水稻粒形基因GS3的功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)與鑒定

裔傳燈++李瑋++王德榮++蔣偉++王穎++周勇++梁國(guó)華++顧銘洪

摘要：籽粒的大小和形狀是影響水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)的主要性狀。在基因GS3序列分析的基礎(chǔ)上，對(duì)該基因第2外顯子A/C和第5外顯子13 bp Indel的2個(gè)變異位點(diǎn)分別開(kāi)發(fā)功能標(biāo)記，并將其用于294份水稻微核心種質(zhì)和2007—2013年江蘇省審定的65份粳稻品種的基因型鑒定。研究結(jié)果表明，第2外顯子的A/C變異在秈粳亞種中有著相似的分布頻率，并且都對(duì)粒長(zhǎng)、粒厚和長(zhǎng)寬比有極顯著的影響。相對(duì)于基因型C而言，基因型A在秈粳亞種中都有更長(zhǎng)的粒長(zhǎng)、更薄的粒厚和更大的長(zhǎng)寬比。但是第5外顯子的13 bp 缺失變異只在粳稻中極低頻率（074%）出現(xiàn)，屬于稀有變異類(lèi)型，比13 bp插入變異有著更短的粒長(zhǎng)和更小的長(zhǎng)寬比。這些研究結(jié)果為水稻產(chǎn)量和品質(zhì)育種中充分利用基因GS3的優(yōu)異等位基因奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；粒形；基因GS3；功能標(biāo)記；變異

中圖分類(lèi)號(hào)： S511.032文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0064-04

收稿日期：2016-04-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31571624、31071382）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2010CB125904、2013CBA01405）；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（編號(hào)：15KJA210004）；揚(yáng)州大學(xué)大學(xué)生學(xué)術(shù)科技創(chuàng)新基金（編號(hào)：x2015616）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目。

通信作者簡(jiǎn)介：裔傳燈（1973—），男，江蘇鹽城人，博士，副教授，主要從事水稻遺傳育種研究。Tel：（0514）87937619；E-mail：cdyi@yzu.edu.cn。

由于人口數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)、耕地面積日益減少、自然災(zāi)害頻發(fā)和水資源不足等原因，水稻育種研究者不斷致力于提高水稻產(chǎn)量水平，確保國(guó)家的糧食安全。同時(shí)隨著生活水平的不斷提高，稻米消費(fèi)者對(duì)稻米品質(zhì)也提出了更高的要求。水稻的產(chǎn)量和稻米品質(zhì)都是受多因素控制的復(fù)雜性狀[1-2]，其中粒形是影響水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)的重要因素之一[3]。在目前已經(jīng)克隆的水稻基因中，通過(guò)調(diào)節(jié)粒形提高水稻產(chǎn)量的基因有GS3[4]、qPE9-1[5]、GW2[6]、 qGL3/GL3.1[7- 8]、qSW5/GW5[9-10]、GS5[11]、GS6[12]、GW7[1]、GW8[3]、SLG7[13]和TGW6[14]；通過(guò)調(diào)節(jié)粒形改善稻米品質(zhì)的基因有GW7[1]和GW8[3]。因此粒形性狀調(diào)控機(jī)理的研究對(duì)水稻的產(chǎn)量育種和品質(zhì)育種有著重要的參考價(jià)值。

GS3是控制水稻粒形的重要基因。Fan等研究發(fā)現(xiàn)基因GS3是控制水稻粒長(zhǎng)和粒質(zhì)量的負(fù)調(diào)控因子，以短粒水稻品種川7基因GS3的基因組序列DQ355996為參照，來(lái)自長(zhǎng)粒水稻品種明恢63的第2外顯子1 670 bp處的A堿基變異是無(wú)義突變，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白C端截短了178個(gè)氨基酸[4]。結(jié)合180個(gè)水稻品種的關(guān)聯(lián)分析，F(xiàn)an等進(jìn)一步證實(shí)在秈粳亞種中基因型A比C都有更大的平均粒長(zhǎng)[15]。除此變異外，Wang等還發(fā)現(xiàn)第4內(nèi)含子的（AT）n變異和第5外顯子的（TCC）n變異也與水稻的粒長(zhǎng)有關(guān)[16]。目前該基因還有哪些變異位點(diǎn)以及它們對(duì)水稻粒形性狀效應(yīng)還不清楚。

為了加快基因GS3有利等位變異在水稻育種工作中的應(yīng)用，本研究在序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，對(duì)第2外顯子已知的功能變異和第5外顯子未知功能的錯(cuò)義突變開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的功能標(biāo)記，結(jié)合水稻微核心種質(zhì)和近年來(lái)江蘇省審定粳稻品種的基因型檢測(cè)，分析了這些變異位點(diǎn)對(duì)水稻粒形性狀的影響，為我國(guó)尤其是江蘇省的水稻產(chǎn)量和品質(zhì)育種提供理論依據(jù)和快捷的選擇手段。

