丙型肝炎病毒蛋白對肝細胞RASSF2 mRNA表達的影響及其機制

陳煒，馮德云，李波，王穎

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 病理科，湖南 長沙 410008）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是肝細胞癌發(fā)生的重要誘因之一，據(jù)統(tǒng)計，全世界有2億多人感染了HCV病毒，約占了世界人口的3.3%。HCV蛋白受宿主和病毒蛋白酶的作用被切割形成至少10種蛋白，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白（核心蛋白Core、包膜蛋白E1和E2，還有p7離子通道）和6種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。隨著對腫瘤發(fā)病機制認識的深入，表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤發(fā)生中的作用已日漸受到重視。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要表現(xiàn)形式，是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段，RASSF2通過啟動子甲基化在多種腫瘤中失活[1-7]。它作為一種潛在的抑癌基因，具有促進凋亡和細胞周期停滯及抑制細胞生長的作用[8-9]。RASSF2有3個轉(zhuǎn)錄本，分別為RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C，僅RASSF2A轉(zhuǎn)錄本的啟動子區(qū)有CpG島。研究表明，RASSF2A以GTP依賴的方式與K-RAS直接結(jié)合，促進細胞凋亡、細胞周期停滯和抑制細胞生長[8]，在肺癌、胃癌、乳腺癌及胰腺癌中存在RASSF2A啟動子甲基化[1,10-11]。5-雜氮-2'-脫氧胞苷（5-aza-dC）是一種核苷酸類似物，可抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，使DNA去甲基化，體外實驗表明，5-aza-dC對胰腺癌、鼻咽癌、胃癌及結(jié)腸癌等多種細胞有顯著生長抑制作用[12-15]，推測HCV蛋白可能是通過誘導(dǎo)RASSF2A基因啟動子甲基化，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而異常激活RAS信號通路，參與肝細胞惡性轉(zhuǎn)化。本研究觀察了分別表達NS3、Core、NS5A的QSG7701肝細胞株（NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701）中RASSF2 mRNA表達水平的改變，并探討RASSF2A啟動子甲基化在HCV蛋白所致的肝細胞癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

穩(wěn)定表達Core、NS3的人源肝細胞系Core/QSG7701和NS3/QSG7701由本實驗室構(gòu)建及保存；穩(wěn)定表達NS5A的人源肝細胞系NS5A/QSG7701由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院傳染科龔國忠教授惠贈；其中L02細胞株購自中南大學(xué)細胞生物學(xué)研究室；RT-PCR試劑盒、DNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司；EZDNA甲基化修飾試劑盒購自天漠科技有限公司；5-aza-dC購自Sigma公司；NS3、NS5A、β-Actin單克隆抗體以及Core多克隆抗體均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔和羊抗鼠均購自中杉金橋；AnnexinV/PI雙染試劑盒購自聯(lián)科生物；細胞增殖與毒性檢測試劑盒購自七海復(fù)泰。RASSF2基因的PCR引物由上海生物工程有限公司合成（正義：CTA TGG CTC TGT CAC CAA CG，反義：GCT TCT GTT TCT CAC CAC TCG，長度128 bp），GAPDH引物（正義：GTG AAC CAT GAG AAG TAT GAC AAC，反義：CAT GAG TCC TTC CAC GA TAC C，長度123 bp）；RASSF2A啟動子甲基化引物（正義：GTT CGT CGT CGT TTT TTA GGC G，反義：AAA AAC CAA CGA CCC CCG CG，長度108 bp），RASSF2A啟動子未甲基化引物（正義：AGT TTG TTG TTG TTT TTT AGG TGG，反義：AAA AAA CCA ACA ACC CCC ACA，長度108 bp）。

1.2 主要方法

1.2.1 RT-PCR 按照細胞中提取RNA的步驟所示取出生長良好的細胞，用PBS清洗3次，1 mL的TRIzol試劑吹打，200 μL的三氯甲烷孵育5 min，500 μL的異丙醇孵育10 min，75%的乙醇吹打混勻，離心后靜置干燥5 min。加入10 μL的DEPC水，吹打混勻，取2 μL RNA樣本，紫外分光光度計檢測RNA樣本的濃度和純度，再根據(jù)TAKARA公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所示配制基因組DNA去除的反應(yīng)液，共 10 μL，反應(yīng)條件為 42 ℃ 2 min，4 ℃存放。配制20 μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，反應(yīng)條件為37 ℃15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃存放，根據(jù)康維世紀PCR試劑盒進行擴增，擴增條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性 30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，72 ℃終延伸2 min，共35個循環(huán)，擴增結(jié)束后取出樣本，配制好2%的瓊脂糖凝膠，直接進行電泳。

