸出上層水相注入新的離心管中，加入等體積的異丙醇，4℃，2000轉/min，離心10 min，離心管底部絮狀沉淀為RNA。棄去管中的液體，加入1 ml無水乙醇，4℃，7500轉/min，離心5 min，離心后棄去管中液體，管中風干后，加入15 μl RNase Free DH2O，用超微量分光光度計檢測各離心管中的RNA濃度。(2)反轉錄cDNA：反轉錄體系：5×RT Buffer 4 μl、Oligo dT 1 μl、dNTP mixture 1 μl、RNase Free DH2O 6.1 μl、RT 1 μl、Total RNA+RNase Free DH2O 4 μl、25 mmol/L MgCl22.4 μl、Recombinant RNase Inhibitor 0.5 μl，共20 μl。反轉錄條件：70℃，15 min，42℃，1 h。反轉錄后得到的cDNA貯存于-70℃冰箱備用。(3)實時熒光定量PCR反應：脂聯(lián)素上游引物:5’-ATGGGGAAGGAGAGCGTAAT-3’，下游引物: 5’-ATTGACTTTGGGGCTGTTTG-3’；內參上游引物:5’-TGGACCTGACCTGCCGTCTA-3’，下游引物: 5’-GGTGTCGCTGTTGAAGTCAGA -3’。

熒光定量PCR反應體系為:UltraSYBR Mixture 10 μl，引物1 μl，cDNA 1 μl，dH2O 8 μl，總體積20 μl。反應條件：變性95℃，15 s，退火60℃，1 min，延伸70℃，1 min。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 患者基本資料

18例OA患者均首次接受全膝關節(jié)置換術，內翻角度為(9.56°±3.08°)，HSS評分為(40.06±8.33)分，BMI為 27.40±4.10，體質量為(69.16±10.29)kg。HSS評分結果：18例患者均有行走時嚴重疼痛，行走<500 m或不能行走；12例患者膝關節(jié)屈曲<120°，6例患者<90°；1例患者有輕度屈曲畸形；14例肌力能帶動關節(jié)活動，4例不能帶動關節(jié)活動；15例患者關節(jié)穩(wěn)定性正常，3例輕度不穩(wěn)。

2.2 脂聯(lián)素的擴增和熔解曲線

計算機采集到熒光信號強度為0.1時，記錄樣本目的基因和內參基因的Ct值即循環(huán)數(shù)，兩者循環(huán)數(shù)的差值為ΔCt值。外側脛骨平臺軟骨脂聯(lián)素的ΔCt平均值為(1.42±0.55)個循環(huán)，內側脛骨平臺軟骨脂聯(lián)素的ΔCt平均值為(1.93±0.85)個循環(huán)。結果表明，軟骨中脂聯(lián)素基因和內參基因擴增效果良好，內側脛骨平臺軟骨脂聯(lián)素表達水平低于外側脛骨平臺軟骨，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。圖1為同一患者內側脛骨平臺Ⅳ級損傷軟骨和外側脛骨平臺非Ⅳ級損傷軟骨的脂聯(lián)素擴增和熔解曲線。圖2為18例患者內、外側軟骨脂聯(lián)素的相對表達水平。

2.3 內外側脛骨平臺脂聯(lián)素ΔCt相關因素分析

以脂聯(lián)素ΔCt 值為因變量，多元線性回歸分析其與BMI、HSS評分和內翻角的相關性。結果表明內側脛骨平臺的ΔCt值與BMI、HSS評分和內翻角呈負相關(P<0.05;表1)。

3 討 論

脂聯(lián)素既具有促炎作用，也有抗炎作用，其既能促進OA發(fā)生，也能抵抗OA發(fā)生[10]。本研究結果表明外側脛骨平臺非Ⅳ級損傷軟骨的脂聯(lián)素表達水平高于內側脛骨平臺Ⅳ級損傷軟骨的脂聯(lián)素表達水平，可能與脂聯(lián)素在關節(jié)不同病變階段發(fā)揮不同作用有關。

