內(nèi)皮素受體在人食管下括約肌上的分布及其作用

張珂劉俊峰何士驕樊崇利吳艷剛包永松宋曉輝

·論著·

內(nèi)皮素受體在人食管下括約肌上的分布及其作用

張珂1劉俊峰2何士驕3樊崇利4吳艷剛4包永松4宋曉輝4

目的通過檢測(cè)各內(nèi)皮素受體（ETR）亞型在人食管下括約?。↙ES）上，特別是套索纖維和鉤狀纖維上的分布規(guī)律，探討內(nèi)皮素對(duì)LES收縮和舒張功能的作用。方法在罹患食管中上段癌患者的術(shù)后標(biāo)本上，取LES的套索纖維和鉤狀纖維，并分別以食管下段和胃底部的環(huán)形肌肉作為對(duì)照。采用蛋白印跡法（Western Blot）、RT－PCR和半定量PCR（semi－qPCR）分析ETR在人LES上的分布規(guī)律。結(jié)果ETR的A亞型（ETA）和B亞型（ETB）被確認(rèn)都存在于LES上。ETR兩個(gè)受體亞型的蛋白質(zhì)和m RNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝533.841，P＜0.01；F＝72.291，P＜0.01）。ETA顯著高于ETB表達(dá)量（約為5∶1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而同一受體亞型在鉤狀纖維（C）、套索纖維（S）、食管下端環(huán)形?。‥）、胃底環(huán)形肌（G）4個(gè)位點(diǎn)上的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0.398，P＝0.5329）。結(jié)論ET受體，特別是ETA受體亞型在人LES的舒張、收縮功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，是食管運(yùn)動(dòng)障礙性疾病治療的靶向受體。

ET受體； 食管下括約??； 鉤狀纖維； 套索纖維； 人

在人體內(nèi)分布有內(nèi)皮素受體（endothelin receptor，ETR）的生理系統(tǒng)內(nèi)，ET通過與兩個(gè)不同的ETR亞型（ETA和ETB）結(jié)合來發(fā)揮作用。ETR的兩個(gè)亞型都是G蛋白偶聯(lián)受體超家族內(nèi)的一員，相對(duì)分子量為45 000～50 000。其結(jié)構(gòu)在所有哺乳動(dòng)物體內(nèi)都是高度保守的，并且生物特性也因?yàn)榇蟛糠值姆肿咏Y(jié)構(gòu)相同而相似。特別是保守的2和5跨膜區(qū)已經(jīng)被證實(shí)在受體亞型與選擇性配體結(jié)合和多肽類物質(zhì)錨定過程中發(fā)揮了重要的作用［1－8］。

既往的一些研究［9－11］已經(jīng)證實(shí)ETR各亞型均存在于諸如老鼠、豚鼠和兔子等哺乳動(dòng)物的整個(gè)胃腸道內(nèi)。然而，卻幾乎沒有關(guān)于ETR在人食管下括約?。╨ower esophageal sphincter，LES）上的研究。

食管運(yùn)動(dòng)性疾病，例如胃食管反流性疾病和賁門失弛緩癥，都被認(rèn)為是LES出現(xiàn)了功能紊亂造成的。目前除了外科手術(shù)，對(duì)這類疾病的有效內(nèi)科治療還未問世。以往的研究［12－13］表明內(nèi)皮素能夠引起食管黏膜肌層的收縮，因此，ETR的激動(dòng)劑和拮抗劑可能成為治療食管運(yùn)動(dòng)性疾病的潛在藥物。

材料和方法

一、臨床資料

本實(shí)驗(yàn)所用肌條取自于2011年11月至2012年12月在河北省腫瘤醫(yī)院就診的32例中段食管癌患者，其中男性24例，女性8例；年齡51～70歲，平均年齡61歲。剔除有胃食管反流性疾病或其他食管動(dòng)力障礙性疾病史的病例。每一份標(biāo)本在手術(shù)室內(nèi)整塊切除后，均立即放置于低溫Krebs溶液［14］內(nèi)保存，標(biāo)本如含有肉眼可見的癌組織也被排除。本實(shí)驗(yàn)的知情同意書已獲河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、標(biāo)本獲取

