原發(fā)灶腫瘤體積對局部進展期直腸癌新輔助放化療后病理完全反應的預測價值

李玉強，裴謙，裴海平

（中南大學湘雅醫(yī)院 胃腸外科，湖南 長沙 410008）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大惡性腫瘤[1]，其中直腸癌約占30%[2-3]。過去幾十年中直腸癌的療效不斷提高[4]。目前，新輔助放化療（nCRT）后行全直腸系膜切除術（total mesorectal excision，TME）已經(jīng)成為局部進展期直腸癌（locally advanced rectal cancer，LARC）的標準治療方案[5-6]?；颊邔π螺o助放化療的敏感程度存在個體化差異，約20%可達到病理完全緩解（pCR，ypT0N0M0），而有30%的患者無反應甚至出現(xiàn)疾病進展[7]。達到pCR后可有效控制原發(fā)灶、降低復發(fā)轉(zhuǎn)移率、延長無病生存期及總生存期[8-9]。因此，Angelita Habr-Gama提出“觀察等待”策略，針對達到臨床完全緩解（clinical complete response，cCR）的患者予以觀察而非手術治療[10]，目前cCR是臨床上pCR的替代指標[4]。研究[11-12]表明腫瘤大小可作為一個強有力的臨床預測因素，目前衡量腫瘤大小多采用一維測量瘤體直徑，其能否反映瘤體三維結構及實際大小存在爭議。因而有研究[13-14]提出原發(fā)灶大體腫瘤體積（GTV）更為可靠。原發(fā)灶GTV與放療敏感性明顯相關，其相關機制可能與腫瘤干細胞數(shù)量有關[15-16]。本研究旨在比較三維GTV與一維最大腫瘤直徑預測pCR的有效性，尋找更精確的臨床預測pCR的因素。同時分析GTV與直腸癌干細胞相關性，進而對GTV與放療敏感性相關機制進行探討。CD133作為結直腸癌干細胞的經(jīng)典分子標記物[15-16]，可用于評估直腸癌干細胞表達情況。

1 資料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析中南大學湘雅醫(yī)院胃腸外科于2009年3月—2015年12月收治的行nCRT后予以根治性切除的LRAC患者共107例。采用直腸指檢。胸部X片。腹盆和/或胸部平掃增強CT、盆腔MRI、SPECT和/或內(nèi)鏡超聲（ERUS）評估證實臨床分期為T3～4或N+（cII～III），并確定無遠處轉(zhuǎn)移。排除標準包括：同時性多發(fā)腫瘤，僅短程放射治療，盆腔放療史。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 GTV測量標準

根據(jù)nCRT前2周內(nèi)完成的CT掃描進行腫瘤靶區(qū)的勾畫，通過在CT每一掃描層面上的各方向軸進行繪制并計算出靶區(qū)體積。我院的CT掃描厚度存在時間差異，2013年12月前為5 mm，之后為3 mm。臨床III期直腸癌GTV包括腫瘤原發(fā)灶GTV以及區(qū)域淋巴結GTV。所有GTV均經(jīng)2名腫瘤科醫(yī)生及1名放射科醫(yī)生共同審查確定。通過Varian Treatment Planning System計算原發(fā)灶GTV的三維數(shù)據(jù)（Eclipse?External Beam Planning System，Version 11.03.1，PRO 11.03.1，AAA 11.03.1 Varian Medical Systems）。通過Varian system計算腫瘤最大徑及腫瘤沿腸管縱軸最大長度。

1.3 治療方案

放療方案：整個盆腔野進行46～50 Gy的劑量照射，以23～25個分割完成（2 Gy/分割，1周連續(xù)5 d），腫瘤原發(fā)灶再進行6～8 Gy的補加照射，以3～4個分割完成。整個放療療程不超過6周。所有患者均在CT模擬下進行三維適形調(diào)強放療（IMRT），采用三野放射方案，即前后野進行6-MV光子束照射，雙側野進行15-MV照射。

化療方案：口服希羅達（825 mg/m2，2次/d，與放療同步）或靜滴5-FU化療，每個周期400 mg/（m2·d），5 d，放療第1周及最后1周各行1個周期。聯(lián)合化療方案：CapeOX方案（奧沙利鉑和卡培他濱）、mFolfox6方案（奧沙利鉑、亞葉酸鈣和氟尿嘧啶）。