1材料與方法

1.1供試材料

本研究的供試水稻材料包括秈稻品種明恢63、粳稻品種日本晴和蘇粳2號(hào)、從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)的294份水稻微核心種質(zhì)和從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院引進(jìn)的65份江蘇省在2007—2013年期間審定的粳稻品種[17]。水稻微核心種質(zhì)包含96份國(guó)外栽培稻品種和198份中國(guó)栽培稻品種[18]，具有豐富的遺傳多樣性。供試材料來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同稻作區(qū)的水稻品種，它們的感光性存在較大的差異。為了確保能夠正常抽穗，所有供試水稻品種2014年11月于海南省陵水縣播種和育苗，2015年1月移栽大田，田間管理同于常規(guī)水稻品種。待水稻籽粒完全成熟后收種，曬干后進(jìn)行水稻籽粒相關(guān)性狀的測(cè)量。

1.2水稻成熟種子粒形相關(guān)性狀數(shù)據(jù)的測(cè)定

參照《水稻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》的方法，水稻種子收獲并風(fēng)干后，挑選飽滿(mǎn)成熟種子使用游標(biāo)卡尺（精確到0.01 mm）測(cè)量粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚，5次重復(fù)，計(jì)算平均值。千粒質(zhì)量使用電子天平測(cè)定1 000粒成熟烘干種子的質(zhì)量，3次重復(fù)，計(jì)算平均值。

1.3基因GS3序列變異的分析和功能標(biāo)記的設(shè)計(jì)

根據(jù)水稻粒形基因GS3的研究結(jié)果，從Rice genome annotation project網(wǎng)站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）下載GS3基因的基因組DNA序列DQ355996。以該序列為種子序列，在NCBI網(wǎng)站核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中找到高度同源的3個(gè)基因組DNA序列（來(lái)自秈稻品種9311的基因GS3序列Ctg009226、來(lái)自粳稻品種日本睛的基因GS3序列AB488612和來(lái)自粳稻品系H343的基因GS3序列AB743895[19]）和1個(gè)來(lái)自廣陸矮4號(hào)的cDNA序列（CT835094）。借助BioEdit軟件對(duì)上述序列進(jìn)行比對(duì)分析。

本研究利用Primer Premier 5.0 軟件，對(duì)基因GS3的第2外顯子A/C序列點(diǎn)突變和第5外顯子的13 bp Indel的序列變異分別設(shè)計(jì)了CAPs標(biāo)記GS3-1和GS3-2。引物的合成和序列的測(cè)定在生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4DNA提取

收集供試材料分蘗盛期新鮮幼嫩的葉片，采用CTAB法[20]提取水稻基因組DNA。

1.5PCR擴(kuò)增、酶切和電泳

[JP2]PCR反應(yīng)體系含50 ng/ μL基因組DNA 2.0 μL，2 μmol/L引物F和R各2.5 μL，10×緩沖液2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶（TaKaRa Code：R001C） 0.2 μL，滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)在Eppendorf Master cycler proS PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物在3.0%的瓊脂糖上分離電泳。

利用PCR引物擴(kuò)增基因GS3的目標(biāo)片段，進(jìn)一步用于酶切反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系為10 μL，分別包含PCR反應(yīng)產(chǎn)物 5 μL，10×buffer 1 μL，10 U/μL酶0.25 μL，ddH2O 3.75 μL。混勻后置于37 ℃恒溫水浴鍋酶切3～4 h，酶切產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖上電泳，EB染色，經(jīng)紫外凝膠成相系統(tǒng)成像。

1.6數(shù)據(jù)分析

本研究中所有數(shù)據(jù)的分析和處理利用Excel和SPSS軟件進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1基因序列分析和分子標(biāo)記設(shè)計(jì)

序列比對(duì)分析結(jié)果表明，基因GS3包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)有59處序列變異，其中57個(gè)變異發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)。除了Fan等已報(bào)道位于第2外顯子區(qū)的A/C變異與該基因功能密切相關(guān)外，筆者發(fā)現(xiàn)該基因的第5外顯子還有1個(gè)13 bp的Indel變異位點(diǎn)[4]。以基因GS3的編碼序列DQ355996為參照，本研究對(duì)基因GS3第2外顯子第 1 670 bp 處的A/C錯(cuò)義突變和第5外顯子第5 354 bp處的13 bp Indel變異分別開(kāi)發(fā)了CAPs標(biāo)記GS3-1和GS3-2（表1）。

