生鮮乳中大腸桿菌的分離及其ERIC-PCR指紋分析

鐘召兵，侯磊，王寧，楊夫會

(1.泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，泰安 271000；2.泰安市畜牧獸醫(yī)局，泰安 271000)

生鮮乳中大腸桿菌的分離及其ERIC-PCR指紋分析

鐘召兵1，侯磊2，王寧1，楊夫會1

(1.泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，泰安 271000；2.泰安市畜牧獸醫(yī)局，泰安 271000)

通過了解生鮮乳收購站的生鮮乳大腸桿菌污染情況及不同菌株間的遺傳相似性，為日常生產(chǎn)中實時控制生鮮乳大腸桿菌提供了有效技術手段。采用國家規(guī)定的標準方法檢驗從生鮮乳分離的大腸桿菌，分析分離細菌的ERIC-PCR DNA指紋圖譜。共采集115份樣品，從23份中分離到大腸桿菌25株。ERIC-PCR DNA指紋圖譜分析，25株分離菌遺傳相似性在56%～100%之間。結果顯示，生鮮乳中存在大腸桿菌污染，同一個生鮮乳收購站大腸桿菌的基因型可有不同，不同生鮮乳收購站之間也存在相同基因型大腸桿菌污染。

生鮮乳；大腸桿菌；分離鑒定；ERIC-PCR

乳品營養(yǎng)豐富，是優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)食品，同時也是微生物的良好培養(yǎng)基，在生產(chǎn)加工運輸過程中極易被微生物污染[1]，污染后會導致乳品變質(zhì)，嚴重者會引起食物中毒等后果。大腸桿菌是乳品國家標準中規(guī)定的菌群檢測項目的主要目標物，且是食品級飲用水受糞源污染的重要微生物學指標[2]。有些國家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標和HACCP實施效果的評估指標[3]，因此從生鮮乳中分離大腸桿菌不僅可以為評估微生物污染提供有價值的信息，其基因分型還可以用于乳及乳制品生產(chǎn)過程中污染源的追蹤[4]。

近年來隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，特別是聚合酶鏈式反應（PCR）技術的發(fā)展，出現(xiàn)了一系列的分子生物學分型方法[5]，其中細菌基因間重復共有序列PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR）分型技術是以腸桿菌科基因重復序列為引物進行PCR，能擴增出多態(tài)性的DNA圖譜[6]。DNA條帶特征能反映出細菌整個基因組結構的差異，能區(qū)別含有ERIC這些重復序列的不同菌種或株，因此具有很強的鑒別菌種乃至菌株的能力[7]。ERIC-PCR作為一種行之有效的分子分型技術，已經(jīng)被用作一種分子流行性病學調(diào)查方法[8]。

本研究從28個生鮮乳收購站的生鮮乳中分離大腸桿菌，通過菌株的ERIC-PCR指紋圖譜分析分離株的同源性，為在生鮮乳及乳制品生產(chǎn)中控制大腸桿菌污染及追蹤污染源提供一種有效的技術方法。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

嚴格按樣品采集規(guī)范要求，從生鮮乳收購站奶廳制冷罐中采集生鮮乳樣共計115份，冷藏保存待檢。

1.2 主要試劑及儀器緩沖蛋白胨水、S C肉湯、伊紅美藍瓊脂、麥康凱3號瓊脂（Oxoid）。Taq DNA聚合酶、P C R反應試劑（大連寶生物公司產(chǎn)品），EppendorfPCR擴增儀（AG22331），上海天能科技有限公司凝膠成像系統(tǒng)（tanon-2500）。引物1(3′-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-5′)和引物2(5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)由大連寶生物公司合成。

1.3 大腸桿菌的培養(yǎng)

無菌條件下各取100mL樣品，分別加入裝有225mL緩沖蛋白胨水增菌液的廣口瓶內(nèi)，混合均勻，于36±1℃恒溫箱培養(yǎng)18～24h；移取0.1mL轉(zhuǎn)種于盛有10mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC肉湯）的試管內(nèi)，搖勻，于36±1℃培養(yǎng)6～8h。

