PI3K/mTOR/自噬通路在間歇性低氧加重全腦缺血大鼠神經(jīng)損傷中的作用

郭向飛，趙雅寧，李建民，劉文倩，陳長(zhǎng)香

（華北理工大學(xué)1.護(hù)理與康復(fù)學(xué)院社區(qū)護(hù)理教研室；2.附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山063000）

PI3K/mTOR/自噬通路在間歇性低氧加重全腦缺血大鼠神經(jīng)損傷中的作用

郭向飛1，趙雅寧1，李建民2，劉文倩1，陳長(zhǎng)香1

（華北理工大學(xué)1.護(hù)理與康復(fù)學(xué)院社區(qū)護(hù)理教研室；2.附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山063000）

目的比較常態(tài)大鼠和間歇性低氧大鼠全腦缺血再灌注后磷脂酰肌醇3激酶（PI3?K）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及Beclin?1表達(dá)變化，探討PI3K/mTOR/自噬通路在間歇性低氧加重全腦缺血大鼠神經(jīng)損傷中的作用。方法80只雄性Wistar大鼠采用數(shù)字隨機(jī)法隨機(jī)分成假手術(shù)組（SO組）、單純腦缺血再灌注組（I/R組）、間歇性低氧7 d腦缺血再灌注組（IH7+I/R組）以及間歇性低氧21 d腦缺血再灌注組（IH21+I/R組），每組20只。造模前，IH7+I/R組、IH21+I/R組分別給予間歇性低氧7和21 d。采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制備腦缺血再灌注模型，HE染色、電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化；免疫組織化學(xué)法、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠腦組織海馬CA1區(qū)PI3?K、mTOR和Beclin?1表達(dá)情況；Morris水迷宮測(cè)試檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。結(jié)果與SO組比較，I/R組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能下降；免疫組化示PI3?K、mTOR和Beclin?1免疫陽性細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；實(shí)時(shí)定量PCR示PI3?K、mTOR和Beclin?1表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。與I/R組比較，IH7+I/R組和IH21+I/R組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷加重，存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降；免疫組化示PI3?K、mTOR和Beclin?1免疫陽性細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；實(shí)時(shí)定量PCR示PI3?K、mTOR和Beclin?1表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）；上述變化在IH21+I/R組更為顯著（P＜0.05）。結(jié)論間歇性模式低氧可加重全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)損傷，其機(jī)制與PI3K/mTOR/自噬通路活化有關(guān)。

間歇性低氧；腦缺血再灌注；磷脂酰肌醇3激酶；雷帕霉素靶蛋白；自噬

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstruc?tive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）能夠加重腦缺血后引起的神經(jīng)損傷，是使缺血性卒中發(fā)病率和死亡率增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1-2］。研究［3］顯示，腦缺血后認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵與腦組織缺血缺氧后某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)生紊亂以及神經(jīng)細(xì)胞死亡密切相關(guān)。自噬是真核細(xì)胞中產(chǎn)生的一種細(xì)胞防御機(jī)制，最終決定細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸：修復(fù)、損傷、加重或死亡［4］。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3?kinase，PI3?K）/Akt/雷帕霉素靶蛋白（mammalian tar?get of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路參與真核細(xì)胞的自噬、增殖和凋亡等多重過程，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用［5?6］。因此，推測(cè)PI3K/mTOR/自噬通路在間歇性低氧加重腦缺血后神經(jīng)損傷病理過程中具有重要作用。本研究采用間歇性低氧大鼠制作全腦缺血再灌注模型，觀察大鼠海馬區(qū)PI3K/ mTOR/自噬通路的表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞丟失變化情況，探討其在間歇性低氧加重腦缺血再灌注神經(jīng)損傷中的作用，為臨床OSAHS并發(fā)缺血性腦血管疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar雄性大鼠80只，由北京維通利華公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2012?013。低氧控制程序，購(gòu)自清華大學(xué)科技研發(fā)中心；測(cè)氧儀，購(gòu)自建德市梅城電化分析儀器廠；動(dòng)物低氧艙，購(gòu)自中國(guó)淮北正華科技有限公司；純氮，購(gòu)自唐山大眾氣體高科技有限公司；Morris水迷宮，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所。

1.2 動(dòng)物分組和模型制備

大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組（SO組）、單純腦缺血再灌注組（I/R組）、間歇性低氧7 d腦缺血再灌注組（IH7+I/R組）、間歇性低氧21 d腦缺血再灌注組（IH21+I/R組），每組20只。

SO組分離并暴露血管，不電凝椎動(dòng)脈、不夾閉頸總動(dòng)脈；I/R組、IH7+I/R組、IH21+I/R組采用改良的Pulsinelli的四血管閉塞法制作大鼠全腦缺血模型。

