長順綠殼蛋雞PRL基因的克隆及序列分析

韓雪++朱麗莉++粟朝芝++吳松成++陶宇航

摘要：采用特異性引物PCR技術(shù)獲得長順綠殼蛋雞PRL基因，將其克隆至pGM-T載體，并對該序列進(jìn)行測序分析。結(jié)果表明，長順綠殼蛋雞PRL基因全序列長度為690 bp，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼229個(gè)氨基酸。將長順綠殼蛋雞PRL基因與GenBank已公布的雞、鴨、鵝、魚等動(dòng)物的PRL基因序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系越遠(yuǎn)則同源性越低。

關(guān)鍵詞：長順綠殼蛋雞；催乳素基因；克隆；序列分析

中圖分類號： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0082-03

收稿日期：2015-10-13

基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金（編號：黔科合J字[2011]2174）；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（編號：黔農(nóng)科合[創(chuàng)新基金]2010011）；貴州省動(dòng)植物育種專項(xiàng)（編號：黔農(nóng)育專字[2011]027）；貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院專項(xiàng)（編號：黔農(nóng)科院院專項(xiàng)[2014]006號）。

作者簡介：韓雪（1982—），女，江蘇徐州人，碩士，助理研究員，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。E-mail：hanxue8855601@126.com。

通信作者：陶宇航，副研究員，主要從事家禽養(yǎng)殖研究。E-mail：1043694421@qq.com。

催乳素（prolactin，PRL）是動(dòng)物垂體前葉嗜酸細(xì)胞分泌的一種多肽類激素，對哺乳動(dòng)物的乳腺發(fā)育、泌乳、卵巢功能、維持妊娠、機(jī)體免疫等具有重要的生物學(xué)效應(yīng)[1]。在家禽中，PRL是促進(jìn)母禽就巢孵卵行為和調(diào)控生殖活動(dòng)的關(guān)鍵激素[2]，就巢期間PRL表達(dá)量升高可抑制垂體促性腺激素的分泌，致使卵巢萎縮，排卵泡停止，最終終止產(chǎn)蛋[3]。很多物種PRL基因的cDNA或基因全序列已被測定，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在不同物種中高度保守。對人、雞、鴨、鵝等動(dòng)物的研究表明，PRL基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。禽類PRL前體含229個(gè)氨基酸，其中包括30個(gè)氨基酸的信號肽序列和199個(gè)氨基酸的PRL成熟蛋白[4]。

長順綠殼蛋雞因其產(chǎn)地地處貴州省長順縣而得名，是中國稀有的珍禽品種。長順綠殼蛋雞是在貴州省特定自然生態(tài)環(huán)境下，經(jīng)長期自然選擇和人工選擇而形成的品種，具有耐粗飼、抗病力強(qiáng)、覓食能力強(qiáng)等特點(diǎn)。然而，長順綠殼蛋雞產(chǎn)蛋量低、就巢性強(qiáng)，嚴(yán)重限制了其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。以長順綠殼蛋雞為研究對象，克隆其催乳素基因并進(jìn)行測序分析，為長順綠殼蛋雞品種資源的保護(hù)利用及其產(chǎn)蛋性能的提高提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

血樣采自貴州省長順縣長寨鎮(zhèn)新民村長順綠殼蛋雞純種繁殖場，翅靜脈采血，共采取30羽長順綠殼蛋雞的血樣。所有母雞均在相同環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，采取的血樣經(jīng)EDTA抗凝劑抗凝，送至實(shí)驗(yàn)室于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1DNA提取

采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取血樣中的DNA。

1.2.2引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank已公布的禽、鼠等PRL基因序列，采用Primer 5.0軟件在序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3PCR擴(kuò)增與測序

50 μL PCR反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 5 μL、dNTP（10 μm） 1 μL、Template 1 μL、primer-F（10 μm） 1 μL、primer-R（10 μm） 1 μL、rTaqDNA聚合酶（2 U/μL） 0.5 μL，最后采用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，52～47 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共50個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京鼎國生物技術(shù)有限公司進(jìn)行克隆和測序。

1.3數(shù)據(jù)處理

將PRL基因5個(gè)外顯子片段進(jìn)行拼接，并采用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析。同時(shí)，將cDNA序列翻譯成氨基酸序列，確定正確的開放閱讀框（open readingf rame，ORF）；采用DNAman軟件（www.dnastar.com）對長順綠殼蛋雞PRL基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的其他動(dòng)物PRL基因序列進(jìn)行核苷酸、氨基酸序列同源性比較及生物信息學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1長順綠殼蛋雞PRL基因的PCR擴(kuò)增

以長順綠殼蛋雞血總DNA為模板，利用5對特異引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小吻合，引物擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，經(jīng)過藍(lán)白斑和抗性篩選，提取陽性大腸桿菌并進(jìn)行質(zhì)粒提取，然后對質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ酶切鑒定。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將陽性克隆送至北京鼎國生物技術(shù)有限公司測序，最后對其外顯子序列進(jìn)行拼接。