對(duì)于基因GS3第2外顯子第1 670 bp處的A/C單堿基變異，筆者利用分子標(biāo)記GS3-1能夠在水稻品種中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為216 bp的PCR產(chǎn)物（如圖1-A的泳道1和2），經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶PstⅠ酶切后，能夠被切成160 bp條帶的水稻品種日本睛基因型為C（如圖1-A的泳道4）；PCR產(chǎn)物仍為216 bp的水稻品種明恢63基因型為A（如圖1-A的泳道3）。

對(duì)于基因GS3第5外顯子第5 354 bp處的13 bp Indel變異，利用標(biāo)記GS3-2能夠在水稻品種中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為 224 bp 或211 bp的2種類(lèi)型PCR產(chǎn)物（如圖1-B的泳道1和2）。由于這2種PCR產(chǎn)物片段差異較小，無(wú)法用普通瓊脂糖電泳加以區(qū)別；但是通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶NaeⅠ酶切處理后，224 bp 的PCR產(chǎn)物能夠被切成176 bp條帶的水稻品種日本睛基因型為13 bp的插入型（如圖1-B的泳道3）；PCR產(chǎn)物仍為211 bp的水稻品種蘇粳2號(hào)基因型為13 bp的缺失型（如圖1-B的泳道4）。

[FK（W12][TPYCD1.tif]

2.2基因GS3不同變異位點(diǎn)對(duì)水稻粒形的影響

為了探明基因GS3第2和第5外顯子的2個(gè)序列變異位點(diǎn)對(duì)水稻籽粒相關(guān)性狀的影響，筆者利用上述發(fā)展的分子標(biāo)記[CM（25]GS3-1和GS3-2分別對(duì)294份水稻微核心種質(zhì)的基因[CM）]

型進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的不同變異類(lèi)型進(jìn)行了t測(cè)驗(yàn)，結(jié)果列于表2。

從表2中可以看出，在基因GS3第2外顯子的A/C序列變異中，不論秈稻還是粳稻，相對(duì)于基因型C而言，基因型A對(duì)增加粒長(zhǎng)、減小粒厚、提高長(zhǎng)寬比都有著極顯著的影響。在秈稻群體中，筆者還發(fā)現(xiàn)基因型A有極顯著減小粒寬的效應(yīng)。對(duì)基因GS3第5外顯子13 bp的Indel序列進(jìn)行變異，在粳稻群體中，筆者發(fā)現(xiàn)具有13 bp插入的基因型對(duì)增加粒長(zhǎng)和提高長(zhǎng)寬比有著極顯著的影響，但在秈稻群體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)13 bp缺失的基因型。

從基因型分布頻率來(lái)看，在基因GS3第2外顯子的A/C變異中，基因型A的頻率在秈稻品種中為27.85%，在粳稻品種中為23.53%，表明這種長(zhǎng)粒形的基因型在秈稻和粳稻中都已經(jīng)被育種研究者加以應(yīng)用。但是對(duì)于基因GS3第5外顯子的13 bp Indel變異而言，在136個(gè)粳稻品種中，筆者發(fā)現(xiàn)1個(gè)品種具有13 bp缺失的基因型，其分布頻率為074%，而在158個(gè)秈稻品種中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該基因型，表明13 bp缺失的基因型為稀有基因型。

另外筆者發(fā)現(xiàn)基因GS3第2和第5外顯子的2個(gè)變異位點(diǎn)對(duì)水稻千粒質(zhì)量的影響都沒(méi)有達(dá)到顯著水平。

2.3近年來(lái)江蘇省育成品種中基因GS3的基因型分析

為了更好地指導(dǎo)育種研究者在水稻育種中對(duì)籽粒相關(guān)性狀的選擇，本研究對(duì)2007—2013年江蘇省審定的65個(gè)粳稻品種基因GS3的2個(gè)目標(biāo)變異位點(diǎn)進(jìn)行了基因型測(cè)定，結(jié)果列于表3。在基因GS3第5外顯子的13 bp Indel變異中，65個(gè)粳稻品種都是基因型為13 bp插入類(lèi)型。在基因GS3第2外顯子的A/C變異中，近年來(lái)江蘇省審定的粳稻品種內(nèi)，4個(gè)水稻品種的基因型為A；其余61個(gè)水稻品種的基因型為C，t測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明基因型A有極顯著增加粒長(zhǎng)和提高長(zhǎng)寬比的效應(yīng)，這表明江蘇省水稻育種研究者已經(jīng)將長(zhǎng)?；蛐蛻?yīng)用到當(dāng)前的粳稻育種實(shí)踐中。