1.4 大腸桿菌的分離鑒定

取待檢菌料，分別接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基平板上37℃培養(yǎng)18～24h；挑取黑色金屬閃光的菌落，再次接種麥康凱3號瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。所有的陽性菌落經(jīng)過“KOH反應”試驗鑒定是否為革蘭氏陽性菌。革蘭氏陰性菌用API 20 E鑒定。

1.5 模板的制備

將大腸桿菌接種到5mL Luria-Bertani培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)18h。然后取出培養(yǎng)液置1.5mL Eppendorf 管中，10 000r/min離心2min，棄上清，用100μL TE緩沖液懸浮沉淀，在100℃條件下煮沸10min，再迅速冰浴5min，最后12 000r/min離心2min，取上清液作為模板，在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 ERIC-PCR反應

ERIC-PCR反應體系25μL：1×緩沖液，0.875mmol/ μ LdNTP，1.5U Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L MgCl2，引物各300ng/μL，2μL模板DNA，最后用滅菌雙蒸水補充至25μL。反應條件：95℃預變性5min，94℃變性1min，51℃復性1min，72℃延伸3min，共32個循環(huán)，最后72℃延伸16min結束反應。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000Maker（TaKaRa）作為分子量參照，凝膠成像后，用透射紫外燈觀查結果。為了減少誤差，所有分離菌的ERIC-PCR均在同一反應條件下一次完成，反應產(chǎn)物加樣于同一塊凝膠中進行電泳。

1.7 ERIC-PCR指紋分析

記錄擴增產(chǎn)物的電泳譜帶。樣品有擴增帶，賦值為“1”，無擴增帶，賦值為“0”，用電泳圖象分析軟件（Gel Image System）進行分析。采用非加權對數(shù)算術平均法（UPGMA）、利用NTSYS-pc 2.10軟件構建聚類樹狀圖進行聚類分析。每一個分離株看作是一個分類學單位（Operational Taxonomic Unit,OTU），并且把≥90%相似性的菌株看作是一個分離株[9]。

2 結果

2.1 大腸桿菌分離鑒定

115份樣品中，有23份分離到大腸桿菌，陽性率平均為21.74%。牛乳中有21份分離到大腸桿菌，陽性率為20.59%（21/102）；羊乳中有2份分離到大腸桿菌，陽性率為15.38%（2/13）。本次試驗共分離到菌株25株，其中牛乳22株、羊乳3株（見表1）。

表1 生鮮乳中大腸桿菌的分離情況

2.2 ERIC-PCR鑒定

圖1 25株大腸桿菌菌的ERIC-PCR聚類圖

用ERIC-PCR方法對從生鮮乳中分離的大腸桿菌進行擴增，根據(jù)電泳譜帶繪制的UPGMA遺傳進化樹見圖1。25株分離大腸桿菌遺傳相似性分別在56%～100%之間。有12株（菌株1與菌株2；菌株24與菌株25；菌株7與菌株13及菌株10；菌株11與菌株12；菌株18與菌株19及菌株20）兩兩之間的同源性＞90%，其中株菌17與菌株21的相似性為100%。

3 討論

乳及乳制品質(zhì)量安全生產(chǎn)是通過對整個供應鏈（即從農(nóng)場到餐桌的過程）的控制達到的，過去對最終產(chǎn)品質(zhì)量合格檢驗的控制模式，已經(jīng)不能適應現(xiàn)代的乳及乳制品質(zhì)量安全生產(chǎn)的發(fā)展需要。在整個供應鏈當中，奶源是供應鏈的起點，乳制品是最終產(chǎn)品，這兩點是乳品質(zhì)量安全得以實現(xiàn)的關鍵[10]。

眾多的乳制品質(zhì)量安全問題嚴重阻礙了我國乳制品行業(yè)的發(fā)展。造成質(zhì)量安全問題的原因是多方面的，其中生鮮乳及乳制品微生物超標是重要原因之一。在生鮮乳及乳制品生產(chǎn)中，大腸桿菌超標是一個重要的衛(wèi)生安全問題[11]。本研究按照食品衛(wèi)生微生物學檢驗-大腸桿菌檢驗標準對采集的生鮮乳進行大腸桿菌分離鑒定，并分析分離株的同源性[12]。結果從115份樣品中的23份中分離到25株大腸桿菌，其中牛乳陽性率為20.59%（21/102），羊乳陽性率為15.38%（2/13），高于袁丹茅[13]、趙承輝[14]報道的分離率。

