不同日齡略陽烏雞肌肉中肌苷酸含量的變化規(guī)律

路宏朝++張濤++王令

摘要：以18日胚齡及6、180日齡黃羽雞和略陽烏雞為研究對象，探討不同發(fā)育時(shí)期肌肉中風(fēng)味物質(zhì)的形成規(guī)律。[JP2]采用高效液相色譜儀測定腿肌和胸肌中的肌苷酸含量，利用熒光定量PCR方法檢測肌苷酸合成關(guān)鍵酶腺苷琥珀酸裂解酶（ADSL）基因的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示：黃羽雞和略陽烏雞腿肌中ADSL基因的表達(dá)、肌苷酸的含量均在6日齡時(shí)最高，胸肌中肌苷酸在180日齡時(shí)含量最高，表達(dá)趨勢基本一致；略陽烏雞腿肌和胸肌的肌苷酸含量在180日齡時(shí)明顯高于黃羽雞。同時(shí)，ADSL基因的表達(dá)量在不同時(shí)期均明顯高于黃羽雞，表明成年略陽烏雞的肉品質(zhì)優(yōu)于黃羽雞。

關(guān)鍵詞：略陽烏雞；肉品質(zhì)；肌苷酸；腺苷琥珀酸裂解酶（ADSL）

中圖分類號(hào)： S831.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0277-03

收稿日期：2015-10-12

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：2013K02-26-02）；陜西省教育廳項(xiàng)目（編號(hào)：12JS028）。

作者簡介：路宏朝（1980—），女，陜西勉縣人，碩士，副教授，主要從事動(dòng)物生理學(xué)研究。E-mail：zl780823@sina.com。

多年來，肉用家禽的選育主要側(cè)重于生長速度和肌肉產(chǎn)量2個(gè)方面，隨著家禽育種技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，飼養(yǎng)1羽體質(zhì)量為1.8 kg的肉雞僅需5周的生產(chǎn)時(shí)間。然而，家禽快速生長的同時(shí)也引發(fā)了骨骼形態(tài)異常、胴體品質(zhì)下降等一系列問題，且深加工后的肉品質(zhì)正隨著生產(chǎn)性能的提高而逐步下降[1]。大量研究表明，鮮味是評價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，而肌苷酸（inosinic acid，IMP）是決定畜禽肉質(zhì)鮮味的主要物質(zhì)[2-3]。IMP和糖蛋白在水和脂肪中加熱會(huì)產(chǎn)生明顯的肉鮮味，與谷氨酸鈉具有協(xié)同鮮味作用。肌苷酸已成為肉質(zhì)評定的重要指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物肉類產(chǎn)品的品質(zhì)評定，其含量高低間接反映出肉類食品風(fēng)味的優(yōu)劣[4-5]。腺苷琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate yase，ADSL）是肌苷酸合成過程中的關(guān)鍵酶之一。張學(xué)余等研究發(fā)現(xiàn)，ADSL基因?qū)﹄u的肌肉肌苷酸含量可產(chǎn)生一定影響[6]。

略陽烏雞是陜西省的優(yōu)良地方雞種之一，產(chǎn)于略陽縣黑河流域。略陽烏雞的體型大小位居全國四大烏雞之首，具有“六端烏”（烏皮、烏喙、烏腿、烏趾、烏舌、烏冠）、屠宰率高、蛋大微綠、肉用性能較好、兼具藥用價(jià)值等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“禽中明珠”[7]。本研究采用高效液相色譜法，測定不同發(fā)育時(shí)期略陽烏雞和黃羽雞肌肉樣中的肌苷酸含量，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析肌苷酸的關(guān)鍵合成酶——腺苷琥珀酸裂解酶（ADSL）的基因相對表達(dá)情況，初步探討略陽烏雞在不同發(fā)育時(shí)期ADSL和肌苷酸的分布規(guī)律，為雞肌肉肌苷酸含量與肌苷酸合成關(guān)鍵酶之間關(guān)系的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，并為從分子水平闡明略陽烏雞的特異鮮味機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

將數(shù)枚黃羽雞和略陽烏雞種蛋置于全自動(dòng)孵化機(jī)中孵化，分別取8、18日胚齡及6、180日齡黃羽雞和略陽烏雞的腿肌、胸肌，于-80 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑

肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海倍卓生物科技有限公司，純度為98%），甲醇（色譜純），甲酸銨（分析純），高氯酸（分析純，含量為70%～72%）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器

微電腦全自動(dòng)孵化機(jī)，超純水機(jī)，電熱鼓風(fēng)干燥箱，高速離心機(jī)，數(shù)顯分散均質(zhì)機(jī)，Waters 2695 Alliance型高效液相色譜儀，Waters 2487型紫外檢測儀，核酸定量儀（Thermo Fisher公司），熒光定量PCR儀（ABI公司）。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.150 mmol/L、pH值6.5甲酸銨緩沖溶液（流動(dòng)相）的配制

稱取3.15 g甲酸銨于1 000 mL大燒杯中，加入500 mL超純水，采用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液將其pH值調(diào)至6.5，定容至1 000 mL。使用前采用0.45 μm濾膜過濾。

1.4.20.1 mg/mL肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取1 mg肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用5%甲醇水溶液定容至10 mL，搖勻。分別取上述儲(chǔ)備液10、20、30、40 μL配制濃度為10、20、30、40 ng/mL的肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用5%甲醇水溶液定容至1 mL，搖勻。于使用前配制。

1.4.3樣品處理

分別稱取5 g胸肌、腿肌肌肉樣品，置于干凈器皿中并搗碎，加入20 mL 6%高氯酸，采用分散均質(zhì)機(jī)勻漿。以 4 000 r/min 離心15 min，收集上清；沉淀物再次加入15 mL 6%高氯酸，勻漿并離心，合并2次上清液即為提取液。提取液再經(jīng)離心，棄去沉淀物，采用配置好的NaOH溶液將提取液的pH值調(diào)整至6.5，采用水定容至100 mL，搖勻。測定前采用0.45 μm濾膜過濾，色譜經(jīng)流動(dòng)相平衡30 min后，取標(biāo)準(zhǔn)液及樣品提取液利用色譜儀進(jìn)行分析。

1.4.4色譜條件

色譜柱：Waters AtlantisTM dC18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流動(dòng)相：50 mmol/L、pH值6.5甲酸銨緩沖溶液（含5%甲醇）。流速1 mL/min、進(jìn)樣量 2 mL、紫外檢測波長 254 nm，柱溫為室溫。標(biāo)準(zhǔn)工作液、樣品提取液的運(yùn)行時(shí)間均為5 min。

1.4.5RNA提取與Real-time熒光定量PCR檢測

取不同日齡略陽烏雞的腿肌組織樣50～100 mg，在液氮預(yù)冷的研缽中研磨至粉末狀，期間須不斷補(bǔ)充液氮；加入 500 μL Trizol Reagent，搖勻后靜置5 min，于4 ℃、12 000 r/min 下離心 10 min，取上清；加入0.1 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，靜置5 min，于4 ℃、12 000 r/min下離心15 min，取上清；加入等體積異丙醇，輕輕搖勻后靜置10 min，于4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min，棄上清；采用1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，于4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，棄上清；室溫干燥，加入50 μL無RNase水，使RNA充分溶解，并檢測其濃度。按照RT-PCR System反應(yīng)體系試劑盒（TaKaRa公司）的要求，將所提取的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

采用普通PCR檢測cDNA純度，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂凝膠電泳，并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

采用Real-time熒光定量PCR檢測ADSL基因的表達(dá)情況。以雞的β-actin為內(nèi)參基因，20 μL擴(kuò)增體系為：SYBRⅡ（TaKaRa公司）10 μL、Primer F/R 3.2 μL、cDNA 2 μL、H2O 4.8 μL，引物序列見表1。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

將0.1 mg/mL肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別配制為1、2、3、4 μg/mL 肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“1.4.4”節(jié)設(shè)定色譜條件進(jìn)行色譜分析，以肌苷酸濃度為自變量（x），以相應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值為因變量（y）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明，在2～4 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，肌苷酸濃度與峰面積響應(yīng)值之間具有良好的線性關(guān)系?；貧w方程為y=43.816 9x-304.292，相關(guān)系數(shù)r=0.999 671，r2=0.999 342。標(biāo)準(zhǔn)曲線分布見圖1。

[FK（W10][TPLHC1.tif]

