茶條槭莖段組織培養(yǎng)與植株再生研究

楊蘭芳　張國禹　黃桂云　吳笛　張定軍　李翩翩

摘要 ? ?春季剪取茶條槭當年生枝條的帶頂芽莖尖和帶腋芽莖段以0.1%HgCl2分別消毒4、10 min最好;茶條槭當年生帶芽莖段增殖培養(yǎng)基MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L上培養(yǎng)，增殖效果最好，生長良好，且兼顧了增殖與生根，縮短了培養(yǎng)周期。經(jīng)生根的試管苗移栽于珍珠巖∶園土=1∶3基質(zhì)中，植株生長健壯，成活率達90%。

關(guān)鍵詞 ? ?茶條槭;帶芽莖段;組織培養(yǎng)

中圖分類號 ? ?S792.99 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2019）19-0128-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

茶條槭（Acer ginnala）為槭樹科槭屬落葉樹種，樹形優(yōu)美，葉形清秀，秋葉紅艷，是一種極具開發(fā)價值的園林樹種。此外，其木材可做細木;嫩葉經(jīng)加工可代茶用，還可提取大量的沒食子酸，廣泛應用于醫(yī)藥、化工、食品、輕工、印染、軍工等方面，尤其在醫(yī)藥上對治療肝病有特效。由于茶條槭野生數(shù)量較少，加之掠奪性采收，目前已處于瀕危狀態(tài)。本試驗以帶腋芽莖段為外植體研究不同消毒時間、取材部位對無菌再生體系建立的影響，為解決茶條槭優(yōu)良栽培種快繁、品種改良及遺傳轉(zhuǎn)化工作做好前瞻性的基礎(chǔ)研究，同時為進一步利用基因工程手段改良提供基礎(chǔ)材料。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

以長江珍稀植物研究所種質(zhì)資源圃內(nèi)株高3 m左右、胸徑6 cm左右的茶條槭為研究對象，于4—5月剪取其主干基部或下部當年生萌條作為試驗材料。

培養(yǎng)基均附加3%蔗糖、5 g/L瓊脂以及不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑。使用前，用1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至5.8～6.0，并在122 ℃高溫、高壓條件下滅菌30 min[1]。培養(yǎng)溫度、光照強度、光照時間分別為（24±2）℃、800～1 000 lx、13 h/d。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?外植體消毒時間的篩選。本試驗于4月開展，為研究外植體不同部位及消毒時間對茶條槭污染率的影響，主要分為2個部分：以茶條槭莖尖為外植體，0.1%HgCl2消毒時間分別為3、4、5 min;以茶條槭帶腋芽莖段為外植體，0.1%HgCl2消毒時間分別為8、10、12 min。進行單因素試驗，通過設(shè)計梯度試驗，觀察并比較外植體不同部位、不同消毒時間的污染情況，包括污染率、死亡率及其萌芽率等情況。

試驗方案：首先用軟毛刷蘸取洗液仔細刷洗葉腋及表皮，用自來水沖洗1～2 h。在無菌條件下，將材料放入75%酒精溶液中浸30 s，無菌水沖洗1～2次，再用0.1%HgCl2溶液消毒，消毒后用無菌水沖洗3～5次。最后放于無菌濾紙上吸干水分，將消毒后的外植體接種到啟動培養(yǎng)基上[2-3]。每瓶培養(yǎng)基3個外植體，每處理設(shè)10個重復。試驗2周后統(tǒng)計污染率，4周后統(tǒng)計死亡率、萌發(fā)率。

1.2.2 ? ?試管苗增殖生根培養(yǎng)。腋芽萌發(fā)后，待其長至1～2 cm時，切下轉(zhuǎn)入含有不同濃度的培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，繼代采用MS為基本培養(yǎng)基，以NAA、6-BA和TDZ為3因素進行正交試驗L8（4×24）。每種處理接種10瓶，每瓶接種2個，重復3次。接種后，每周觀察1次小芽的伸長、增殖等情況;40 d后，統(tǒng)計不同生長調(diào)節(jié)劑處理的試管苗增殖系數(shù)（每外植體形成1.0 cm 以上次生小芽的個數(shù)）、生根情況等數(shù)據(jù)。

1.2.3 ? ?試管苗移栽。將生根培養(yǎng)40 d的試管苗移到實驗室內(nèi)有散射光的自然條件下煉苗。1周后，取出生根小植株，洗凈根部瓊脂并剪去基部葉片，移栽于裝有珍珠巖、營養(yǎng)土（二者按1∶3混合）的營養(yǎng)缽中。每盆1株，共移栽30株，每3～4 d澆透水1次。60 d后，統(tǒng)計成活率并記錄其生長情況[4-6]。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?不同消毒時間對不同部位外植體污染的影響