2.3長順綠殼蛋雞PRL基因的序列測定

序列測定結(jié)果（圖2）表明，長順綠殼蛋雞PRL基因 cDNA 片段長690 bp，共編碼229個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。

[FK（W13][TPHX1.tif]

[FK（W22][TPHX2.tif]

2.4PRL基因核苷酸和氨基酸序列同源性比較

將長順綠殼蛋雞PRL基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫上獲取的雞、鴨、鵝、魚等動(dòng)物的PRL基因序列（表2）進(jìn)行同源性分析。由表3可知，禽類PRL基因編碼區(qū)序列具有高度的保守性。其中，長順綠殼蛋雞與白來航、太和絲羽烏骨雞、隱性白洛克的核苷酸序列同源性最高，為99.9%；與尖嘴鱸的同源性最低，僅為47.3%。氨基酸序列同源性比較可得到與核苷酸序列相似的結(jié)果。

2.5系統(tǒng)發(fā)育分析

將PRL基因序列繪制進(jìn)化樹（圖3）。遺傳進(jìn)化分析表明，長順綠殼蛋雞與楊山雞、太和絲羽烏骨雞、白來航的親緣關(guān)系較近，與人、鯉魚、尖嘴鱸的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3結(jié)論與討論

大多數(shù)研究者認(rèn)為，PRL是促進(jìn)母禽就巢孵卵行為和調(diào)控[CM（25]生殖活動(dòng)的關(guān)鍵激素[5]，過高和過低的催乳素均對卵泡發(fā)

育不利[6]。Dawson等研究發(fā)現(xiàn)，火雞和鴿剛就巢時(shí)，PRL顯著升高以維持正常的孵化期[7]。Reddy等研究發(fā)現(xiàn)，催乳素水平與雞的產(chǎn)蛋量呈負(fù)相關(guān)[8-9]。PRL必須通過受體作用于靶細(xì)胞，[JP2]從而產(chǎn)生各種生理效應(yīng)。目前，關(guān)于催乳素受體基因（prolactin receptor，PRLR）與家禽就巢性之間的相關(guān)性研究表明，二者間相關(guān)不顯著[10]。雌激素受體基因（estrogen receptor，ER）、VIP、垂體特異轉(zhuǎn)錄因子（pituitary-specific transcription factor，POU1F1）基因等也會影響家禽就巢性，因此這些基因也是就巢性候選基因[11]。雖然學(xué)者已對這些基因開展了大量研究，但均側(cè)重于單基因研究，為揭示其就巢性機(jī)理，必須從PRL表達(dá)調(diào)控信號通道進(jìn)行更系統(tǒng)的研究。

本研究結(jié)果表明，長順綠殼蛋雞PRL基因編碼區(qū)序列全長為690 bp，共編碼229個(gè)氨基酸，基因推導(dǎo)的蛋白分子量為 29.122 ku，理論等電點(diǎn)pI為5.94，表明編碼肽鏈偏酸性。PRL氨基酸殘基二級結(jié)構(gòu)由41.58% α-螺旋、14.34% β-折疊、44.07%無規(guī)卷曲3種結(jié)構(gòu)組成。將克隆獲得的長

[FK（W25][TPHX3.tif]

順綠殼蛋雞PRL基因與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的雞、鴨、鵝、魚等動(dòng)物的PRL基因序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)長順綠殼蛋雞與禽類的同源性均高于90%，氨基酸序列同源性高于90%。與其他動(dòng)物PRL基因相比較，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系越遠(yuǎn)則同源性越低。同源分析結(jié)果表明，禽類PRL基因編碼區(qū)序列高度保守，可見物種分化以后，作為影響哺乳動(dòng)物產(chǎn)乳性狀的PRL發(fā)生了較大變異，這為PRL特性和作用機(jī)理的進(jìn)一步研究以及哺乳動(dòng)物產(chǎn)乳和繁殖性能的改良提供依據(jù)。

在禽類進(jìn)化的過程中，家雞、火雞、鵪鶉首先發(fā)生分支，而鵝與鴨的分支則較晚，這與序列分析結(jié)果一致。由于起源與進(jìn)化不同，長順綠殼蛋雞與原雞、白來航、楊山雞、太和絲羽烏骨雞、隱性白洛克聚為一類，再與鵪鶉、火雞、印度孔雀聚為一類，分支最外側(cè)的為人、鯉魚、尖嘴鱸。長順綠殼蛋雞、原雞、白來航、楊山雞等禽類與魚類的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，這與古生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、生化遺傳學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)以及其他DNA分子水平上的分類結(jié)果基本一致，這也佐證了PRL基因全序列適合用于研究動(dòng)物種間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

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