2.2肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜對比分析

與以往研究不同，本試驗(yàn)采用甲酸銨緩沖液作為流動(dòng)相測定了樣品中肌苷酸的含量。由標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜（圖2）可知，肌苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為0.75 min，各肌肉組織樣品與其他組分的色譜峰之間達(dá)到了較好的分離，其中與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間較為接近的是0.75 min的峰形。檢測所有樣品發(fā)現(xiàn)，色譜峰保留時(shí)間均為0.75～0.77 min，因此可確定為肌苷酸的峰形（圖3、圖4）。

2.3不同樣品肌苷酸的含量

分別取黃羽雞和略陽烏雞18日胚齡、6日齡、180日齡的胸肌和腿肌樣品，制備樣品溶液，采用“1.4.4”節(jié)的色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積套用圖1的回歸方程計(jì)算樣品中肌苷酸的含量（表2）。結(jié)果表明：與180日胚齡相比，黃羽雞6日齡的腿肌中肌苷酸含量最高（P<0.01），180日齡時(shí)下降至最低（P<0.01）；略陽烏雞6日齡的腿肌中肌苷酸含量最高，180日齡時(shí)有所降低，但仍明顯高于18日胚齡。2個(gè)雞種胸肌中的肌苷酸含量均在180日齡達(dá)到最高。略陽烏雞18日胚齡、6日齡時(shí)腿肌和胸肌中的肌苷酸含量與黃羽雞均沒有顯著差

[FK（W8][HT6H][JZ（]表2樣品中肌苷酸的含量[JZ）][HTSS]

[HJ*5][BG（！][BHDFG3，WK12，WK48W]年齡[ZB（][BHDWG1*2，WK24。2W]黃羽雞肌苷酸含量（mg/100 g）略陽烏雞肌苷酸含量（mg/100 g）

[BHDWG1*2，WK12。4W][XXZSX*2-ZSX23*2]腿肌胸肌[XXZSX*2-ZSX23*2]腿肌胸肌[ZB）W]

[BHDG1*2，WK12。5DWW]18日胚齡519.82±88.16589.67±63.30

[BHDW]6日齡934.60±115.94aa467.88±110.391 057.04±136.62aa396.00±55.23

[BH]180日齡315.15±69.55aa1 017.22±62.91921.71±100.18aabb1 481.76±79.88bb[BG）F]

注：與各組18日胚齡相比較，“a”“aa”分別表示在0.05、0.01水平下差異顯著；與黃羽雞組中不同日齡的腿肌和胸肌相比較，“b”“bb”分別表示在0.05、0.01水平下差異顯著。

異；略陽烏雞180日齡時(shí)腿肌和胸肌中的肌苷酸含量明顯高于黃羽雞，差異極顯著（P<0.01）。

2.4不同日齡黃羽雞和略陽烏雞腿肌組織中ADSL基因的mRNA表達(dá)水平

分別取8日胚齡、18日胚齡、6日齡、180日齡黃羽雞和略陽烏雞的腿肌組織提取RNA，采用Real-time熒光定量PCR檢測ADSL基因的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果表明：ADSL基因的表達(dá)隨著日齡的增加呈上升趨勢，2個(gè)雞種腿肌中ADSL基因的表達(dá)水平均在6日齡達(dá)到最高，然后逐漸下降；在18日胚齡、6日齡、180日齡階段，略陽烏雞腿肌中ADSL基因的表達(dá)均明顯高于黃羽雞（圖5）。

[TPLHC5.tif]

3結(jié)論與討論

肌苷酸（IMP）與畜禽肉類食品鮮味的產(chǎn)生密切相關(guān)[3，8]，國內(nèi)外學(xué)者對雞、豬、魚等動(dòng)物肌肉中的IMP開展了大量研究，目前世界上大多數(shù)國家均以肌苷酸含量作為評價(jià)肉類新鮮程度的指標(biāo)之一。烏骨雞具有烏皮、烏肉、烏骨等特征，是我國傳統(tǒng)的藥食兼用雞種。陳國宏等對相同地方雞種肌肉中的肌苷酸含量進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)泰和烏骨雞的肌苷酸含量很高，此結(jié)論從客觀上提示了烏骨雞鮮味優(yōu)于其他雞種[9]。王翠麗等研究發(fā)現(xiàn)，川南烏骨雞中肌苷酸等風(fēng)味物質(zhì)含量豐富[10]。目前，對于陜西略陽烏雞不同發(fā)育期肌肉中的肌苷酸含量尚無系統(tǒng)報(bào)道。

