花生金屬蛋白酶家族基因FtsH的鑒定、分類和鹽脅迫表達(dá)分析

鄭春花++孔祥遠(yuǎn)++隋炯明++束晨++趙春梅

摘要：FtsH是一種ATP和Zn2+依賴型金屬蛋白酶，在植物抗逆脅迫中發(fā)揮了重要作用。為分析花生中FtsH家族成員情況，構(gòu)建花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)文庫(kù)，篩選出19個(gè)FtsH家族基因，位于花生A組野生種的8條染色體上，與擬南芥、水稻的FtsH基因進(jìn)行同源序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，多數(shù)FtsH基因沒有聚到已報(bào)道的亞類。利用花生耐鹽突變體（S2）和對(duì)照（S4）構(gòu)建鹽脅迫處理前后各時(shí)間段的表達(dá)譜文庫(kù)，進(jìn)行FtsH基因鹽脅迫表達(dá)分析，結(jié)果表明，9個(gè)FtsH基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，絕大多數(shù)FtsH基因在耐鹽突變體和對(duì)照中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。該研究為花生金屬蛋白酶基因的功能研究與耐鹽分子育種提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；FtsH基因；基因表達(dá)譜；耐鹽突變體；鹽脅迫

中圖分類號(hào)： S565.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0074-03

收稿日期：2016-08-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31571705、31301356、31471542）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2014GNC110002）。

作者簡(jiǎn)介：鄭春花（1979—），女，山西忻州人，碩士，圖書館員，主要從事生物信息學(xué)分析。E-mail：zchsjm@163.com。

通信作者：趙春梅，博士，副教授，主要從事作物分子育種研究。E-mail：meiwei2002@163.com。

FtsH屬于AAA蛋白酶家族，是一種ATP和Zn2+依賴型蛋白，在生物體內(nèi)廣泛分布[1]。FtsH負(fù)責(zé)細(xì)菌原生質(zhì)膜、線粒體膜、葉綠體膜上未裝配蛋白的降解，通過降解非復(fù)合體形式的自由亞基，可以避免有害物質(zhì)的大量積累[2-3]。在高等植物中，F(xiàn)tsH蛋白參與D1蛋白光氧化損傷產(chǎn)物的降解，現(xiàn)己證實(shí)FtsH具有降解快速周轉(zhuǎn)的蛋白的功能，F(xiàn)tsH是植物抵抗光抑制過程中PSⅡ復(fù)合物修復(fù)的關(guān)鍵成分之一[4]。FtsH蛋白除了作為蛋白酶發(fā)揮功能外，還作為分子伴侶參與蛋白的裝配和折疊[5-7]。

已有研究表明，擬南芥的12個(gè)FtsH基因和水稻的FtsH基因可以分為8個(gè)亞族，每個(gè)亞族的成員蛋白序列高度保守，種內(nèi)同源物相似性大于80%，且種間同源物的相似性也大于70%[8]。FtsH不僅參與生物體內(nèi)正常的代謝調(diào)節(jié)過程，而且與多種逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)，有些成員在植物抵抗熱激和高滲、鹽害、冷脅迫和病原菌等脅迫中發(fā)揮著重要作用[9-11]。

筆者前期以花生胚小葉為外植體，通過平陽(yáng)霉素離體誘變和羥脯氨酸定向篩選，獲得了一批羥脯氨酸耐性苗及其后代[12]，其中1個(gè)突變體（S2）在0.7%鹽溶液中發(fā)芽率超過50%，且具有較高的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性，而對(duì)照花育20（S4）在相同濃度的鹽溶液中發(fā)芽率只有6.7%。

為從整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平了解花生FtsH家族基因的情況，筆者用上述材料構(gòu)建花生葉片轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，利用生物信息學(xué)研究手段，鑒定花生FtsH家族基因，進(jìn)行FtsH基因的染色體定位和分類。然后構(gòu)建耐鹽突變體S2和對(duì)照S4在鹽脅迫處理前后的表達(dá)譜，分析FtsH家族各成員在鹽脅迫處理前后表達(dá)量的變化，為全面了解FtsH家族成員在花生中的功能以及耐鹽分子育種奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

本研究所用材料為平陽(yáng)霉素離體誘變和羥脯氨酸定向篩選后穩(wěn)定遺傳的耐鹽突變體（S2）和對(duì)照花育20（S4）。

1.2轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

用250 mmol/L NaCl處理耐鹽突變體S2和對(duì)照S4，在0、6、12、24、48 h取葉片，每個(gè)樣品包含2個(gè)生物學(xué)重復(fù)?；旌虾髽?gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，送交北京諾和致源公司進(jìn)行雙向測(cè)序，組裝處理后獲得非冗余Unigene序列，在NCBIA數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)（注冊(cè)號(hào)SRR3114511）。用NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋。