在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，新鮮的食管胃結(jié)合部標(biāo)本被立即放置于4℃的TBS液內(nèi)，以37℃Krebs溶液沖洗固定于蠟盤上并浸泡在TBS液內(nèi)，并以5%CO2混合95%O2保證標(biāo)本活性；然后以銳性分離的方法輕柔地將黏膜層和黏膜下層組織去除；最后分別自套索纖維、食管下端環(huán)形肌、鉤狀纖維和胃底環(huán)形肌制備肌條。

LES是位于食管胃結(jié)合部的一條環(huán)形增厚的肌肉。套索纖維和鉤狀纖維被認(rèn)為分別是臨近胃大彎和胃小彎的賁門處環(huán)形增厚的平滑肌組織［15－16］；同時(shí)準(zhǔn)備了食管下端和胃底部的環(huán)形肌條作為對(duì)照。所有環(huán)形肌條必須防止全層自標(biāo)本上分離出，以避免標(biāo)本內(nèi)含有肌間神經(jīng)叢和縱行肌束。解剖下來的肌條立即凍于液氮內(nèi)，放置于－80℃冰箱內(nèi)保存（圖1）。

圖1 食管胃結(jié)合部標(biāo)本沿胃大彎切開后固定于蠟盤上，銳性分離掉掉黏膜和黏膜下組織

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄：各位點(diǎn)的肌條組織均以100 mg∶1 ml的組織、試劑比在TRIzol（美國Invitrogen公司）試劑中勻漿化后，再以12 000×g離心5 min；提取出總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

2.RT－PCR的反應(yīng)條件：引物如表1所示。各ETR亞型的反應(yīng)條件都相同（包括內(nèi)參）：95℃初始變性5 min，43個(gè)循環(huán)擴(kuò)增（95℃30 s，58℃30 s，72℃延伸45 s）；72℃10 min終止反應(yīng)?？瞻讓?duì)照采用不含引物的cDNA樣品擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物取6～8μl在1.5%～2%瓊脂糖凝膠電泳。然后用Gel－Pro凝膠成像分析系統(tǒng)分析記錄，通過ETR各亞型擴(kuò)增產(chǎn)物所測(cè)量出的灰度值與β－actin內(nèi)參的比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT－PCR引物

3.實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：引物如表2所示。各ETR亞型的每個(gè)反應(yīng)條件都相同（包括內(nèi)參）（美國Life公司ABI 7500）：初始變性溫度95℃，10 min，擴(kuò)增43個(gè)循環(huán)（變性95℃15 s，56℃退火15 s，延伸溫度72℃30 s），最后熔解曲線驗(yàn)證。m RNA相對(duì)表達(dá)量E目標(biāo)＝2－（Ct目標(biāo)－Ctβ－actin）［17］由ABI 7500機(jī)器自帶軟件處理。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR引物

4.蛋白印跡法（Western Blot）：電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜、抗體封閉及洗膜。最后，應(yīng)用LI－COR公司的奧德賽紅外影像儀處理顯色、掃描PVDF膜并攝像。再以奧德賽3.0軟件統(tǒng)計(jì)相對(duì)表達(dá)量（IOD值），做半定量分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。EAT和ETB的mRNA和蛋白相對(duì)表述量以±s表示，組間比較以單因素方差分析（ANOVA）處理，SNK－q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ETA m RNA和ETB m RNA的表達(dá)

1.RT－PCR檢測(cè)：ETR的兩種受體mRNA均被檢測(cè)到表達(dá)于人LES上，且兩種受體亞型的表達(dá)量有顯著差異，ETA的表達(dá)要強(qiáng)于ETB（圖2），同一受體亞型在檢測(cè)的4個(gè)肌條之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。

圖2 同一肌條上，ETA和ETB的表達(dá)量有顯著差異，且4個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)情況類似。N：空白對(duì)照；β－actin：內(nèi)參

圖3 檢測(cè)的4個(gè)肌條上，同一受體的表達(dá)量無顯著差異。C：鉤狀纖維（clasp）；S：套索纖維（sling）；E：食管下端環(huán)形?。╡sophagus）；G：胃底環(huán)形?。╣astric fundus）