大量研究表明，肌苷酸的測定方法較多，但均存在一定缺陷。紫外分光光度法僅用于粗略定量；毛細(xì)管電泳法的分離度偏低，導(dǎo)致肌苷和腺苷單磷酸等相似物質(zhì)引起干擾；薄層層析法的操作步驟復(fù)雜，整個(gè)過程耗時(shí)多且回收率低。高效液相色譜法是一種高效、快速、高選擇性、高靈敏度的新型分離分析技術(shù)，樣品分析程序簡單快速，測定結(jié)果精確[11]。本研究采用高效液相法進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品的色譜峰保留時(shí)間大多為0.75～0.77 min，與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間基本一致，同時(shí)樣品中其他組分的色譜峰之間也達(dá)到了較好的分離效果。本試驗(yàn)采用甲酸銨為流動(dòng)相，作為水溶性弱酸鹽，其有利于延長色譜柱的使用壽命，從而可用于大量樣品的測定。

本研究檢測了黃羽雞和略陽烏雞發(fā)育期3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肌苷酸含量。結(jié)果表明，黃羽雞和略陽烏雞的腿肌均在6日齡時(shí)肌苷酸含量最高，胸肌則在180日齡時(shí)肌苷酸含量最高。隨著日齡的增加，腿肌中的風(fēng)味物質(zhì)在幼年時(shí)達(dá)到最高，然后逐漸降低；而胸肌中的風(fēng)味物質(zhì)卻逐漸增多，表明胸肌中肌苷酸的合成主要發(fā)生在成年后。比較2個(gè)雞種發(fā)現(xiàn)，略陽烏雞180日齡時(shí)腿肌和胸肌的肌苷酸含量均明顯高于黃羽雞，但其余時(shí)間段差異不顯著。對于不同雞種，肌肉發(fā)育早期肌苷酸的合成沒有顯著差異，但成年后略陽烏雞肌肉中肌苷酸的合成量明顯多于黃羽雞，因此成年略陽烏雞的肉品質(zhì)優(yōu)于黃羽雞。

肌苷酸在體內(nèi)的合成代謝過程十分復(fù)雜，從頭合成涉及10步反應(yīng)，腺苷琥珀酸裂解酶（ADSL）是催化第8步反應(yīng)的酶，也是IMP合成酶系中催化合成嘌呤核苷酸起始合成與循環(huán)的唯一雙功能酶[6，12]。該酶催化2個(gè)重要的反應(yīng)，由氨基咪唑琥珀基氨甲酰核苷酸生成氨基咪唑氨甲酰核苷酸的反應(yīng)（由SACIAR生成AICAR的反應(yīng)），以及由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸單磷酸的反應(yīng)，這2個(gè)反應(yīng)對于肌肉中肌苷酸的最終含量具有重要影響，因此ADSL基因也成為畜禽肉品鮮味研究的候選基因[12]。本研究對不同發(fā)育時(shí)期黃羽雞和略陽烏雞腿肌中ADSL基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明：對于不同雞種ADSL基因的表達(dá)趨勢基本一致，表達(dá)量均在6日齡時(shí)最高；進(jìn)一步比較不同日齡黃羽雞和略陽烏雞發(fā)現(xiàn)，略陽烏雞腿肌中ADSL基因的表達(dá)量在不同時(shí)期均明顯高于黃羽雞。這與高效液相色譜檢測肌苷酸含量的結(jié)果基本一致，表明ADSL基因的表達(dá)促進(jìn)了肌苷酸的合成。但也存在一定區(qū)別，略陽烏雞腿肌中ADSL基因的表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期均明顯高于黃羽雞，經(jīng)高效液相檢測，僅180日齡時(shí)腿肌中的肌苷酸含量明顯高于黃羽雞。這是由于肌苷酸的合成涉及10種關(guān)鍵酶，ADSL是關(guān)鍵酶之一但不是唯一酶。對于不同雞種，不同發(fā)育時(shí)期參與肌苷酸合成的關(guān)鍵酶表達(dá)的時(shí)空性也不同，從而導(dǎo)致肌苷酸的合成量表現(xiàn)出明顯差異。成年略陽烏雞肌肉中的肌苷酸含量顯著高于黃羽雞，但不同雞種間參與肌苷酸合成的其他酶的關(guān)鍵作用尚有待進(jìn)一步研究。

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