1.3鹽脅迫處理前后表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

由北京諾和致源公司對(duì)鹽脅迫處理前后20個(gè)樣品進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)譜測(cè)序，構(gòu)建花生葉片鹽脅迫處理前后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI注冊(cè)號(hào)SRR3210665、SRR3210666）。

1.4基因家族成員鑒定、基因結(jié)構(gòu)分析和染色體定位

根據(jù)NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能預(yù)測(cè)，搜索FtsH基因。利用生物信息學(xué)軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)域、分子量、理論等電點(diǎn)和可能的亞細(xì)胞定位。從花生全基因組數(shù)據(jù)（http：//www.peanutbase.org）下載A組野生種基因組序列，進(jìn)行基因序列比對(duì)，取相似度最高的序列作為目標(biāo)基因，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果和比對(duì)結(jié)果進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后的結(jié)果，標(biāo)示基因在染色體上的位置，得到各個(gè)基因在染色體上的分布情況。

1.5系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

通過Clustal X軟件對(duì)擬南芥、水稻FtsH蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析，采用鄰接法生成FtsH基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6鹽脅迫響應(yīng)分析

將S2或S4樣品中，某一基因在脅迫處理前后0、6、12、24、48 h的任何2個(gè)時(shí)間段間的表達(dá)量進(jìn)行比較，如果調(diào)整后的P<0.05，則認(rèn)為該基因?qū)}脅迫有響應(yīng)。

2結(jié)果與分析

2.1花生FtsH家族基因的鑒定及它們?cè)谌旧w上的分布

根據(jù)上述7大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能預(yù)測(cè)結(jié)果，筆者從花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出25個(gè)候選FtsH基因。將其與公布的花生A組野生種基因組序列進(jìn)行比對(duì)，其中6個(gè)基因（編號(hào)分別為c40440_g2、c35114_g1、c38335_g1、c44670_g2、c41532_g1和c19813_g1）因與其他基因比對(duì)到同一位置被剔除，最終得到19個(gè)花生FtsH基因。根據(jù)與花生A組野生種基因組的比對(duì)結(jié)果，確定了18個(gè)FtsH基因在A染色體組的分布情況，這些基因分布在8條染色體上，其中第2、8號(hào)染色體上不含有FtsH基因，第3、4、9、10號(hào)染色體分布的成員數(shù)量最多，有3～5個(gè)，其他各染色體含有1～2個(gè)FTSH基因，[JP2]c53069_g1在A染色體組沒有比對(duì)到相應(yīng)序列（表1）。花生FtsH蛋白最長(zhǎng)有 1 283 個(gè)氨基酸殘基，最短的有209個(gè)氨基酸殘基，其等電點(diǎn)范圍為4.91～10.09，除c53069_g1無法進(jìn)行亞細(xì)胞定位外，其余18個(gè)蛋白中10個(gè)定位于葉綠體，8個(gè)定位于線粒體。基因結(jié)構(gòu)分析顯示，外顯子數(shù)為1～19個(gè)（表1）。

2.2花生FtsH基因的聚類分類

模式植物擬南芥、水稻分別有12、9個(gè)FtsH基因，可分為8個(gè)亞家族[8]。根據(jù)FtsH蛋白家族成員長(zhǎng)度差異、含不同特征的結(jié)構(gòu)域等特點(diǎn)，將花生19個(gè)FtsH蛋白與擬南芥和水稻基因組中全部FtsH蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。聚類結(jié)果顯示，4、5、7亞家族只有擬南芥和水稻的FtsH基因，暫時(shí)沒有找到花生的FtsH基因；1、2、3、6、8亞家族分別包含1、2、1、1、1個(gè)FtsH基因，其他13個(gè)FtsH基因沒有聚到這8個(gè)亞家族，它們可能屬于一些新的亞族（圖1）。

[FK（W27][TPZCH1.tif]