IH7+I/R組、IH21+I/R組大鼠每日8：00～15：00置于低氧艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)?、空氣，?20 s為1個(gè)循環(huán)周期，連續(xù)給予氮?dú)?0 s，使艙內(nèi)氧濃度維持在5%～21%。采用數(shù)字測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)低氧艙內(nèi)氧濃度，分別持續(xù)7和21 d。

1.3 電鏡觀察

分別于缺血再灌注后6和24 h每組隨機(jī)抽取5只大鼠，取大鼠大腦海馬CA1區(qū)組織，切成1 mm3組織塊，40 ml/L戊二醛固定，0.1 mol/L二甲砷酸緩沖液沖洗2次；10 g/L四氧化鋨固定，緩沖液沖洗2次；4℃過夜。丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

1.4 HE染色

分別于缺血再灌注后6和24 h，每組隨機(jī)抽取5只大鼠，4%多聚甲醛心臟灌注固定，斷頭取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織，脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、二甲苯透明及HE染色，光學(xué)顯微鏡（400倍）下觀察。

1.5 免疫組化染色

標(biāo)本采集同HE染色，切片脫蠟至水、0.3%H2O2封閉10 min、熱修復(fù)抗原1.5 min，分別滴加PI3?K、mTOR及Beclin?1抗體，濕盒中37℃孵育30 min，然后滴加二抗，37℃恒溫箱孵育40 min，DAB顯色、脫水、透明、中性樹膠封片，400倍光鏡下觀察。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)

分別于缺血再灌注后6和24 h，每組隨機(jī)抽取5只大鼠，取大鼠海馬CAl區(qū)組織50～100 mg，加入Trizol試劑1 mL后勻漿，提取總RNA。測(cè)量OD260值，根據(jù)OD260計(jì)算RNA濃度，-80℃保存。PI3?K引物序列：正義鏈5’?GAAACCCAGTCACCTAGGGC?3’，反義鏈5’?GGTGGGCAGTACGAACTCAA?3’。mTOR引物序列：正義鏈5’?GGTGGACGAGCTCTTT GTCA?3’；反義鏈5’?AGGAGCCCTAACACTCGGAT?3’。Beclin?1引物序列：正義鏈5’?CTCTCGTCAAG GCGTCACTTC?3’；反義鏈5’?CCTTAGACCCCTCCA TTCCTCA?3’。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性15 s，56℃退火20 s，72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。采用2-△△Ct計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 水迷宮測(cè)試

實(shí)驗(yàn)大鼠于缺血再灌注后48 h進(jìn)行測(cè)試，安全島置于水迷宮第二象限。大鼠分別從4個(gè)象限固定位置投放，記錄大鼠找到平臺(tái)所需要的潛伏期。如果大鼠90 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，潛伏期記為90 s。由攝像機(jī)及計(jì)算機(jī)拍攝并統(tǒng)計(jì)大鼠分別由4個(gè)象限入水后尋找到安全島的潛伏值和穿臺(tái)次數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Excel 2003將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫，所有數(shù)據(jù)均用表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行重復(fù)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK?q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

SO組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核清晰，核仁明顯。I/R組大鼠可見較多腫脹的神經(jīng)元，結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮、深染，部分神經(jīng)元胞核完全消失，形成空泡狀結(jié)構(gòu)。IH7+I/R組、IH21+I/R組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)破壞較嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮、深染，部分神經(jīng)元胞核完全消失，形成空泡狀結(jié)構(gòu)；其中IH21+I/R組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)破壞更為嚴(yán)重。圖像分析結(jié)果顯示，與SO組比較，I/R組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞存活率均下降（P＜0.05）；與I/R組比較，IH7+I/R組、IH21+I/R組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞存活率均下降（P＜0.05），上述變化在IH21+I/R組更為顯著（P＜0.05）。見表1、圖1。

2.2 電鏡觀察

SO組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞核規(guī)則，核膜光滑，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻散在，神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量豐富，結(jié)構(gòu)正常。I/R組大鼠海馬神經(jīng)元核膜溶解，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)凝聚固縮，神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)較完整。IH7+I/R組細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器消失。IH21+I/R組細(xì)胞核皺縮明顯，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)溶解，神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)模糊。見圖2。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞存活率比較（%）Tab.1Comparison of neurons survival rate in hippocampal CA1 region of rats in each group（%）

圖1 各組大鼠缺血再灌注24 h后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元HE染色×400Fig.1Neurons in hippocampal CA1 region of rats after I/R 24 h in each group HE×400