1.2.2 甲基化特異性PCR（MSP） 細胞培養(yǎng)好后取出，胰酶消化后，用1 mL的PBS吹打，離心后加入200 μL的PBS重懸細胞，根據(jù)TAKARA公司的全基因組DNA提取試劑盒所示，最終洗脫DNA，再取20 μL DNA按照天漠公司的甲基化修飾試劑盒所示加入CT Conversion Reagent，放到PCR儀上，設(shè)置程序為98 ℃ 10min，64 ℃ 2.5 h，接著繼續(xù)按試劑盒所示最終洗脫DNA，按照康維世紀盒所示配制50 μL PCR擴增反應(yīng)液，設(shè)置反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸2 min，共35個循環(huán)，擴增后取反應(yīng)產(chǎn)物，配制好2%的瓊脂糖凝膠后，進行電泳。

1.2.3 Western blot 首先按步驟提取細胞中的總蛋白，準備4 ℃離心機，用冰的PBS洗滌3次，每瓶細胞中加入100 μL的細胞裂解混合物，冰上裂解30 min，離心后得到蛋白，用BCA法測定樣本OD值，每管加入25 μL的標準品和200 μL已配制好的工作液，37 ℃孵育30 min，568 nm處測定OD值。然后每管加入22.5 μL的雙蒸水、2.5 μL的待測蛋白及200 μL的分析液，37 ℃孵育30 min，測OD值計算蛋白濃度，再按比例將蛋白與上樣緩沖液混合，沸水5 min，按步驟配好分離膠和積層膠后，將Maker、混合物和上樣緩沖液加入到凝膠孔中，連接電泳裝置，65 V電壓50 min，110 V電壓60 min，完畢后取出凝膠，配制好轉(zhuǎn)膜緩沖液，并加入甲醇，將凝膠和濾紙直接放入到轉(zhuǎn)膜緩沖液中，PDVF膜甲醇浸泡15 s，雙蒸水平衡5 min，放到轉(zhuǎn)膜緩沖液里。安裝三明治結(jié)構(gòu)，從下到上依次為濾紙→PVDF膜→凝膠→濾紙。15 V恒壓45 min。配制好封閉液，PVDF膜放到封閉液中，搖晃4 h。接著一抗孵育（搖床2 h，4 ℃冰箱過夜），TBST洗滌3次，每次10 min，二抗孵育4 h，TBST洗滌3次，每次10 min。打開顯像儀，設(shè)置曝光程序為每5s曝光1次，共曝100張。

1.2.4 MTT 待細胞生長良好后，PBS洗3次，胰酶消化吹打細胞并計數(shù)。每孔加入2 500個細胞，設(shè)置5個復(fù)孔，且每株細胞分別為對照組和實驗組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，避光加入20 μL（5 mg/mL）的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。加入150 μL的DMSO，搖晃20 min后，酶標儀490 nm處測其OD值。

1.2.5 流式細胞術(shù) 取生長良好的細胞，胰酶消化后分組，再加入不同濃度藥物，貼壁生長后用預(yù)冷PBS洗滌3次，并重懸。再按照試劑盒所示加入相應(yīng)試劑，上機前加入10 μL的PI，避光孵育10 min。加入400 μL的1×結(jié)合緩沖液，上機并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用PASW Statistics 18軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701細胞中相應(yīng)蛋白表達

提取分別轉(zhuǎn)染空載體pRcCMV、NS3、NS5A和Core表達質(zhì)粒的QSG7701細胞的總蛋白，檢測NS3、Core、NS5A蛋白的表達，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了NS3、NS5A和Core表達質(zhì)粒的細胞均有相應(yīng)蛋白的表達（圖1）。

圖1 NS3、Core、NS5A蛋白檢測Figure1 Detection of expressions of NS3, Core and NS5A proteins

