生鮮乳中黃曲霉毒素M1檢測(cè)方法的探索

劉寶華，高楊

（黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司，哈爾濱 150001）

生鮮乳中黃曲霉毒素M1檢測(cè)方法的探索

劉寶華，高楊

（黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司，哈爾濱 150001）

在GB 5413.37-2010第二法的基礎(chǔ)上，建立一種免疫親和柱凈化－高效液相色譜紫外法檢測(cè)生鮮乳中AFM1的含量，更加符合多數(shù)乳品企業(yè)只具備紫外檢測(cè)器的應(yīng)用實(shí)際。其檢出時(shí)間為6.825min，比GB 5413.37-2010第二法縮短了1.175～2.175min，平均回收率為90.6%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.97%～5.12%，檢出限為0.1μg/kg，均滿足分析要求。結(jié)果表明本方法具有較高的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度，是一種值得推廣的檢測(cè)方法。

生鮮乳；黃曲霉毒素M1（AFM1）；檢測(cè)方法

黃曲霉毒素M1（AFM1）是黃曲霉毒素B1（AFB1）的羥基化代謝產(chǎn)物，能導(dǎo)致肝臟發(fā)生病變，甚至癌變，于1933年被世界衛(wèi)生組織（WHO）國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為一級(jí)致癌化合物[1]，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)。生鮮牛乳中AFM1的存在，主要是由于奶牛食用了受黃曲霉毒素污染的飼料，經(jīng)乳畜體內(nèi)羥化酶轉(zhuǎn)化而生成。世界許多國家（組織）均設(shè)定了生鮮乳中AFM1的允許殘留標(biāo)準(zhǔn)，歐盟為0.05μg/kg，中國和美國為0.50μ g/kg[2,3]。而我國針對(duì)生鮮乳中AFM1的控制與檢測(cè)方法還在不斷探討中，因此開展生鮮乳中AFM1的監(jiān)測(cè)工作具有重要意義。

目前，生鮮乳中AFM1的檢測(cè)方法主要有薄層色譜分析法（TLC）[4～6]、高效液相色譜法（HPLC）[7～9]、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[9]、免疫親和柱-熒光分光光度法[7,10]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）[11,12]、雙流向酶聯(lián)免疫吸附法（SNAP）[13]、單克隆抗體試劑盒法[14]。本研究在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《乳和乳制品中AFM1的測(cè)定》（GB 5413.37-2010）第二法的基礎(chǔ)上[15]，以紫外檢測(cè)器代替熒光檢測(cè)器與高效液相色譜串聯(lián)，建立了免疫親和柱凈化－高效液相色譜紫外檢測(cè)法來檢測(cè)原料乳中的AFM1，希望能為進(jìn)一步控制生鮮乳的質(zhì)量安全提供一種更理想的檢測(cè)方法。

1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

生鮮牛乳（青山牧場(chǎng)）、甲醇（分析純）（科密歐化學(xué)試劑有限公司）、甲醇（色譜純）（賽默飛世爾科技有限公司）、AFM1標(biāo)準(zhǔn)品（迪馬科技公司）、超純水 （實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

Waters1525高效液相色譜儀（美國Waters公司）、Waters2487紫外檢測(cè)器（美國Waters公司）、Cloversil-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）（迪馬科技公司）、免疫親和柱：AFLATEST-P柱（美國VICAM公司）、超速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)有限公司）、DCY-125型氮吹儀（青島?？苾x器有限公司）、Simplicity185 型純水機(jī)（美國密理博公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品的處理

2.1.1 樣本前處理

將生鮮乳樣品在4 000r/min下離心15min，收集30mL下層試樣。

2.1.2 樣本的凈化

用移液管移取25mL試樣到50mL注射器中，調(diào)節(jié)真空系統(tǒng)，控制試樣以2～3mL/min的穩(wěn)定流速過柱。取下50mL的注射器，裝上10mL注射器。注射器內(nèi)加入10mL水，以穩(wěn)定的流速洗柱，然后，抽干親和柱。