2.半定量PCR（semi－qPCR）檢測(cè)：ETR兩種受體亞型的檢測(cè)結(jié)果顯示，在同一肌條上的擴(kuò)增曲線分離（圖4），其表達(dá)量有顯著差異（F＝72.291，P＜0.01）；而同一亞型m RNA在4個(gè)位點(diǎn)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0.398，P＝0.533）（圖5）。

圖4 qPCR各擴(kuò)增曲線分離

圖5 qPCR檢測(cè)顯示，同一肌條上2個(gè)受體亞型表達(dá)量有顯著差異（F＝72.291，P＝0.000）；同一受體亞型在檢測(cè)的各位點(diǎn)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝0.398，P＝0.533）。C：鉤狀纖維（clasp）；S：套索纖維（sling）；E：食管下端環(huán)形?。╡sophagus）；G：胃底環(huán)形?。╣astric fundus）

二、ETA和ETB蛋白的表達(dá)

Western Blot檢測(cè)顯示：各受體亞型蛋白均被檢測(cè)出。且根據(jù)IOD值比較發(fā)現(xiàn)：在同一肌條上，兩種亞型受體表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝533.841，P＜0.01）；同一受體亞型在4種不同肌條上的表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0.398，P＝0.755）（圖6）。

圖6 Western Blot檢測(cè)結(jié)果。在同一肌條上，兩種亞型受體表達(dá)量有顯著差異（F＝533.841，P＜0.01）；同一受體亞型在4種不同肌條上的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝0.398，P＝0.755）。C：鉤狀纖維（clasp）；S：套索纖維（sling）；E：食管下端環(huán)形?。╡sophagus）；G：胃底環(huán)形?。℅astric fundus）

討 論

ETR屬于有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體超家族，哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)分布有各個(gè)亞型。因此，ETR的激活或失活能夠調(diào)節(jié)多種生理和病理過程。

人食管動(dòng)力學(xué)疾病，例如彌漫性食管痙攣、賁門失弛緩癥、胃食管反流病、胡桃夾食管和其他疾病，均與人LES復(fù)合體的運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)密切相關(guān)。已有研究［16］證實(shí)：LES的調(diào)節(jié)包含多種受體、神經(jīng)遞質(zhì)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。CCK受體、M受體已經(jīng)被證實(shí)在LES的調(diào)節(jié)過程中起重要作用。本研究的目的是通過檢測(cè)ETR各亞型受體蛋白質(zhì)和mRNA在人LES，特別是套索纖維和鉤狀纖維組成的人LES復(fù)合體上的分布情況，為進(jìn)一步探索內(nèi)皮素在人LES的收縮和舒張過程中所發(fā)揮的作用打下基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，ETA和ETB的相應(yīng)m RNA及受體蛋白在人LES的套索纖維和鉤狀纖維中均有分布，結(jié)果與大部分學(xué)者研究結(jié)論一致。既往在哺乳動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，ETR廣泛分布于平滑肌組織中，并且與胃腸道的動(dòng)力調(diào)節(jié)和腺體分泌密切相關(guān)，并且內(nèi)皮素在腸道內(nèi)的藥理學(xué)作用也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。Kitsukawa等［18］發(fā)現(xiàn)胃平滑肌分布有兩種ETR亞型，但只有一種亞型可以引起收縮張力變化。Huang［19］發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素與ETA和ETB結(jié)合后，能夠分別引起豚鼠LES的舒張和收縮，并且他認(rèn)為內(nèi)皮素可能在LES的運(yùn)動(dòng)控制中起主要作用，因此他建議應(yīng)進(jìn)一步研究并評(píng)估內(nèi)皮素相關(guān)配體在胃食管反流病中對(duì)人LES所起的作用。