2.3 水迷宮測(cè)試

與SO組比較，I/R組大鼠水迷宮檢測(cè)的逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.05）；與I/R組比較，IH7+I/R組、IH21+I/R組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間均延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)均減少（P＜0.05）；與IH7+I/R組比較，IH21+I/R組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.05）。見表2。

2.4 免疫組化染色

PI3?K、mTOR和Beclin?1免疫組化染色呈棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)中，主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞中。SO組偶見PI3?K、mTOR和Beclin?1免疫陽性細(xì)胞；與SO組比較，I/R組大鼠PI3?K、mTOR和Beclin?1在各時(shí)間點(diǎn)（6和24 h）免疫陽性細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；與I/R組比較，IH7+I/R組、IH21+I/R組大鼠PI3?K、mTOR和Beclin?1在各時(shí)間點(diǎn)（6和24 h）免疫陽性細(xì)胞數(shù)均增加（P＜0.05），上述變化在IH21+I/R組更為顯著（P＜0.05）。見表3，圖3。

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠缺血再灌注24 h后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化×20 000Fig.2Morphological changes of neurons in hippocampus of rats detected by electron microscope after I/R 24 h in each group×20 000

表2 各組大鼠水迷宮潛伏時(shí)間和穿臺(tái)次數(shù)的比較Tab.2Comparison of escaping latency and frequency of crossing the platform in the water maze test in each group

表3 各組大鼠海馬區(qū)PI3?K、mTOR、Beclin?1免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)/高倍鏡視野）Tab.3Comparison of the number of PI3?K，mTOR and Beclin?1 immunoreactive cells in hippocampus of rats in each group（number/ high?power field）

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR

與SO組比較，I/R組大鼠在在各時(shí)間點(diǎn)（6和24 h）PI3?KmRNA、mTORmRNA及Beclin?1mRNA表達(dá)明顯增高（P＜0.05）。與I/R組比較，IH7+I/R組、IH21+I/R組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)（6和24 h）PI3?K mRNA、mTORmRNA及Beclin?1mRNA表達(dá)增高（P＜0.05）；上述變化在IH21+I/R組更為顯著（P＜0.05）。見表4。

3 討論

OSAHS不僅是一種呼吸系統(tǒng)疾病，可損害并累及全身多系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損害尤為嚴(yán)重［7］。研究［8］顯示，OSAHS由于反復(fù)低氧和高碳酸血癥可引起腦代謝改變、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，啟動(dòng)并加重腦缺血再灌注病理生理進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，OSAHS低氧各組與I/R組比較，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞存活率降低，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，同時(shí)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)明顯的功能障礙，表明OSAHS模式低氧可以加重大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)損傷。與已報(bào)道的臨床研究［9-10］結(jié)果基本一致。

圖3 各組大鼠腦缺血后24 h海馬CA1區(qū)PI3?K、mTOR、Beclin?1陽性表達(dá)情況免疫組化×400Fig.3Expressions of PI3?K，mTOR and Beclin?1 of neurons in hippocampal CA1 region after I/R 24 h in each group Immunohisto?chemistry×400

表4 各組大鼠海馬區(qū)PI3?K、mTOR、Beclin?1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化Tab.4Changes of the mRNA expressions of PI3?K，mTOR and Beclin?1 in hippocampus nerve cell in each group

自噬是真核細(xì)胞在生理或病理因子作用下通過溶酶體途徑對(duì)功能受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行識(shí)別、降解和轉(zhuǎn)復(fù)的一種現(xiàn)象，是細(xì)胞除壞死和凋亡外的第3種死亡方式［11］。WANG等［12］建立大鼠全腦缺血模型，并觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在缺血前1或0.5 h加入自噬抑制劑3?甲基腺嘌呤，全腦缺血引起的神經(jīng)元損傷能明顯減輕，表明該損傷產(chǎn)生的自噬可加重腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果顯示，與I/R組比較，間歇性低氧各組大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷加重，神經(jīng)元存活率降低，Beclin?1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，且上述變化在IH21+I/R組更為明顯；表明自噬存在于單純腦缺血再灌注過程中，間歇性低氧可以進(jìn)一步促進(jìn)自噬的激活，增加腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞丟失。

