甘草次酸脂化乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)探討Δ

金 粟，李士遠(yuǎn)，張秀榮，陳芳寧，王秀麗（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

·藥物分析與檢定·

甘草次酸脂化乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)探討Δ

金 粟＊，李士遠(yuǎn)，張秀榮，陳芳寧，王秀麗#（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的：為甘草次酸脂化乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考指標(biāo)。方法：采用冷凍透射電子顯微鏡檢測(cè)甘草次酸脂化乳粒子形態(tài)，激光納米粒度儀測(cè)定其粒徑、多分散系數(shù)（PDI）及電位情況；采用超高效液相色譜法測(cè)定其中有效成分甘草次酸的載藥量；在30℃下放置10 d考察該制劑的穩(wěn)定性。結(jié)果：制備的甘草次酸脂化乳輪廓清晰、結(jié)構(gòu)完整、呈類圓形、排列緊密；平均粒徑為（245.2± 4.29）nm，PDI為（0.054±0.01），平均電位為（－6.25±0.54）mV；甘草次酸的載藥量平均值為（1.25±0.09）mg/mL；質(zhì)量濃度為0.82 mg/mL的樣品在10 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。結(jié)論：粒徑、電位、載藥量、穩(wěn)定性可作為甘草次酸脂化乳的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

甘草次酸脂化乳；質(zhì)量評(píng)價(jià)；指標(biāo)；載藥量

脂化乳是一種新型給藥系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)體有相似之處，均屬于脂質(zhì)體系，能夠促進(jìn)藥物的腸淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)藥物吸收。脂質(zhì)體可以通過(guò)將藥物包封脂質(zhì)層內(nèi)，以增加難溶性藥物溶解度，提高藥物穩(wěn)定性，降低藥物刺激性等[1-3]；但脂質(zhì)體口服吸收會(huì)在胃腸道受到明顯破壞，降低載藥量，所以脂質(zhì)體難以通過(guò)口服給藥實(shí)現(xiàn)理想的藥物遞送。而脂化乳的穩(wěn)定性和載藥量較脂質(zhì)體有明顯提升，經(jīng)高壓乳勻納米化后，脂化乳劑粒徑分布均勻（可實(shí)現(xiàn)粒徑為200 nm左右），制劑質(zhì)地均勻。脂化乳制劑制備方法簡(jiǎn)單，輔料安全，具有良好的應(yīng)用前景。作為一種全新的給藥系統(tǒng)，需要建立合理的評(píng)價(jià)體系，以便對(duì)該制劑質(zhì)量進(jìn)行合理評(píng)價(jià)。而現(xiàn)有文獻(xiàn)并未有該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。因此，本課題組以甘草次酸為模型藥物，制備甘草次酸脂化乳，鑒于脂化乳與脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)有相似之處，在選擇評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)參考了脂質(zhì)體的評(píng)價(jià)指標(biāo)[4]，通過(guò)對(duì)粒徑、電位、載藥量、包封率、穩(wěn)定性等的檢測(cè)，確定脂化乳的評(píng)價(jià)指標(biāo)，以期為脂化乳制劑的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜（UPLC）Accuracy系統(tǒng)，包括二元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣恒溫樣本管理器、二極管陣列檢測(cè)器、Empower3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；NANO-pure Diamond Ro+型純水儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；FA1204B型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；KQ-300VDB型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：300 W，頻率：50 kHz）；SCIENTZ-II D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HD-3型紫外檢測(cè)儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光納米粒度儀（英國(guó)Malvern公司）；G16型醫(yī)用高速離心機(jī)（安新縣白洋離心機(jī)廠）；Tecnai G2-T20型冷凍透射電子顯微鏡，包括CCD數(shù)字成像系統(tǒng)、X射線能譜儀、掃描透射、高角環(huán)形暗場(chǎng)探測(cè)器、電子能量損失譜儀（美國(guó)FEI公司）。

1.2 試劑

甘草次酸提取物（寶雞國(guó)康生物科技有限公司，批號(hào)：111215，純度：≥98%）；甘草次酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110723-200411，純度：96.2%）；甲酸、甲醇為色譜純，膽固醇（PC-98T型）、蛋黃卵磷脂（PL-100M型）、大豆卵磷脂、氫化大豆磷脂、無(wú)水乙醇為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草次酸脂化乳的制備

精密稱取甘草次酸提取物25 mg、油相輔料（膽固醇、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化大豆磷脂）1 025 mg、油脂2 mL，置于50 mL燒杯中，于（60±2）℃水浴上加熱，并加入1 mL無(wú)水乙醇助溶，使其全部溶解；另取18 mL水，置于50 mL小燒杯中（60±2）℃水浴加熱，作為水相。待無(wú)水乙醇揮發(fā)完全（無(wú)乙醇味）、油相溶解完全，用20 mL的一次性注射器將水相勻速、緩慢滴入到油相中，并在油相中加入轉(zhuǎn)子使其充分混勻，以120 r/min低速攪拌10 min，在攪拌過(guò)程中溫度始終保持（60±2）℃；混勻后，高壓乳勻機(jī)600 bar壓制60 s，即得。