2.3花生FtsH家族基因的鹽脅迫響應(yīng)分析

筆者利用鹽脅迫處理前后S2、S4的20個(gè)數(shù)字表達(dá)文庫(kù)譜，在脅迫處理前后對(duì)19個(gè)FtsH基因的任意2個(gè)時(shí)間段的表達(dá)量進(jìn)行比較，根據(jù)調(diào)整后的P值，確定其是否受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果見表2和圖2?？梢钥闯?，在S2中，與脅迫處理前相比，脅迫處理6、12 h后，差異表達(dá)的基因各有3個(gè)；脅迫處理48 h與12 h相比，也有3個(gè)差異表達(dá)的基因。而在S4中，脅迫處理48 h與12 h相比，差異表達(dá)的基因數(shù)最多，有5個(gè)上調(diào)，1個(gè)下調(diào)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)基因（c25618_g1、c40440_g1、c53069_g1、c37927_g1、c40421_g1）在S2和S4中均受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；2個(gè)基因（c32457_g1、c36613_g1）只在S2中受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；2個(gè)基因（c44096_g1、c31995_g1）只在S4中受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)（表2、圖2）。S2中，c53069_g1和c44096_g1表達(dá)模式相同，均為上調(diào)—下調(diào)—上調(diào)—上調(diào)，c32457_g1和c36613_g1表達(dá)模式相同，均為上調(diào)—上調(diào)—下調(diào)—下調(diào)；S4中，c25618_g1和c40440_g1表達(dá)模式相同，均為下調(diào)—下調(diào)—上調(diào)—上調(diào)，c44096_g1和c40421_g1表達(dá)模式相同，均為上調(diào)—下調(diào)—下調(diào)—下調(diào)。只有c53069_g1和c37927_g1這2個(gè)基因在S2和S4中表達(dá)模式完全一致，其他基因表達(dá)模式都有差別，特別是c25618_g1、c32457_g1，c44096_g1和c36613_g1在S2和S4中表達(dá)模式差別非常大。

各基因百萬(wàn)外顯子的堿基片段（FPKM）值差異很大，S2中FPKM值的變化范圍為0.68～537.85，而S4中FPKM值的變化范圍為2.64～632.78。與脅迫處理前相比，脅迫處理后，c53069_g1在S2中的表達(dá)量明顯上調(diào)，log2（變化表達(dá)量）最高達(dá)到3.29，而在S4中的多個(gè)時(shí)間段的比值都超過2.70，最高達(dá)到4.99；脅迫處理后c25618_g1在S4中的log2（變化表達(dá)量）最高達(dá)到 4.15；而c37927_g1在脅迫處理后的某些時(shí)間段出現(xiàn)了顯著下調(diào)，在S2、S4中的log2（變化表達(dá)量）最低分別為-3.08、-2.03。由此可見，不同的FtsH基因在脅迫處理后的表達(dá)模式差異很大。

3結(jié)論與討論

生物體內(nèi)的FtsH種類繁多，擬南芥中有12種FtsH蛋白酶，其中AtFtsH3、AtFtsH4和AtFtsH10定位于線粒體，其余9種定位于葉綠體[8]，本研究篩選到的FtsH蛋白酶均定位于葉綠體和線粒體。FtsH參與多種調(diào)控途徑，有些FtsH基因與某些生物和非生物脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。煙草葉綠體FtsH蛋白同系物DS9與植株抗病性有關(guān)，其表達(dá)量降低后葉片對(duì)病毒侵染產(chǎn)生超敏反應(yīng)[13]。擬南芥AtFtsH1參與D1蛋白光氧化損傷產(chǎn)物的降解[4]，AtFtsH2和AtFtsH5參與光保護(hù)和類囊體發(fā)育過程，2個(gè)基因突變都會(huì)引起葉片花斑和對(duì)光抑制敏感性提高[14-15]。定位于葉綠體中的一個(gè)苜蓿FtsH基因只受低溫和和光照調(diào)控，而不受脫落酸、NaCl或脫水脅迫誘導(dǎo)[9]。來源于番茄葉片組織的LeFtsH6基因也定位于葉綠體，該基因只受熱激脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，而不受冷害、鹽、干旱或光脅迫誘導(dǎo)，其啟動(dòng)子中的順式調(diào)控元件熱激響應(yīng)元件（HSE）可以與熱激因子互作[10]。在冰葉日中花中篩選到的FtsH基因可受鹽脅迫表達(dá)[11]。由此可見，高等植物中FtsH家族成員功能發(fā)生了分化。