自噬的激活依賴于PI3?K/Akt/mTOR信號(hào)通路，調(diào)節(jié)mTOR活性從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［13-14］。劉琨等［15］的研究結(jié)論表明七氟醚預(yù)處理通過激活P13?K/ Akt信號(hào)通路來增強(qiáng)下游mTOR活性，降低缺血再灌注期間心肌細(xì)胞的自噬水平，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。宮利等［16］采用SD大鼠建立局灶性腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)PI3?K抑制劑（LY294002）抑制PI3?K/mTOR信號(hào)通路后，自噬也相應(yīng)受到抑制，大鼠腦梗死面積增大。本研究結(jié)果顯示，間歇性低氧各組PI3?K mRNA、mTORmRNA表達(dá)增加，且上述變化均與低氧程度有關(guān)，表明間歇性低氧通過激活PI3?K/Akt/ mTOR信號(hào)通路，提高腦缺血后自噬程度，加重腦缺血后的神經(jīng)功能障礙。目前關(guān)于間歇性低氧調(diào)節(jié)PI3?K/Akt/mTOR信號(hào)活性的原因尚未明確，但研究顯示OSAHS特征性慢性間斷性缺氧，類似于缺血再灌注損傷，細(xì)胞缺氧、氧自由基、ATP耗竭以及炎性反應(yīng)等各種因素加重［17］，這可能是間歇性低氧提高腦缺血后PI3?K/Akt/mTOR通路活性的原因之一。

綜上所述，本研究結(jié)果證明間歇性低氧可提高腦缺血后的自噬水平，加重腦缺血后神經(jīng)功能障礙，與其調(diào)控PI3?K/Akt/mTOR級(jí)聯(lián)信號(hào)通路活性有關(guān)，為臨床OSAHS并發(fā)腦缺血的防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（編輯陳姜）

GUO Xiangfei1，ZHAO Yaning1，LI Jianmin2，LIU Wenqian1，CHEN Changxiang1
（1.Community Nursing Department，College of Nursing and Rehabilitation in North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China；2.Depart?ment of Neurosurgery，Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China）

ObjectiveTo investigate the changes in the expression of phosphatidylinositol 3?kinase（PI3?K），mammalian target of rapamycin（mTOR）and Beclin?1 in the hippocampus of normal rats and intermittent hypoxia rats with cerebral ischemia/reperfusion，so as to explore the role of PI3K/mTOR/autophagy pathway in global cerebral ischemia/reperfusion injury aggravated by intermittent hypoxia.MethodsA total of 80 healthy male Wistar rats were randomly divided into sham operation group（SO group，n=20），merely ischemia/reperfusion group（I/R group，n= 20），intermittent hypoxia for 7?day ischemia/reperfusion group（IH7+I/R group，n=20），and intermittent hypoxia for 21?day ischemia/reperfusion group（IH21+I/R group，n=20）.IH7+I/R group and IH21+I/R group were respectively given intermittent hypoxia for 7 days and 21 days before ischemia/reperfusion.The cerebral ischemia/reperfusion model was established by modified Pulsinelli four?vessel occlusion method.The morpholog?ical changes of nerve cells in hippocampal CA1 region were observed by HE staining and electron microscope.The protein expressions of PI3?K，mTOR and Beclin?1 of nerve cells in hippocampal CA1 region were detected by immunohistochemical staining and RT?PCR.The learning memory capacity of rats were assessed by the Morris water maze test.ResultsCompared with SO group，I/R group increased the never cells morphology damages，reduced the number of survival neurons，and declined the ability of learning and memory（P＜0.05）.Immunohistochemistry showed that the number of PI3?K immunoreactive cell，mTOR immunoreactive cell and Beclin?1 immunoreactive cell increased in I/R group compared with S0 group（P＜0.05）.RT?PCR showed that the expressions ofPI3?K，mTORandBeclin?1increased in I/R group compared with S0 group（P＜0.05）.Compared with I/R group，intermittent hypoxia groups increased the never cells morphology damages，decreased the number of survival neu?rons，and declined the ability of learning and memory（P＜0.05）.Immunohistochemistry showed that the number of PI3?K immunoreactive cell，mTOR immunoreactive cell and Beclin?1 immunoreactive cell increased in IH7+I/R and IH21+I/R groups compared with I/R group（P＜0.05）. RT?PCR showed that the expressions ofPI3?K，mTORandBeclin?1increased in IH7+I/R and IH21+I/R groups compared with I/R group（P＜0.05），and the changes were more significant in IH21+I/R group（P＜0.05）.ConclusionIntermittent hypoxia can aggravate neurological injury after ischemia，which is related to PI3K/mTOR/autophagy pathway activation.

intermittent hypoxia；cerebral ischemia；phosphatidylinositol 3?kinase；mammalian target of rapamycin；autophagy

R743

A

0258-4646（2017）01-0062-06

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.01.014

Role of PI3K/mTOR/autophagy Pathway in Global Cerebral Ischemia/reperfusion Injury Aggravated by Intermittent Hypoxia in Rats

郭向飛（1989-），女，碩士研究生.

趙雅寧，E-mail：zyning789@126.com

2016-06-13

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