2.2 L02、Core/QSG7701、NS3/QSG7701及 NS5A/QSG7701細胞中RASSF2 mRNA表達

提取L02、Core/QSG7701、NS3/QSG7701及NS5A/QSG7701細胞的總RNA，檢測每株細胞RASSF2 mRNA的相對表達量，與L02細胞（RASSF2 mRNA表達量：0.582±0.066）比較，Core/QSG7701（RASSF2 mRNA表達量：0.027±0.004）、NS3/QSG7701（RASSF2 mRNA表達量：0.146±0.074）及NS5A/QSG7701（表達水平0.094±0.014）3株細胞的RASSF2 mRNA的表達均明顯降低（P=0.000、0.002、0.000）（圖2）。

圖2 RASSF2 mRNA表達檢測Figure 2 Detection of RASSF2 mRNA expressions

2.3 RASSF2A啟動子甲基化檢測

提取NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701細胞的DNA，進行甲基化的修飾，檢測該3株細胞系的RASSF2A啟動子的甲基化狀態(tài)，顯示3株細胞RASSF2A啟動子均發(fā)生了完全甲基化（圖3）。

圖3 MSP結(jié)果 M：甲基化特異性擴增；U：非甲基化特異性擴增Figure 3 Results of MSP M: Methylated-specific methylation;B: Unmethylated-specific methylation

2.4 5-aza-dC處理對各細胞RASSF2 mRNA表達的影響

每株細胞設(shè)置3組，分別為未加藥物的對照組、5 μmol/L 5-aza-dC實驗組和10 μmol/L 5-azadC實驗組，培養(yǎng)4 d，檢測各組細胞RASSF2 mRNA的表達。結(jié)果示：NS3/QSG7701細胞株中，與對照組比較，5 μmol/L 5-aza-dC實驗組和10 μmol/L 5-aza-dC實驗組RASSF2 mRNA的表達明顯增多（P=0.000、0.000）；Core/QSG7701細胞株中，與對照組比較，5 μmol/L 5-aza-dC實驗組和10 μmol/L 5-aza-dC實驗組RASSF2 mRNA的表達明顯增多（P=0.023、0.000）；NS5A/QSG7701細胞中，與對照組比較，5 μmol/L 5-aza-dC實驗組和10 μmol/L 5-aza-dC實驗組RASSF2 mRNA的表達無明顯變化（P=0.170、0.270）（圖4）。

2.5 5-aza-dC處理對NS3/QSG7701和Core/QSG7701細胞生物學(xué)行為的影響

將NS3/QSG7701和Core/QSG7701細胞分為未加藥物的對照組和10 μmol/L 5-aza-dC處理的實驗組，NS3/QSG7701細胞株對照組與實驗組凋亡率分別為（11.68±1.05）%、（27.60±1.57）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；Core/QSG7701細胞株對照組與實驗組凋亡率分別為（20.38±1.62）%、（56.79±1.92）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）（圖5）。同時，于10 μmol/L 5-aza-dC處理0、24、48、72 h后檢測細胞的增殖，與對照組比較，NS3/QSG7701細胞72 h后，細胞的增殖明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）；Core/QSG7701細胞24、48、72 h時間點，細胞的增殖均明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（表2）。

圖4 5-aza-dC處理后各細胞RASSF2 mRNA的表達 A：NS3/QSG7701細胞；B：Core/QSG7701細胞；C：NS5A/QSG7701細胞Figure 4 RASSF2 mRNA expressions in each type of cells after 5-aza-dC treatment A: NS3/QSG7701 cells; B: Core/QSG7701 cells;C: NS5A/QSG7701 cells

圖5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡Figure 5 Cell apoptosis detected by flow cytometry

表1 5-aza-dC處理對NS3/QSG7701細胞增殖的影響（OD，±s）Table 1 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in NS3/QSG7701 cells (OD,±s)

表1 5-aza-dC處理對NS3/QSG7701細胞增殖的影響（OD，±s）Table 1 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in NS3/QSG7701 cells (OD,±s)

注：1)與0 h比較Note: 1) Comparison with 0-h value

時間 對照組 實驗組 P1)0 h 0.09±0.008 0.09±0.008 —24 h 0.453±0.029 0.375±0.045 0.065 48 h 1.260±0.108 1.116±0.003 0.082 72 h 1.458±0.028 1.273±0.017 0.010