細菌的傳統(tǒng)分類方法難以區(qū)分同一種類中極為相近的菌株。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌中的ERIC序列是一段長126bp的反向重復序列，定位于基因組內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)域與轉(zhuǎn)錄有關的區(qū)域[15]。ERIC序列分布于整個基因組中，具有極強的保守型，用ERIC-PCR得到的DNA條帶特征能反映出細菌整個基因組結構的差異，能區(qū)別包含有ERIC這些重復序列的不同細菌種和菌株，因此具有很強的鑒別菌種乃至菌株的能力[16]。Borges等人[17]用重復序列為特異引物，以污染水中分離的大腸桿菌的染色體DNA為模板進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)分離菌株產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳分離時能各自顯示出獨特的條帶特征，確認出相似指數(shù)和遺傳距離，從而有效區(qū)分不同的菌株。Ibenyassine等人[18]用ERIC-PCR對受污水灌溉的蔬菜中的大腸桿菌進行指紋圖譜分析與限制性片段長度多態(tài)性（RFLPs）分析得到一致結果。Hulton等人[19]用ERIC-PCR指紋圖譜分析方法對大腸桿菌、沙門氏菌和其他腸桿菌及其結構進行了初步鑒定，同時也區(qū)分了不同的血清型。

本研究通過ERIC-PCR方法得到25株大腸桿菌的指紋圖譜，大腸桿菌遺傳相似性分別在56%～100%之間，有12株兩兩之間的同源性＞90%。不同奶站大腸桿菌之間的同源性＞90%，說明不同奶站之間存在被同一株大腸桿菌污染的情況。菌株15與其他菌株之間的同源性僅為56%，說明污染奶站的大腸桿菌存在多樣性的特點。

普遍認為大腸桿菌是生鮮乳及乳制品的污染源，因此大腸桿菌是生鮮乳及乳制品生產(chǎn)中最重要的目標控制微生物之一，其數(shù)量的高低直接反映生產(chǎn)過程的衛(wèi)生狀況，對大腸桿菌的檢測及同源性分析意義重大。作為一種分子分型技術，ERIC-PCR可用于生鮮乳大腸桿菌的基因分型研究。

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Identifcation and Analysis on the DNA Fingerprints of E.coli in Fresh Milk Using ERIC-PCR

ZHONG Zhao-bing1, HOU Lei2, WANG Ning1, YANG Fu-hui1
(1.Taian Daiyue District Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Taian 271000; 2.Taian District Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Taian 271000)

To determine the prevalence of E.coli infection in fresh milk and genetic similarities between different strains, and then provide an effective technological support for the real-time monitoring E.coli in the dairy production in raw and fresh milk acquisition station. A conventional culture-based study was performed and E.coli strains were isolated and identifed. E.coli strains were amplifed using ERIC-PCR and then their DNA fngerprints were analyzed. E.coli was detected in 23/115 samples and 25 E.coli strains were obtained, the twenty-fve E.coli strains genetic similarity index was 50%～100%. The results showed that fresh milk was contaminated with different strains of E.coli. Different genotypes of E.coli were present in the same raw and fresh milk acquisition station sample and same genotypes was present in different raw and fresh milk acquisition station sample.

Fresh milk; E.coli; Isolation and identifcation; ERIC-PCR

TS252.1

A

1004-4264（2017）03-0036-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.03.011

第二屆“牛人”攝影大賽作品 《圣牧花園牧場》——崔淑芳 圣牧高科

2016-12-13

泰安市科技計劃項目（奶牛高產(chǎn)高效繁育技術集成示范[2016]）。

鐘召兵（1980-），男，山東諸城人，碩士，研究方向為畜禽環(huán)境空氣病原微生物的分離與鑒定。