圖1 nCRT后腫瘤病理反應（×100） A：原發(fā)灶pCR，黏液湖（黑色箭頭）中未檢測到腫瘤細胞；B：原發(fā)灶非pCR，黏液湖（黑色箭頭）中見玻璃樣變性（黃色箭頭）和腫瘤細胞（紅色箭頭）；C：淋巴結pCR，玻璃樣變性（黃色箭頭處），未檢測到腫瘤細胞；d：淋巴結非pCR，玻璃樣變性（黃色箭頭），可檢測到腫瘤細胞（紅色箭頭）Figure 1 Tumor pathologic response to nCRT (×100) A: Primary tumor pCR, where no detectable tumor cells in the mucous lake(black arrow); B: Primary tumor non-pCR, where hyaline degeneration (yellow arrow) and tumor cells (red arrow) presenting in the mucous lake (black arrow); C: Nodal pCR, which showing hyaline degeneration (yellow arrow) without detectable tumor cells;D: Nodal non-pCR, which showing hyaline degeneration (yellow arrow) and tumor cells (red arrow)

nCRT后至少4周再行直腸癌根治術，術式包括：Dixon、Miles、Hartmann、Dixon+回結腸保護性造口。

1.4 腫瘤放療反應評價標準

手術切除直腸癌標本經(jīng)病理科常規(guī)處理后切片（4 mm厚），顯微鏡下評判CRT敏感度。pCR定義為腸壁（T分期）及區(qū)域淋巴結（N分期）內(nèi)均無活性腫瘤細胞殘留（ypT0N0），即相當于腫瘤退縮分級（TRG）中的4級（完全退縮）：僅見纖維化、玻璃樣變或黏液湖，而無活性腫瘤細胞。而所有其他的病理反應情況，包括TRG 0～3級（腫瘤無退縮、少量退縮、中等退縮、接近完全退縮）均定義為非pCR[7]（圖1）。

1.5 數(shù)據(jù)收集

收集以下與直腸癌新輔助放化療療效可能相關數(shù)據(jù)：患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、臨床TNM分期，腫瘤最大徑、腫瘤體積、腫瘤最大長度，腫瘤距肛門距離、組織學類型、新輔助放化療前后癌胚抗原（CEA）、糖鏈抗原（CA19-9、CA242）、同步化療方案、放療手術間期等。

臨床T期分級通過盆腔MRI、CT和/或ERUS進行評估。臨床N分期通過盆腔MRI或CT評估，區(qū)域淋巴結最短徑≥5 mm定義為陽性[17]。腫瘤距肛緣距離主要通過直腸指檢及腸鏡評估，并選取其中的較小值。本研究中采用腫瘤原發(fā)灶GTV代表腫瘤體積。根據(jù)第七版AJCC標準進行TNM分期[18]。nCRT前血清腫瘤標記物水平獲自患者nCRT前2周內(nèi)的外周血，nCRT后血清腫瘤標記物水平獲自根治手術之前3～10 d內(nèi)，患者均為空腹抽血。

1.6 免疫組化染色

主要試劑：CD133兔抗人多克隆抗體購自武漢三鷹，二抗購自Dako公司。實驗步驟：標本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，徠卡切片機連續(xù)切片（厚5 μm），分別進行蘇木精-伊紅染色和免疫組化染色。免疫組化染色采用Envision二步法，染色過程中設陽性及陰性對照，常規(guī)脫蠟、水化、常溫阻斷、枸櫞酸鹽抗原熱修復，DAB顯色，蘇木精復染，封片觀察。石蠟切片免疫組化結果判讀：CD133陽性表達為棕黃色，超過10%的腫瘤細胞陽性表達即判讀為CD133陽性。

1.7 統(tǒng)計學處理

使用IBM SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析，根據(jù)數(shù)據(jù)的性質(zhì)，組間比較分析使用Pearson檢驗、確切概率法、Mann-Whitney U檢驗或t檢驗。GTV與CD133表達之間的關系采用χ2檢驗，原發(fā)腫瘤GTV和腫瘤直徑之間的關系采用Pearson相關分析。構建Logistic回歸模型，對所有單變量分析中P＜0.15的獨立變量納入模型進行回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 LARC患者資料及臨床因素與pCR的關系