2.2 形態(tài)觀察、粒徑分布及電位測(cè)定

2.2.1 形態(tài)觀察 采用相關(guān)文獻(xiàn)中收載的方法[5]，取樣品適量，置于1 mL離心管中，加入適量水稀釋20倍，混合均勻。用移液槍精密吸取10 μL稀釋后的樣品準(zhǔn)確滴加在微柵膜銅網(wǎng)上（微柵膜銅網(wǎng)預(yù)先進(jìn)行親水性處理），濾紙吸去多余液體，快速?zèng)_投到已被液氮充分冷卻的液態(tài)乙烷中，液體水形成非晶態(tài)的冰，樣品無(wú)損地包埋在其中；保持微柵膜銅網(wǎng)浸沒(méi)在液氮中，迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的樣品桿中，將樣品桿轉(zhuǎn)移到冷凍樣品傳輸架上，采用冷凍透射電子顯微鏡在10萬(wàn)倍下顯像，加速電壓300 kV，用CCD數(shù)字成像系統(tǒng)記錄脂化乳粒子形態(tài)。甘草次酸脂化乳冷凍電鏡圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，甘草次酸脂化乳輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整，呈類圓形，排列緊密。

圖1 甘草次酸脂化乳冷凍電鏡圖（×100 000）Fig 1 Croy-TEM photograph of glycyrrhetinic acidlipo-emul（×100 000）

2.2.2 粒徑和電位分布情況 取樣品適量，置于50 mL燒杯中，加入適量水，稀釋100倍，混合均勻，取1.5 mL稀釋液裝入粒徑杯中，用Zetasizer Nano ZS90型激光納米粒度儀檢測(cè)粒徑及多分散系數(shù)（PDI）。用5 mL注射器吸取上述稀釋液，注入電位杯，排空氣泡，用Zetasizer Nano ZS90型激光納米粒度儀檢測(cè)電位情況。結(jié)果，甘草次酸的平均粒徑為（245.2±4.29）nm，PDI為（0.054± 0.01），平均電位為（－6.25±0.54）mV。

2.3 載藥量測(cè)定

2.3.1 超高效液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%甲酸水溶液（77∶23，V/V）；流速：0.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：251 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.3.2 溶液的制備 ①對(duì)照品溶液：精密稱取甘草次酸對(duì)照品15.05 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，超聲處理5 min，使其充分溶解，放至室溫，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，棄去前3滴，制得甘草次酸質(zhì)量濃度為602 μg/mL的對(duì)照品溶液。②供試品溶液：精密量取樣品0.1 mL，置于5 mL量瓶中，加1 mL甲醇，超聲處理5 min破乳，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。③陰性對(duì)照溶液：按樣品的處方比例和制備工藝制備缺甘草次酸的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，進(jìn)行稀釋，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖2。由圖2可知，在該色譜條件下，分離度＞1.5；理論板數(shù)以甘草次酸峰計(jì)＞5 000；甘草次酸保留時(shí)間為2.3 min。結(jié)果表明，其他輔料對(duì)甘草次酸主峰的測(cè)定沒(méi)有干擾。

圖2 超高效液相色譜圖Fig 2 UPLC chromatograms

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋制備甘草次酸質(zhì)量濃度分別為36.12、72.24、96.32、150.50、301.00、602.00 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。取上述溶液各適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以甘草次酸質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得甘草次酸的回歸方程為y＝2 201.9x－30 792（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，甘草次酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為36.12～602.00 μg/mL。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，甘草次酸峰面積的RSD＝0.37%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、1、2、3、5、7、9、11、13 h時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甘草次酸峰面積的RSD＝1.25%（n＝9），表明供試品溶液在室溫下放置13 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，甘草次酸峰面積的RSD＝1.19%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8 回收率試驗(yàn) 取陰性對(duì)照品溶液適量，共9份，各置于5 mL量瓶中，分別加入一定質(zhì)量的甘草次酸對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液。取上述溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.4 載藥量的測(cè)定

精密吸取“2.1”項(xiàng)下制備的樣品0.1 mL，置于2 mL離心管中，加1 mL甲醇，超聲處理5 min破乳，再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甘草次酸含量，得到甘草次酸脂化乳中甘草次酸載藥量的平均值為（1.25±0.09）mg/mL。