ETR的第三種受體亞型，即ETC，在部分物種體內(nèi)也被發(fā)現(xiàn)，但人體內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)ETR的表達(dá)［20］。因此，本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)了ETA和ETB兩種受體亞型。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ETA的受體蛋白和mRNA表達(dá)量最高；ETA∶ETB約為5∶1，同一亞型在不同位點(diǎn)間無差異。這是第一次采用半定量方法在人LES上證實(shí)了ETR分布，并且發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，第一次發(fā)現(xiàn)這兩種受體亞型也分布于胃底和食管體的橫行平滑肌上，但是本研究結(jié)果與Huang等［21］的研究結(jié)果不同。Huang等［21］通過藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)ETA和ETB的mRNA分布于食管平滑肌上，且ETA和ETB的表達(dá)水平基本相同。我們分析發(fā)現(xiàn)：兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異很大程度上是由于選擇了不同的實(shí)驗(yàn)方法所造成的。本研究采用的實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot被認(rèn)為比既往采用藥理學(xué)方法測(cè)定受體定量更為精確。而Huang等［21］使用的藥理學(xué)方法中，缺乏對(duì)ETR各亞型有絕對(duì)特異性結(jié)合力的配體，因此得出的結(jié)論必然存在相互干擾的誤差。另一個(gè)重要原因是，Huang等的檢測(cè)標(biāo)本與本研究不同，其所研究的是黏膜肌層的肌條，而本研究采用的是食管肌層的肌條。另外，Huang等在實(shí)驗(yàn)中通過測(cè)定Bmax判斷表達(dá)量［21］，且激動(dòng)劑為非選擇性與受體結(jié)合，這種藥理學(xué)方法檢測(cè)的靈敏度低于分子生物學(xué)方法。

在目前的研究結(jié)論基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)ETA和ETB在食管動(dòng)力學(xué)病理和生理方面的研究可能為治療此類疾病提供有效方法。ETR的高選擇性激動(dòng)劑和拮抗劑可能成為治療此類疾病的有效藥物，這類藥物的成功研制將可能取代目前存在很高并發(fā)癥的手術(shù)治療。

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Distribution and role of endothelin receptors in human lower esophageal sphincter

ZhangKe1，Liu Junfeng2，HeShijiao3，F(xiàn)anChongli4，WuYangang4，BaoYongsong4，SongXiaohui4.1DepartmentofThoracicSurgery，AffiliatedHospitalofHebeiUniversity，Baoding071000，China；2DepartmentofThoracicSurgery，TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050019，China；3DepartmentofOncology，4DepartmentofOrthopaedics，ThePeople’sHospitalofQingyuanDistrictofBaodingCity，Baoding071100，China

：LiuJunfeng，Email：tumor＠vip.qq.com

ObjectiveTo detect the distribution of endothelin receptors（ETR）in the human lower esophageal sphincter（LES），especially on the clasp and sling smooth muscle fibers of the LES，and investigate the effects of endothelins on the contraction and diastole of LES.MethodsThe sling and clasp tissues from LES were obtained from esophageal carcinoma patients，and the circular muscle tissues from the esophagus and gastric fundus were served as controls.Western Blot，RT－PCR and semi－qPCR were employed to determine the distribution of ETR in human LES.ResultsEndothelin receptor type A（ETA）and endothelin receptor type B（ETB）were found in human LES.There were significant differences in the expression of protein and m RNA between two isoforms of ETR（F＝533.841，P＜0.01；F＝72.291，P＜0.01）.The expression level of ETA was significantly higher than that of ETB（about 5：1）.For distribution of each isoform，there was no significant difference in the expression level among four sites of clasp fibers（C），sling fibers（S），lower esophageal sphincter（E）and gastric fundus circular muscle（G）（F＝0.398，P＝0.5329）.ConclusionsETRs contribute to the adjustment of contraction and diastole of human LES，especially the ETA.ETRs are the potent therapeutic targets for esophageal mobility diseases.

ET receptor； Lower esophageal sphincter； Clasp fiber； Sling fiber； Human

2016－11－05）

（本文編輯：周珠鳳）

10.3877/cma.j.issn.2095－8773.2017.01.01

國家自然科學(xué)基金（30371413）

071000 保定，河北大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科1；050019 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科2；071100 保定市清苑區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科3，骨科4

劉俊峰，Email：tumor＠vip.qq.com

張珂，劉俊峰，何士驕，等.內(nèi)皮素受體在人食管下括約肌上的分布及其作用［J/CD］.中華胸部外科電子雜志，2017，4（1）：1－6.