2.1.3 洗脫

脫開真空系統(tǒng)，裝上另一個(gè)10mL注射器，加入5mL甲醇。緩緩?fù)苿?dòng)注射器栓塞，通過柱塞控制流速，洗脫黃曲霉毒素M1，洗脫液收集在棕色錐形管中，然后用和緩的氮?dú)庠?0℃下將洗脫液蒸發(fā)至近干，再用水定容至最終體積為500μL。用0.22μm的微孔濾膜過濾后，上機(jī)測(cè)定。

2.2 AFM1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)高效液相色譜儀進(jìn)樣環(huán)的容積，分別注入含有0.025ng、0.05ng、0.1ng、0.2ng和0.4ng的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按濃度由低到高的順序進(jìn)樣。以黃曲霉毒素M1的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 樣品中的AFM1分析

根據(jù)樣品洗脫液色譜圖中黃曲霉毒素M1的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析；根據(jù)黃曲霉毒素M1的峰面積值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品洗脫液中所含有的黃曲霉毒素M1質(zhì)量數(shù)（ng）。

如果樣品洗脫液的黃曲霉毒素M1的峰面積值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，用水定容稀釋樣品洗脫液后，重新進(jìn)樣分析。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在生鮮牛乳樣品中分別添加質(zhì)量濃度為0.1μ g/kg、0.5μ g/kg、1.0μg/kg三個(gè)梯度的黃曲霉毒素M1，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，每個(gè)梯度做6組平行試驗(yàn)，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，確定方法的準(zhǔn)確度和精密度，并通過添加試驗(yàn)確定方法的檢出限進(jìn)而確定其靈敏度。

2.5 色譜條件

參考GB 5413.37-2010和有關(guān)文獻(xiàn)[8,15]選取色譜條件。色譜柱：Cloversil-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇水溶液；流速：1mL/min；檢測(cè)波長：365nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：50μL。

3 結(jié)果與分析

3.1 流動(dòng)相的選擇

通過試驗(yàn)確定流動(dòng)相最佳配比為甲醇∶水=50∶50，在上述色譜條件下，對(duì)5個(gè)濃度梯度的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)液（0.025ng、0.05ng、0.1ng、0.2ng和0.4ng）進(jìn)行分離檢測(cè)，得標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（如圖1所示）。從圖中可以看出黃曲霉毒素M1的保留時(shí)間平均為6.825 min，且色譜峰峰形尖銳，對(duì)稱性好，無雜質(zhì)干擾。國標(biāo)方法中以乙腈作為流動(dòng)相，而本研究采用甲醇作為流動(dòng)相，在同等試驗(yàn)條件下，溶劑中甲醇的濃度對(duì)色譜峰的峰形影響較小，并且避免了毒性較大溶劑乙腈的使用。

圖1 不同質(zhì)量濃度的AFM1標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

3.2 方法的線性范圍與回歸方程

5個(gè)濃度的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量與對(duì)應(yīng)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 AFM1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，AFM1標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=42.342X+0.8729，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9997，說明AFM1質(zhì)量濃度在0.025～0.4ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 方法的準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度

通過加標(biāo)回收率試驗(yàn)計(jì)算生鮮乳中添加的AFM1的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，依此檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度和精密度，并根據(jù)加標(biāo)回收率試驗(yàn)確定方法的檢出限，進(jìn)而確定其靈敏度，結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)生鮮乳樣品中AFM1回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表1可以看出，本方法在0.1～1.0μg/kg范圍內(nèi)，平均回收率為90.6%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.97%～5.12%，滿足了定量檢測(cè)和GB 5413.37-2010中對(duì)回收率大于80%的要求[15,16]及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%的要求[17]，與陳瑞春[8]等建立的免疫親和柱高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定生鮮乳中AFM1的含量回收率在58.6%～86.7%之間、相對(duì)偏差3.37%～16.9%之間和牛軍小[9]等建立的免疫親和柱-反相高效液相色譜法測(cè)乳和乳制品中的AFM1含量平均回收率在80.1%～88.9%之間、相對(duì)偏差為3.3%～4.6%相比，本文回收率平均提高10%、相對(duì)偏差平均減小1%，說明本方法具有較高的準(zhǔn)確度及精密度。