2.5 穩(wěn)定性考察

按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備一系列質(zhì)量濃度的樣品，恒溫（30℃）下避光放置，分別于放置1、5、10 d時(shí)觀察制劑狀態(tài)，再按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定載藥量，以考察樣品的穩(wěn)定性。甘草次酸脂化乳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，樣品放置1 d時(shí)，各組制劑狀態(tài)穩(wěn)定；放置5 d時(shí)，2.53 mg/mL組（A組）產(chǎn)生少量沉淀，1.25 mg/mL組（B組）和0.82 mg/mL組（C組）無(wú)沉定產(chǎn)生；放置10 d時(shí)，A組產(chǎn)生較多沉淀，B組產(chǎn)生少量沉淀，C組未見(jiàn)沉淀；由載藥量變化情況可見(jiàn)，A組放置5 d載藥量已降至71%，B組雖未見(jiàn)沉淀但載藥量略降低，C組穩(wěn)定性狀況較好。

表2 甘草次酸脂化乳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of stability test of glycyrrhetinic acid

3 討論

在脂化乳質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)考察過(guò)程中，因脂化乳與脂質(zhì)體具有相似結(jié)構(gòu)，筆者曾以脂質(zhì)體考察指標(biāo)中的包封率（大?。﹣?lái)評(píng)價(jià)甘草次酸脂化乳。脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法[4，6-7]較多，常用的方法包括葡聚糖凝膠法[8-11]、透析法[12]、超濾法[13]、離心法[14]和魚(yú)精蛋白法[15]等。經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)，排除了透析法、超濾法、魚(yú)精蛋白法，最終確定嘗試葡聚糖凝膠法和離心法。

葡聚糖凝膠法測(cè)定甘草次酸脂化乳包封率時(shí)，本課題組考察了不同上樣量（0.2、0.5、1 mL），以純水、生理鹽水、0.5%十二烷基硫酸鈉為洗脫溶劑對(duì)脂化乳包封率結(jié)果的影響，最終確定上樣量為0.5 mL、以生理鹽水為洗脫溶劑條件下進(jìn)行洗脫。結(jié)果，以上述最佳條件對(duì)葡聚糖凝膠柱進(jìn)行柱效考察，3次回收率平均值不足80%，表明葡聚糖凝膠柱對(duì)甘草次酸脂化乳存在一定吸附。另筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)以低速離心法對(duì)甘草次酸脂化乳包封率進(jìn)行考察[4，13-14]，以半徑為2 cm，1 000、2 000、3 000、4 000 r/min的轉(zhuǎn)速分別離心5或10 min的條件來(lái)處理本品，通過(guò)測(cè)定離心后上層甘草次酸含藥量與未離心甘草次酸脂化乳制劑含藥量的差值，計(jì)算脂化乳包封率，初步確定最佳離心條件為以半徑為2 cm、2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。以此最佳條件對(duì)離心效率進(jìn)行考察，結(jié)果顯示離心效率為80%，回收率結(jié)果均較低。

這可能是由于油脂的存在，使得脂溶性藥物部分以溶解于油相的狀態(tài)存在，部分包封于脂質(zhì)層中，而不是脂質(zhì)體中而導(dǎo)致包封率過(guò)低。所以，包封率不適合作為脂化乳的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

綜上所述，初步確定粒徑、電位、載藥量、穩(wěn)定性可作為甘草次酸脂化乳的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

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Quality Evaluation and Index Exploration of the Glycyrrhetinic Acid Lipo-emul

JIN Su，LI Shiyuan，ZHANG Xiurong，CHEN Fangning，WANG Xiuli（School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

OBJECTIVE：To provide reference indexs for the quality evaluation of Glycyrrhetinic acid lipo-emul.METHODS：Croy-TEM was used to detect the morphology of Glycyrrhetinic acid lipo-emul，laser nano-particle size analyzer was used to determine the particle size，polydispersity index（PDI）and the zeta potential；UPLC was used to determine the drug loading of its active ingredient glycyrrhetinic acid；placing 10 d in 30℃，then stability was detected.RESULTS：Prepared Glycyrrhetinic acid lipoemul was clear outline，structural integrity，roundlike and arranged closely；the mean particle size was（245.2±4.29）nm，PDI was（0.054±0.01）and the mean zeta potential was（－6.25±0.54）mV；the average drug loading of glycyrrhetinic acid was（1.25± 0.09）mg/mL；the sample with mass concentration of 0.82 mg/mL showed good stability in within 10 d.CONCLUSIONS：Particle size，zeta potential，drug loading and stability can be used as the evaluation index of Glycyrrhetinic acid lipo-emul.

Glycyrrhetinic acid lipo-emul；Quality evaluation；Index；Drug loading

R943

A

1001-0408（2017）06-0800-04

2016-10-16

2016-12-12）

（編輯：劉 柳）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81202928）

＊碩士研究生。研究方向：中藥藥劑學(xué)。電話：010-84738657。E-mail：Jinsu9010@foxmail.com

#通信作者：副研究員，博士。研究方向：中藥復(fù)方新型給藥系統(tǒng)與新型輔料。E-mail：Lnwangxiuli@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.22