107例患者的年齡中位數(shù)為53（19～78）歲，其中男65例（60.75%），女42例（39.25%）。共25例（23.36%）達到pCR，82例（76.64%）為非pCR。pCR組腫瘤原發(fā)灶GTV明顯小于非pCR組患者（P=0.024）、nCRT前血清CEA水平明細低于非pCR組（P=0.020），聯(lián)合化療比例高于非pCR組（P=0.05），而兩組患者間性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、臨床T分期、N分期、腫瘤最大徑、腫瘤體積、腫瘤腸管縱軸最大長度、腫瘤距肛門距離、組織學類型、nCRT后血清CEA水平、nCRT前后糖鏈抗原（CAl9-9、CA242）均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）（表1）。

表1 LARC患者臨床因素與pCR關系的單變量分析Table 1 Univariate analysis of relations of clinical factors with pCR in LARC patients

2.2 相關性分析

Pearson相關分析顯示，原發(fā)灶GTV與腫瘤延腸管縱軸長度（r=0.580，P＜0.001）及腫瘤最大徑（r=0.608，P＜0.001）成正相關（圖2），其中與腫瘤最大徑相關性更大。但本研究同時顯示，原發(fā)灶GTV與腫瘤最大徑不能完全等同。腫瘤體積相近，腫瘤最大徑可有明顯差異；腫瘤最大徑相近，腫瘤體積有明顯差異。

圖2 原發(fā)灶GTV與腫瘤一維長度的相關性Figure 2 Correlation between primary GTV and unidimensional length of the tumor

2.3 原發(fā)灶GTV截點值的選擇

原發(fā)灶GTV與腫瘤反應作為變量生成的ROC曲線確定最佳原發(fā)灶GTV截點值。ROC曲線中采用最大Youden指數(shù)（靈敏度與特異度之和減去1）計算截點值[19]。本研究中最大Youden指數(shù)為0.335（敏感性92.0%、特異性41.5%），對應的原發(fā)灶GTV值為70.29 cm3（圖3）。所以采用70 cm3作為原發(fā)灶GTV截點值。

2.4 Logistic回歸分析

Logistic回歸分析顯示，相對小的原發(fā)灶GTV（P=0.019）以及聯(lián)合化療方案（P=0.032）是pCR的獨立預測因素（表2）。

圖3 原發(fā)灶GTV以腫瘤反應作為變量的ROC曲線Figure 3 ROC curve of primary GTV using tumor response as test variable

表2 LARC患者臨床因素與pCR關系的Logistic回歸分析Table 2 Logistic regression analysis of relations of clinical factors with pCR in LARC patients

2.5 免疫組化結果分析

GTV＜70 cm3者中，CD133表達陽性為13例（39.4%），CD133表達陰性為20例（60.6），而在GTV≥70 cm3者中，CD133表達陽性為14例（73.7），CD133表達陰性為5例（26.3）。兩者差異有統(tǒng)計學意義（P=0.017）（圖4）（表3）。

圖4 原發(fā)灶GTV勾勒結果與腫瘤組織CD133表達 A：CD133陰性LARC患者原發(fā)灶GTV；B：CD133陽性LARC患者原發(fā)灶GTV；C：CD133陰性（×200）；D：CD133陽性（×200）Figure 4 Outline of the primary GTV and CD133 expressions in tumor tissues A: The primary GTV in LARC patient with negative CD133 expression; B: The primary GTV in LARC patient with positive CD133 expression; C: Negative CD133 expression (×200);D: Positive CD133 expression (×200)

表3 原發(fā)灶GTV與CD133表達的關系[n（%）]Table 3 Relationship between primary GVT and CD133 expression [n (%)]

3 討 論

3.1 研究pCR預測因素的臨床意義

大量數(shù)據(jù)顯示LARC行nCRT達到pCR可有效控制局部病灶、降低遠處轉(zhuǎn)移率、延長生存期[8-9]，更是促進了臨床治療策略的改變，如“觀察等待”策略的出現(xiàn)。避免手術治療甚至永久性造瘺[10]。遺憾的是達到pCR的幾率不甚滿意，約20%（8%～40%），本研究中pCR率（23.36%）在此范圍內(nèi)。臨床工作主要集中于如何提高pCR率，提高臨床療效。為避免過度的侵入性治療，研究pCR預測因素也具有重要臨床意義，且臨床指標獲取方便、應用廣泛的特性，應予以重視。雖然目前沒有明確的臨床指標預測nCRT后pCR率，一些潛在的臨床預測因素值得研究。