加標(biāo)生鮮乳樣品中黃曲霉毒素M1的色譜圖見圖3，從圖中可以看出，免疫親和柱凈化效果較好，基本沒有干擾峰和雜質(zhì)峰。根據(jù)加標(biāo)試驗(yàn)確定的本方法檢出限為0.1μg/kg，滿足我國國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)乳及乳制品黃曲霉毒素M1限量為0.5μg/kg的檢測(cè)要求[18]，并與張鵬[19]等建立的牛奶及奶粉中黃曲霉毒素M1快速測(cè)定法的黃曲霉毒素M1檢測(cè)低限為0.1μg/kg相同，說明本方法具有較高的靈敏度。

圖3 加標(biāo)生鮮乳樣品中AFM1的色譜圖

3.4 檢測(cè)速度的對(duì)比

此檢測(cè)方法與國標(biāo)GB 5413.37-2010中第二法（免疫親和柱凈化高效液相色譜熒光檢測(cè)法）[15]相比，檢測(cè)時(shí)間由8～9min縮短至6.825min，縮短了1.175～2.175min；與陳瑞春[8]等建立的免疫親和柱高效液相色譜熒光檢測(cè)法相比，檢出時(shí)間縮短了1.192 min，即大約縮短時(shí)間為14.9%，說明本法檢測(cè)速度較快。

4 結(jié)論與討論

與薄層色譜分析法（TLC）的預(yù)處理和測(cè)定步驟均較復(fù)雜、耗時(shí)、靈敏度差和高效液相色譜法（HPLC）樣品處理繁瑣、操作復(fù)雜，不能滿足某些企業(yè)只能用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)的需求，以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）重復(fù)性差、試劑壽命短及準(zhǔn)確性差相比，本研究建立的用免疫親和柱凈化-高效液相色譜紫外法檢測(cè)AFM1含量的方法，在檢測(cè)儀器上雖然紫外檢測(cè)器較熒光檢測(cè)器靈敏度低，但是更符合大多數(shù)乳品企業(yè)未配備熒光檢測(cè)器的實(shí)際，而且免疫親和柱凈化有著較好的權(quán)威性和通用性，為國外多個(gè)組織所認(rèn)可，被列為標(biāo)準(zhǔn)方法，可應(yīng)用于不同的基質(zhì)。且本法檢出時(shí)間為6.825min，比國標(biāo)GB 5413.37-2010中第二法縮短了1.175～2.175min，平均回收率為90.6%～98.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.97%～5.12%，檢出限為0.1μg/kg，均滿足分析要求，說明本方法具有較高的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度，并且此方法簡(jiǎn)單易行、操作性較強(qiáng)，是一種值得推廣的檢測(cè)方法。

國際和國內(nèi)對(duì)牛奶中黃曲霉毒素M1的限制正在逐步加強(qiáng)，限量標(biāo)準(zhǔn)也在不斷降低，所以更需要找到一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速容易普及應(yīng)用的方法來檢測(cè)黃曲霉毒素M1，本方法適應(yīng)了這種需求。

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Research on a Detection Method of Afatoxin M1in Fresh Milk

LIU Bao-hua, GAO Yang
(Heilongjiang Province Longdan Dairy Industry Science and Technology Co., LTD, Harbin 150001)

On the basis of second method of GB 5413.37-2010, a detection method of AFM1in fresh milkimmunoaffnity column purifcation and HPLC-UV detection method was established, which was more in line with the fact that majority of dairy enterprises only had the application of UV detector. The detection time was 6.825min which was 1.175～2.175min shorter than the second method of GB 5413.37-2010, and the average recovery rate was 90.6%～98.3%, and the relative standard deviation was 2.97%～5.12%, and the detection limit was 0.1g/kg, and all of these met the analytical requirements. The results show that the method is of high accuracy, precision and sensitivity, and so it is worth promoting.

Fresh milk; Afatoxin M1(AFM1); Detection method

TS252.1

A

1004-4264（2017）03-0040-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.03.012

2016-08-01