[FK（W6][HT6H][JZ]表3近年來(lái)江蘇省審定水稻品種基因[WTHX][STHX]GS3[WTHZ]不同基因型的籽粒粒形性狀[HTSS]

[HJ*5][BG（！][BHDFG3，WK5。2，WK10。5W]基因型樣本數(shù)粒長(zhǎng)（mm）粒寬（mm）粒厚（mm）長(zhǎng)寬比千粒質(zhì)量（g）

[BHDG1*2，WK5，WK5，WK10。5DWW]A47.99±0.19*[KG-*3]*3.34±0.082.33±0.062.41±0.12*[KG-*3]*28.74±1.46

[BHDW]C617.36±0.043.38±0.022.38±0.012.18±0.0227.34±0.23[BG）F]

注：“*[KG-*3]*”表示差異極顯著（P<0.01）；表中籽粒相關(guān)性狀的數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

3討論與結(jié)論

籽粒是水稻光合產(chǎn)物貯存的主要目標(biāo)器官。調(diào)節(jié)籽粒的大小和形狀（即粒形），增大光合產(chǎn)物的庫(kù)容量，對(duì)于提高水稻產(chǎn)量（尤其是產(chǎn)量的構(gòu)成因子千粒質(zhì)量）有著重要的作用。Mao等研究發(fā)現(xiàn)，以基因型為gs3的水稻品種明恢63為受體親本，互補(bǔ)和過(guò)表達(dá)試驗(yàn)都能使粒長(zhǎng)變短，粒質(zhì)量下降；而以基因型為GS3的水稻品種川7為受體親本，RNA干擾試驗(yàn)使粒長(zhǎng)變長(zhǎng)，粒質(zhì)量增加[21]。但是在本研究中筆者利用水稻品種的自然群體（水稻微核心種質(zhì)）分析了基因GS3第2和第5外顯子的2個(gè)功能變異位點(diǎn)對(duì)水稻粒形的效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第2外顯子的A/C變異對(duì)水稻的粒長(zhǎng)、粒厚和長(zhǎng)寬比有著極顯著的影響，第5外顯子的13 bp Indel變異對(duì)粒長(zhǎng)和長(zhǎng)寬比有極顯著的影響，但是這2個(gè)變異位點(diǎn)對(duì)千粒質(zhì)量的影響沒(méi)有達(dá)到顯著水平，這可能是由于水稻的千粒質(zhì)量與粒形有著不同的遺傳控制系統(tǒng)，在遺傳背景復(fù)雜的水稻微核心種質(zhì)中，無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)到基因GS3對(duì)水稻千粒質(zhì)量的效應(yīng)。

隨著水稻分子生物學(xué)的進(jìn)展，雖然許多與水稻產(chǎn)量相關(guān)的重要功能粒形基因已被克隆[1，3-4，7-14]，但是這些基因還很少在水稻育種工作中得以利用，其原因主要有這些基因缺乏開(kāi)發(fā)成本低廉且簡(jiǎn)便實(shí)用的基因功能標(biāo)記、這些基因等位變異類(lèi)型未知、各等位變異類(lèi)型的效應(yīng)如何不清楚等等。利用關(guān)聯(lián)分析和轉(zhuǎn)基因的方法，F(xiàn)an等證實(shí)了基因GS3第2外顯子的A/C變異對(duì)水稻粒長(zhǎng)和粒質(zhì)量有著重要的影響，并開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的功能標(biāo)記SF28[15，21]。本研究開(kāi)發(fā)的CAPs標(biāo)記 GS3-1 也是基于該A/C變異的另一個(gè)功能標(biāo)記，酶切前后的條帶大小差異更大，易于鑒別。另外筆者還對(duì)基因GS3第5外顯子的稀有變異（13 bp Indel變異）開(kāi)發(fā)了功能標(biāo)記 GS3-2。利用標(biāo)記GS3-2和限制性?xún)?nèi)切酶NaeⅠ配合使用，將原來(lái)差異較小的224 bp和211 bp DNA片段，分別轉(zhuǎn)變成易于鑒別的176 bp和211 bp片段，可以直接使用普通瓊脂糖水平電泳加以分離和識(shí)別，為構(gòu)建該變異位點(diǎn)的水稻近等基因系和水稻育種中的分子標(biāo)記輔助選擇提供了準(zhǔn)確快捷的選擇方法。

致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李自超教授和張洪亮博士提供的水稻微核心種質(zhì)；感謝江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院王軍博士提供的2007—2013年江蘇省審定的粳稻品種，這些水稻品種為本研究中分子標(biāo)記的篩選和基因型的鑒定提供了便利。

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