本研究結果表明，內側脛骨平臺的ΔCt值與BMI、HSS評分和內翻角呈負相關，由于ΔCt值越大，脂聯(lián)素表達水平越低，脂聯(lián)素表達水平與BMI、HSS評分和內翻角呈正相關。根據(jù)Kidwai等[11]的研究結果，相比BMI正常人群，BMI≥30 kg/m2的人群患OA的概率顯著增加。我們認為， BMI≥30 kg/m2的人群軟骨中的脂聯(lián)素較正常人更高。再次提示了脂聯(lián)素與軟骨損傷有關[12]。Nihan等[13]的研究表明，相比正常對照組，OA組患者的血漿脂聯(lián)素濃度更高，差異有統(tǒng)計學意義。校正患者的年齡、性別、BMI后，差異則無統(tǒng)計學意義，說明肥胖能促進OA的發(fā)生和發(fā)展[14-16]。

圖1 Adiponectin基因熒光定量PCR擴增和熔解曲線

Figure 1 Amplification plots and dissociation curves of adiponectin gene by real-time quantitative PCR

A: amplification plots; B: dissociation curve (grade Ⅳ cartilage. a: adiponectin gene; b: reference gene); C: amplification plots; D: dissociation curve (non-grade Ⅳ cartilage. c: adiponectin gene; d: reference gene)

圖2 脛骨平臺軟骨脂聯(lián)素相對表達水平Figure 2 Relative expression levels of adiponectin in cartilage

DependentvariableIndependentvariableBetatPvalueΔCtvalueoflateraltibialplateau[a]HSSvalue0．1120．4530．792Varusangle-0．067-0．2680．657BMI-0．095-0．3820．708ΔCtvalueofmedialtibialplateau[b]HSSvalue-0．54-3．0250．009Varusangle-0．459-2．6460．021BMI-0．496-2．2880．036

HSS: hospital for special surgery; BMI: body mass index.t[ab]=2.576,P[ab]=0.02

HSS評分高的患者軟骨損傷相對較輕。HSS評分提高與軟骨脂聯(lián)素表達水平的升高有關，這與本文的內側、外側軟骨脂聯(lián)素表達水平差異相符。內翻畸形可以引起膝關節(jié)受力不均，加劇OA。內翻畸形患者內翻角的增大，導致內側脛骨平臺受力不均，軟骨磨損加劇，本研究結果表明內翻角增大與軟骨中脂聯(lián)素表達水平升高有關，提示軟骨脂聯(lián)素的表達水平與軟骨損傷程度也有關，軟骨磨損加劇和脂聯(lián)素表達水平升高的關系仍需進一步研究。

本研究通過患者軟骨樣本研究脂聯(lián)素的表達水平，比用培養(yǎng)的軟骨細胞更能準確反映OA患者關節(jié)軟骨的損傷程度，同時從一個關節(jié)獲得兩種損傷程度不同的軟骨標本進行比較，可排除年齡、性別、BMI和其他因素的干擾，結果更準確。手術同時獲取軟骨標本，其損傷程度的判斷比通過影像學、組織學診斷更準確。在外側脛骨平臺取非Ⅳ級損傷軟骨作為對照，這樣可減少或避免取內側脛骨平臺非Ⅳ級損傷軟骨作對照時和Ⅳ級損傷軟骨混雜，結果更有意義。

鑒于脂聯(lián)素的表達水平與OA軟骨的損傷程度有關，下一步還需研究軟骨脂聯(lián)素表達水平與OA損傷程度產生聯(lián)系的機制，確定脂聯(lián)素在檢測OA疾病和評估OA療效方面的準確定位。目前，已經有學者提出，脂聯(lián)素有望成為各種疾病易于檢測的穩(wěn)定的生物標志物[17]。

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