為了分析花生中FtsH基因的情況，筆者利用構(gòu)建的花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過生物信息學(xué)手段，鑒定出19個(gè)FtsH基因，位于花生A組野生種的8條染色體上。聚類分析表明，只有1、2、3、6、8這5個(gè)亞家族含有花生FtsH基因，花生的絕大多數(shù)FtsH基因可能屬于一些新的亞家族。擬南芥中多個(gè)FtsH基因成對(duì)存在，有些成對(duì)基因之間表達(dá)模式相似且功能可以互補(bǔ)，如AtFtsH3和AtFtsH10，AtFtsH2和AtFtsH8，AtFtsH1和AtFtsH5等[8]，而在筆者的試驗(yàn)中這種現(xiàn)象并不多見，可能是由于筆者獲得的FtsH基因只是來源于葉片組織，而未包括花生全部的FtsH基因。利用花生耐鹽突變體（S2）和對(duì)照（S4）構(gòu)建鹽脅迫處理前后各時(shí)間段的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因鹽脅迫表達(dá)分析，結(jié)果表明，共9個(gè)基因在S2和（或）S4中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，絕大多數(shù)FtsH基因在耐鹽突變體和對(duì)照中的表達(dá)模式有較大差異，這些FtsH基因可能在花生抵御鹽脅迫中發(fā)揮著重要作用。該結(jié)果為進(jìn)一步研究其功能以及利用它們來改良花生的耐鹽性提供了重要依據(jù)。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS]

[1][ZK（#]Schumann W. FtsH-a single-chain charonin[J]. FEMS Microbiol Rev，1999，23（1）：1-11.

[2]Ostersetzer O，Adam Z. Light-stimulated degradation of an unassembled Rieske FeS protein by a thylakoid-bound protease：the possible role of the FtsH protease[J]. Plant Cell，1997，9（6）：957-965.

[3]Akiyama Y，Kihara A，Ito K. Subunit ɑ of proton ATPase F0 sector is a substrate of the FtsH protease in Escherichia coli[J]. FEBS Lett，1996，399：26-28.

[4]Lindahl M，Spetea C，Hundal T，et al. The thylakoid FtsH protease plays a role in the light-induced turnover of the photosystem Ⅱ D1

[HT8.]

[KG1*2/3][ZK（#]protein[J]. Plant Cell，2000（12）：419-431.

[5]Akiyama Y，Shirai Y，Ito K. Involvement of FtsH in protein assembly into and through the membrane. Ⅱ. Dominant mutations affecting FtsH functions[J]. J Biol Chem，1994，269（7）：5225-5229.

[6]Jayasekera M M，F(xiàn)oltin S K，Olson E R，et al. Escherichia coli requires the protease activity of FtsH for growth[J]. Arch Biochem Biophys，2000，380：103-107.

[7]Makino S，Makinoa T，Abe K，et al. Second transmembrane segment of FtsH plays a role in its proteolytic activity and homo-oligomerization[J]. FEBS Letters，1999，460（3）：554-558.

[8]張杰道，孫愛清. 擬南芥和水稻金屬蛋白酶FtsH基因家族的基因組比較分析[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2009，25（9）：1402-1408.

[9]Ivashuta S，Imai R，Uchiyama K，et al. Changes in chloroplast FtsH-like gene during cold acclimation in alfalfa （Medicago sativa）[J]. J Plant Physiol，2002，159：85-90.

[10][ZK（#]Sun A Q，Yi S Y，Yang J Y，et al. Identification and characterization of a heat-inducible FtsH gene from tomato （Lycopersicon esculentum Mill.）[J]. Plant Sci，2006，170：551-562.

[11]Kore-eda S，Cushman M A，Akselrod I，et al. Transcript profiling of salinity stress responses by large-scale expressed sequence tag analysis in Mesembryanthemum crystallinum[J]. Gene，2004，341：83-92.

[12]Sui J M，Wang Y，Wang P，et al. Generation of peanut drought tolerant plants by pingyangmycin-mediated in vitro mutagenesis and hydroxyproline-resistance screening[J]. PLoS One，2015，10（3）：e0119240.

[13]Seo S，Okamoto M，Iwai T，et al. Reduced levels of chloroplast FtsH protein in tobacco mosaic virus-infected tobacco leaves accelerate the hypersensitive reaction[J]. Plant Cell，2000，12：917-932.

[14]Chen M，Choi Y，Voytas D F，et al. Mutations in the Arabidopsis VAR2 locus cause leaf variegation due to the loss of a chloroplast FtsH protease[J]. Plant J，2000，22：303-313.

[15]Sakamoto W，Tamura T，Hanba-Tomita Y，et al. The VAR1 locus of Arabidopsis encodes a chloroplastic FtsH and is responsible for leaf variegation in the mutant alleles[J]. Genes Cells，2002（7）：769-780.