miR-210在食管癌患者血清中的水平及臨床意義

劉 盾，王永勇，戴 磊，梁冠標(biāo)，譚 翔，陳銘伍

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科 廣西 南寧 530021）

miR-210在食管癌患者血清中的水平及臨床意義

劉 盾，王永勇，戴 磊，梁冠標(biāo)，譚 翔，陳銘伍?

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科 廣西 南寧 530021）

目的：分析miR-210在食管癌患者血清中的水平 及臨床意義。方法：將某院收治的97例食管癌患者設(shè)為觀察組，將在我院進行健康體檢的50例健康人設(shè)為對照組，為兩組受試者采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法進行血清miRNA-210檢測，然后對比分析兩組受試者血清中miRNA-210的水平及觀察組患者血清中miRNA-210的水平與其性別、年齡、腫瘤的病理類型、TNM分期、組織學(xué)分級及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果：與對照組受試者相比，觀察組患者血清中miRNA-210的水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。觀察組患者血清中miRNA-210的水平與其性別、年齡、腫瘤的病理類型均無明顯的相關(guān)性（P＞0.05），與腫瘤的TNM分期、組織學(xué)分級、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯的關(guān)聯(lián)性（P＜0.05）。與腫瘤TNM分期為Ⅲ期的患者相比，觀察組中腫瘤TNM分期為Ⅳ期的患者其血清中miRNA-210的水平較高（P＜0.05）。與腫瘤TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期的患者相比，觀察組中腫瘤TNM分期為Ⅲ期的患者其血清中miRNA-210的水平較高（P＜0.05）。與腫瘤的組織學(xué)分級為中分化的患者相比，觀察組中腫瘤的組織學(xué)分級為高分化的患者其血清中miRNA-210的水平較高（P＜0.05）。與腫瘤的組織學(xué)分級為低分化的患者相比，觀察組中腫瘤的組織學(xué)分級為中分化的患者其血清中miRNA-210的水平較高（P＜0.05）。結(jié)論：miRNA-210在食管癌患者、正常人血清中的含量存在差異性，且其含量與腫瘤患者病情的嚴(yán)重程度有關(guān)。因此，可考慮將血清miRNA-210作為診斷食管癌的主要指標(biāo)。

食管癌；微小RNA-210；TNM分期；組織學(xué)分級

食管癌是臨床上常見的惡性腫瘤，具有起病隱匿、預(yù)后差等特點。研究發(fā)現(xiàn)，及早確診此病患者的病情并對其進行有針對性的治療可顯著改善其預(yù)后。但是，除進行病理檢查以外，臨床上仍缺乏早期診斷此病的有效方法。微小RNA屬于內(nèi)源性非編碼區(qū)RNA片段，與血管的生成、細(xì)胞的增殖與分化、DNA損傷的修復(fù)等腫瘤行為均有密切的關(guān)系[1,2]。本研究主要分析食管癌患者血清中miRNA-210的水平與其性別、年齡、腫瘤的病理類型、TNM分期、組織學(xué)分級及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究的對象為2012年2月至2016年1月就診于我院的97例食管癌患者及同期在我院進行健康體檢的50例健康人。將97例食管癌患者設(shè)為觀察組，將50例健康人設(shè)為對照組。在觀察組中，有男性56例，有女性41 例，其年齡為（35 ～ 76）歲，平均年齡為（59.62±5.54）歲。在對照組中，有男性29例，女性21例，其年齡為（21～81）歲，平均年齡為（53.26±7.69）歲。兩組受試者均對本次研究知情且自愿參加本次研究。兩組患者的一般資料相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 在觀察組患者入院次日的清晨、對照組受試者體檢的當(dāng)日（空腹10小時以上）采集其肘靜脈血約4ml，放入抗凝管內(nèi)靜置半小時，在進行15分鐘的離心操作（轉(zhuǎn)速為3500轉(zhuǎn)/分鐘）后取上清液保存于零下80℃的環(huán)境中備用。

1.2.2 RNA提取 采用1ml 的Trizol試劑裂解制備的血清標(biāo)本。5分鐘后，在血清標(biāo)本中加入氯仿200μl進行15分鐘的離心操作（環(huán)境溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘），加入異丙醇500μl，在常溫下靜置20分鐘后再次進行15分鐘的離心操作（環(huán)境溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為11000轉(zhuǎn)/分鐘）。棄去血清標(biāo)本的上清液，加入1ml的75%乙醇，用漩渦器震蕩混勻，再次進行15分鐘的離心操作（環(huán)境溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘），然后提取出RNA。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測 將1.5μl的RNA反轉(zhuǎn)錄酶、0.5μl的RNA反應(yīng)抑制酶、3μl的上樣緩沖液、2μl的反應(yīng)引物、20μl缺乏RNA酶的過氧化氫水溶液、2μl的三磷酸核糖（4種）、1μl 的 RNA（250ng/μl）等miRNA-210反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑依次在15℃、45℃、85℃的環(huán)境下進行30分鐘、30分鐘、5分鐘的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在合成cDNA后將其保存于4℃的環(huán)境中。將5μl經(jīng)兩次蒸餾的水、1μl的下游引物、1μl的上游引物、12μl的SYBR熒光混合液、3μl的cDNA稀釋液等聚合酶鏈反應(yīng)試劑分別于90℃、60℃的環(huán)境中進行30秒、30秒的聚合酶鏈反應(yīng)（此過程重復(fù)35次），在72℃的環(huán)境下進行5分鐘的聚合酶鏈反應(yīng)后保存于4℃的環(huán)境中。血清標(biāo)本中miRNA-210基因的相對表達用2﹣ΔΔCt法進行計算。本研究的試劑盒由美國Invitrogen公司生產(chǎn)，在進行相關(guān)的操作時嚴(yán)格遵守其操作說明書。