3.2 腫瘤大小作為pCR臨床預測因素的局限性

腫瘤大小可作為臨床預測因素候選指標之一，其與pCR率成負相關性[21]。De Felice等[11]、Bitterman等[20]、Garland等[12]以及Probst等[21]研究表明腫瘤大小是pCR率的獨立預測因素。在這4個研究中，腫瘤大小的測量采用直腸指檢以及腸鏡測量，暴露了諸多問題。首先，無論是直腸指檢還是應用結腸鏡測量腫瘤大小均過于主觀，易產(chǎn)生嚴重的誤差。其次，結腸鏡僅僅能反映腫瘤腸腔內(nèi)最大長度以及周長，并不能準確反應腫瘤最大徑，更無法體現(xiàn)腫瘤真實體積[22]。再者在直腸管腔狹窄甚至梗阻的情況下，腸鏡無法通過病灶并準確測量腫瘤大小。目前采用的一維測量如腫瘤直徑能否反映腫瘤的三維體積，也值得深思。本研究選用原發(fā)灶GTV作為衡量腫瘤體積的指標，同時應用軟件測出原發(fā)灶腫瘤最大徑以及腸管內(nèi)最大長度，比較三者關系并分析。結果顯示原發(fā)灶GTV與腫瘤腸腔內(nèi)長度以及腫瘤最大徑有顯著相關性。但是只有原發(fā)灶GTV與pCR有顯著相關性，而腫瘤腸腔內(nèi)長度及腫瘤最大徑并沒有明顯相關性。一定程度上本研究解釋了一些研究未能顯示腫瘤大?。ú捎靡痪S方式測量）與nCRT后pCR率具有相關性的原因。同樣，Sorensen等[13]的研究得出相同的結論，采用一維測量方法不利于預測腫瘤對治療的敏感度。

3.3 原發(fā)灶GTV作為pCR臨床預測因素的優(yōu)勢

原發(fā)灶GTV作為一種更為精準的測量方式，同時有助于腫瘤精確放療。尤其應用于IMRT，原發(fā)灶GTV是放射治療尤其是IMRT時，實際接受射線照射的腫瘤體積。因此，理論上說，原發(fā)灶GTV與腫瘤的放療敏感性相關。目前大量臨床研究[23-28]證實，對于不同類型的腫瘤（如頭頸部腫瘤、非小細胞肺癌、宮頸癌、乳腺癌），GTV可影響其接受放療的敏感度及預后。有研究[14,29]甚至認為GTV可作為一個預后指標，影響腫瘤分期。本研究認為，相對腫瘤最大徑、cT、cN，原發(fā)灶GTV能更準確反應腫瘤真實體積，并與LARC患者行nCRT的敏感度成明顯相關性。

LARC患者行nCRT未能達到pCR的可能原因為腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）對放化療存在抵抗性。腫瘤干細胞為腫瘤組織中具有干細胞特征的細胞亞群，有關研究證實多種實體腫瘤中存在腫瘤干細胞，包括卵巢癌[30]、前列腺癌[31]、乳癌[32]、腦腫瘤[33]以及結直腸癌[34]等。盡管腫瘤干細胞在腫瘤組織中含量極少量，但其具有無限增殖潛能、可產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞并具有自我更新的能力，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及放化療敏感性密切相關。LARC患者實施nCRT可殺滅大量腫瘤細胞，抑制腫瘤生長，有效控制腫瘤局部。然而nCRT無法完全殺滅處于靜止期的腫瘤干細胞。甚至nCRT結束后，腫瘤干細胞可再度活躍導致腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移。相關機制可能包括：腫瘤干細胞處于低氧環(huán)境中[35]，低氧可降低腫瘤干細胞DNA損傷的幾率，同時放療因缺氧殺傷力大為減弱；腫瘤干細胞通常處于靜止期[36]，有利于其躲避放化療的殺傷；腫瘤干細胞的DNA損傷修復基因表達上調(diào)，激活DNA損傷修復相關蛋白[37]。

腫瘤干細胞可維持腫瘤細胞數(shù)目增長，因此認為腫瘤局部控制與腫瘤干細胞的數(shù)量密切相關。研究[28,38]表明腫瘤體積與腫瘤干細胞的數(shù)量成直線相關性。Withers等[39]認為腫瘤體積是腫瘤中活細胞和殘留死細胞體積的總和。因此，腫瘤體積和腫瘤干細胞數(shù)之間的相關性必然強烈依賴于死亡腫瘤細胞的清除率。Denekamp[40]通過測量各種接受射線照射后縮小的癌腫和肉瘤，發(fā)現(xiàn)癌腫在前24 h內(nèi)收縮，而肉瘤通常沒有收縮。因為相較于肉瘤，癌腫具有更明確的血管結構，因此癌腫本身具有較高的細胞損失率[41]，可能機制為癌癥可通過自溶或吞噬作用有效去除死亡腫瘤細胞[40-41]。具有低細胞損失率的腫瘤（如肉瘤或淋巴瘤[42]）可能不會呈現(xiàn)出腫瘤體積和腫瘤干細胞之間的相關性；而具有高細胞損失率的腫瘤（如支氣管癌，結腸直腸癌和頭頸部鱗狀細胞癌）會表現(xiàn)出這種相關性。