3 討 論

HCV基因組大約有9.6 kb，編碼約含3 000個氨基酸的多聚蛋白，能被病毒或宿主細胞的酶剪切成至少10種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在病毒的復(fù)制和致病過程中起著重要作用[16]。研究[17]表明，表達HCV相關(guān)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至正常肝細胞后，能促進肝細胞無限增殖，并導(dǎo)致其惡性轉(zhuǎn)化。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中最常見的現(xiàn)象，約60%的人類基因啟動子區(qū)含有CpG島。CpG島甲基化使染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，高度螺旋化，凝縮成團，失去轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制。目前發(fā)現(xiàn)啟動子高甲基化的基因有Rb、P16INK4a、VHL、hMLH，這些啟動子基因的高甲基化與細胞周期、凋亡、DNA的修復(fù)以及血管生成有關(guān)[18-21]。有研究[22-24]顯示抑癌基因RASSF2A基因失活最重要的機制是由于其啟動子發(fā)生了甲基化，在結(jié)腸癌的細胞系、結(jié)腸腺瘤以及結(jié)腸癌中常見RASSF2A啟動子甲基化，而正常的結(jié)腸黏膜則否。

表2 5-aza-dC處理對Core/QSG7701細胞增殖的影響（OD，±s）Table 2 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in Core/QSG7701 cells (OD，±s)

表2 5-aza-dC處理對Core/QSG7701細胞增殖的影響（OD，±s）Table 2 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in Core/QSG7701 cells (OD，±s)

注：1)與0 h比較Note: 1) Comparison with 0-h value

時間 對照組 實驗組 P1)0 h 0.09±0.008 0.09±0.008 —24 h 0.394±0.005 0.354±0.012 0.006 48 h 1.150±0.017 0.999±0.028 0.001 72 h 1.417±0.058 1.136±0.029 0.002

既往研究[25]表明表觀遺傳學(xué)的變化是可逆的，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑可以改變DNA啟動子甲基化的狀態(tài)，使其發(fā)生去甲基化，5-aza-dC是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，當(dāng)DNA復(fù)制時，它可結(jié)合到5-甲基胞嘧啶的位置，使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶失活，達到去甲基化的作用，使甲基化的抑癌基因重新活化，抑制細胞生長或促進細胞凋亡。5-aza-dC除了能夠誘導(dǎo)DNA去甲基化，還可以使組蛋白去甲基化，它還可還原甲基化或乙?；T導(dǎo)的染色質(zhì)重塑[26]。在基因轉(zhuǎn)錄沉默過程中，組蛋白乙酰化和DNA甲基化之間相互作用，啟動子CpG島的甲基化使局部的組蛋白去乙酰化，組蛋白乙?；ＷoDNA不發(fā)生甲基化[27]。

本研究檢測了正常肝細胞L02和NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701細胞系中RASSF2 mRNA的表達，結(jié)果顯示，與正常的肝細胞L02相比，NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701細胞的RASSF2 mRNA的表達均下降，表明NS3、Core和NS5A蛋白能抑制RASSF2 mRNA的表達；MSP檢測該3株細胞系中RASSF2A基因啟動子甲基化的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)RASSF2A基因啟動子均發(fā)生了完全甲基化。為了進一步分析RASSF2 mRNA的表達的下降是否與RASSF2A啟動子的高甲基化有關(guān)，用不同濃度的去甲基化藥物5-aza-dC處理了NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-aza-dC處理后，NS3/QSG7701和Core/QSG7701細胞RASSF2 mRNA的表達明顯升高，而NS5A/QSG7701細胞RASSF2 mRNA的表達沒有明顯改變。這說明HCVNS3和Core可能通過RASSF2A啟動子甲基化，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制作用，而NS5A/QSG7701細胞RASSF2 mRNA表達降低，可能除了啟動子甲基化外，還有其他表觀遺傳學(xué)修飾參與了轉(zhuǎn)錄沉默。

細胞增殖和細胞凋亡是反映細胞生物學(xué)行為的主要指標之一，有研究[28-31]證實同為RASSF家族的RASSF5作為RAS效應(yīng)因子，連接RAS與HIPPO信號通路，在調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性和促進衰老的過程中發(fā)揮著重要作用，抑癌基因RASSF2A很可能是通過與K-Ras相互作用發(fā)揮其促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的功能[32]，本研究結(jié)果顯示，10 μmol/L 5-aza-dC處理NS3/QSG7701和Core/QSG7701細胞后，能抑制細胞增殖和促進細胞凋亡，表明HCVNS3和Core可能是通過促進RASSF2A啟動子甲基化導(dǎo)致其表達下調(diào)，從而在HCV致癌過程中通過影響肝細胞的生物學(xué)行為參與肝細胞癌的發(fā)生。

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