1.3 觀察指標(biāo) 分析兩組受試者血清中miRNA-210的水平與其性別、年齡、腫瘤的病理類型、TNM分期、組織學(xué)分級及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對本研究中的數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對兩組受試者血清中miRNA-210水平的分析觀察組患者血清中miRNA-210的水平為（57.58±20.34）2﹣ΔΔCt，對照組受試者血清中miRNA-210的水平為（21.06±3.55）2﹣ΔΔCt。與對照組受試者相比，觀察組患者血清中miRNA-210的水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。

2.2 對觀察組患者血清中miRNA-210的水平與其臨床特征關(guān)聯(lián)性的分析 觀察組患者血清中miRNA-210的水平與其性別、年齡、腫瘤的病理類型均無明顯的相關(guān)性（P＞0.05），與腫瘤TNM的分期、組織學(xué)分級、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)性（P＜0.05）。與腫瘤TNM分期為Ⅲ期的患者相比，觀察組中腫瘤TNM分期為Ⅳ期的患者其血清中miRNA-210的水平較高（P＜0.05）。與腫瘤TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期的患者相比，觀察組中腫瘤TNM分期為Ⅲ期的患者其血清中miRNA-210的水平較高（P＜0.05）。與腫瘤的組織學(xué)分級為中分化的患者相比，觀察組中腫瘤的組織學(xué)分級為高分化的患者其血清中miRNA-210的水平較高（P＜0.05）。與腫瘤的組織學(xué)分級為低分化的患者相比，觀察組中腫瘤的組織學(xué)分級為中分化的患者其血清中miRNA-210的水平較高（P＜0.05）。詳情見表1。

3 討論

腫瘤的發(fā)生及演變是一個原因和過程均較復(fù)雜的現(xiàn)象。目前，癌基因的異常表達是進行腫瘤發(fā)病機制研究的熱點之一。miRNA-210是存在于11p15.5短臂的一種抑癌基因，其在人體內(nèi)的水平較為廣泛，其對食管癌產(chǎn)生影響的機制主要包括以下幾種[1-3]：1）miRNA-210可下調(diào)HOXA1、FGFRL1的水平，抑制腫瘤細(xì)胞的黏壁依賴性生長。2）miRNA-210可調(diào)節(jié)E2F3兩個異構(gòu)體的平衡、抑制Myc依賴性轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞生長拮抗因子的水平和HOXA1對P44/42MAP通路的誘導(dǎo)作用，阻滯腫瘤細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)變，使其停滯于G2/M期，進而可抑制腫瘤細(xì)胞的分化。3）miRNA-210可抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1與鐵硫簇支架蛋白的水平，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的鐵代謝，影響腫瘤細(xì)胞的增殖與擴散。此外，李東亮等[4]的研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-210在腎癌細(xì)胞系過度表達后，G2/M期細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞可顯著增多，細(xì)胞內(nèi)的中心體可不同程度地擴增且出現(xiàn)多極紡錘體，E2F3的水平則會降低。

本研究的結(jié)果顯示，miRNA-210在食管癌患者、正常人血清中的含量存在差異性，且其含量與腫瘤患者病情的嚴(yán)重程度有關(guān)。因此，可考慮將血清miRNA-210作為診斷食管癌的主要指標(biāo)。當(dāng)然，本研究采集的樣本較小，而且未對患者的年齡、性別等基線資料對研究結(jié)果的影響進行分析，尚存在一定的局限性。

[1]張建楠.細(xì)胞缺氧調(diào)控關(guān)鍵因子miR-210研究進展[J].中華實用診斷與治療雜志,2014,27(6):524-525.

[2]梅妍妍(綜述),黃東生(審校).微RNA-210研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2016,22(15):2913-2917.

[3]張露,戴瓊艷,趙琳,等.微小RNA-210研究進展[J].國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志,2014,35(11):1050-1053.

[4]李東亮,舒博,唐雙陽,等.腎透明細(xì)胞癌血漿miR-210、miR-378的水平及臨床意義[J].臨床泌尿外科雜志,2015,30(10):897-901.

[5]李成林.miR-210抑制食管Eca109細(xì)胞生長的機制研究[D].河北醫(yī)科大學(xué),2014.

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2095-7629-（2017）5-0072-03

＊通訊作者：陳銘伍，男，漢族，廣西北海人，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。