本研究采用CD133作為直腸癌腫瘤干細胞的分子標記，有研究[15-16]報道從結直腸癌分離出的CD133陽性細胞可表現(xiàn)出自我更新和高致瘤潛力的腫瘤起始細胞（cancer-initiating cell，C-IC）特性。O'Brien等[15]利用免疫缺陷型NOD/SCID小鼠中來鑒定人結腸癌起始細胞（CC-IC），該研究發(fā)現(xiàn)所有的CC-IC均為CD133陽性，而占大部分腫瘤的CD133陰性細胞不能啟動腫瘤生長；通過有限稀釋分析，262個CD133陽性細胞中存在1個CC-IC，而5.7×104個未分化腫瘤細胞中才存在1個CC-IC。Ricci-Vitiani等[16]的研究通過給免疫缺陷型NOD/SCID小鼠皮下接種CD133陽性的結直腸癌細胞并將腫瘤連續(xù)移植數(shù)代，檢測小鼠體內(nèi)形成的腫瘤，結果顯示新形成腫瘤與親代腫瘤生物學特征相同，并且隨著傳代的進行該腫瘤生長速度逐快以及致瘤能力逐漸加強；與CD133陰性細胞不同，將CD133陽性結直腸癌細胞在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，可呈指數(shù)級增長超過1年，并保持與原始腫瘤相同的形態(tài)學和免疫學特征，因此可以認為結直腸癌是由少量未分化的高致瘤性CD133陽性細胞增生產(chǎn)生的，也就是說CD133陽性的結直腸癌細胞具有結直腸癌腫瘤干細胞特性。本研究結果顯示CD133表達水平與腫瘤體積明顯相關，即GTV越大，其腫瘤組織中干細胞表達越高。因此腫瘤體積越大，治療應越積極。采用更高放射劑量可消滅更多腫瘤干細胞[38,43]。其他的腫瘤體積相關機制可能對CRT敏感性也有一定影響，如克隆分數(shù)、組織缺氧、克隆抗輻射性、細胞間通訊[44]。

腫瘤干細胞理論同樣支持本研究的其他結論，如聯(lián)合化療（5-FU+奧沙利鉑）可明顯提高pCR率。因個體耐受的放療劑量有限，放療的同時進行化療無疑可更有效的殺滅腫瘤干細胞在內(nèi)的腫瘤細胞。5-FU是細胞周期特異性藥物，在細胞分裂S期干擾DNA合成，可能對部分腫瘤細胞無效。奧沙利鉑是細胞周期非特異性藥物，與5-FU合用具有高效互補性。但是聯(lián)合化療對于nCRT患者是否獲益需要更多的臨床研究，目前僅有少量研究認為以5-FU為基礎的聯(lián)合化療可有效提高pCR率[45]。

3.4 其他臨床因素作為pCR預測因素

一些研究[47]表明nCRT前CEA水平、放療手術間期、腫瘤距肛緣距離[48]可作為pCR的預測因素。本研究中僅在單變量分析中顯示CRT前CEA水平與pCR率相關，在多變量分析無明顯相關性。放療手術間期和腫瘤距肛緣距離與pCR率無明顯相關性（具體數(shù)據(jù)文中未提供）。本研究中還分析了血清中CA19-9及CA242水平與pCR的相關性，但無統(tǒng)計學意義。

相對較小的樣本量和單一機構研究的回顧性數(shù)據(jù)是本研究的局限性，需要進一步的大樣本前瞻性隨機試驗來加強研究結果，促進LARC患者的個體化治療。

本研究病例中局部進展期直腸癌pCR率為23.36%。腫瘤原發(fā)灶GTV相對于腫瘤最大直徑或腫瘤長度更有效地反映腫瘤大小，是一個更準確的pCR獨立預測因素。CD133作為結腸癌腫瘤干細胞經(jīng)典分子標記物，其表達與GTV呈正相關，因此GTV越大，其腫瘤組織中干細胞表達越高，相應的治療應越積極。

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