從表1可知，茶條槭莖尖用0.1%HgCl2消毒4 min時，污染率較低（16.7%），成活率最高（70.0%），其萌芽率也相對較高（86.7%）;消毒時間為3 min時，成活率大幅下降（46.7%），污染率最高（43.3%）;消毒時間為5 min時，成活率最低（20.0%），污染率最低（10.0%）?？梢?，用0.1%HgCl2對莖尖消毒時，消毒時間為4～5 min對茶條槭莖尖污染率的影響不大，但褐變死亡率隨消毒時間的延長大幅提升。在對茶條槭帶芽莖段消毒時，使用0.1%HgCl2消毒10 min成活率最高，可達到60.0%，污染率也相對較低，為25.0%，萌芽率也高;消毒8 min時，成活率最低，為23.4%，污染率最高（68.3%）;消毒12 min時，污染率最低。隨著消毒時間延長，褐變死亡率上升，成活率低。因此，在用0.1%HgCl2對茶條槭外植體消毒時，幼嫩莖尖的消毒時間控制在4 min較好，帶芽莖段的消毒時間最好控制在10 min左右，其成活率和萌芽率都相對最高。

2.2 ? ?試管苗增殖生根培養(yǎng)

將腋芽萌發(fā)而來的無菌試管苗接種到不同的增殖培養(yǎng)基中后，其基部先是略有膨大，呈黃綠色，隨后在部分培養(yǎng)基上，幼苗基部形成一定大小的團塊狀愈傷組織，2周左右，開始從基部和腋芽處分化出新芽。

由表2可知，TDZ在1.0 mg/L的水平上較其他水平有極顯著性差異，其芽的平均誘導個數(shù)為32.833個;TDZ含量為0.5 mg/L和2.0 mg/L時，其芽的平均誘導個數(shù)分別為24.500個和19.833個，二者差異不顯著;含量為0.1 mg/L時，芽的平均誘導個數(shù)為2.167個。從6-BA的含量來看，0.1 mg/L芽誘導數(shù)極顯著高于0.5 mg/L;從NAA的含量來看，0.2 mg/L芽誘導數(shù)極顯著高于0.5 mg/L。由此得出，茶條槭誘導增殖的最好理論組合為NAA 0.2 mg/L、6-BA 0.1 mg/L、TDZ 1.0 mg/L。

由表3可知，5號配方對芽的增殖效果極顯著的高于其他組合。從叢生芽的誘導率方面，1、2號配方的增殖效果最差，誘導率僅8.3%、13.3%;其次是8號配方，其誘導率76.7%;3、4、5、6、7號配方，誘導率都是100.0%。芽誘導數(shù)方面，5號配方芽誘導個數(shù)最多，為46個;其次是4號配方，芽誘導個數(shù)為29個;再次是7號配方，芽誘導個數(shù)為24個;然后是3、6號配方，芽誘導個數(shù)均為20個;最后是1、2號配方，芽誘導個數(shù)分別為2、3個。在叢生芽的平均長度方面，5、6號配方芽長均為3.8 cm;然后依次是7號配方>3號配方>8號配方>4號配方>2號配方>1號配方，其芽長分別為2.7、2.6、2.3、1.9、1.8、1.6 cm。不定根的產(chǎn)生方面，本試驗發(fā)現(xiàn)，茶條槭增殖是先產(chǎn)生不定根，有利于芽的增殖。在配方組合中發(fā)現(xiàn)，除1、2號配方不能產(chǎn)生不定根外，其他均能產(chǎn)生不定根。

由上述可知，在培養(yǎng)基MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+TDZ 1.0 mg/L中，叢生芽的增殖效果相對較好，不僅增殖系數(shù)較高，幼芽生長也較快。但是在長期繼代增殖過程中，激素的積累會導致試管苗生長狀態(tài)有一些細微的改變，因而應根據(jù)實際情況靈活調(diào)整激素的濃度。

2.3 ? ?移栽

將生根培養(yǎng)40 d后，達移栽標準的試管苗移到培養(yǎng)室外，在自然光條件下煉苗3～7 d，在移栽前3～5 d打開瓶蓋。移栽后澆透基質(zhì)，放于2號PVC溫室大棚養(yǎng)護管理（圖1）。

從基質(zhì)對移栽成活率的影響考慮，茶條槭是喜排水良好的砂質(zhì)壤土的植物。因此，選擇透氣性較好、所含營養(yǎng)物質(zhì)較多的園土與珍珠巖進行配比，以3∶1的比例混合拌勻作為移栽基質(zhì)。茶條槭喜光，移栽后將其置于散射光豐富區(qū)域。移栽后1～3周，每天噴水1～2次，空氣相對濕度保持在60%以上，但不要超過90%，溫度保持在20 ℃左右。根據(jù)天氣情況加遮蔭網(wǎng)避免強光直射，降低棚溫。移栽后2～3周，植株長出新葉后，適當除去溫棚遮蔭網(wǎng)，使其逐漸適應外界環(huán)境條件。移栽后苗高達到5 cm左右時，適當控制溫棚溫度及光強即可。移栽2個月后，統(tǒng)計成活率為90%，所有幼苗均生長良好。植株在營養(yǎng)缽中生長至高15～20 cm時，移至大田苗圃進行定植，目前仍生長良好，形態(tài)上未見任何變異。

3 ? ?結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，一是以半木質(zhì)化的幼嫩莖段作為外植體材料，具有萌發(fā)快、發(fā)生率高、褐化率低的特點;二是萌發(fā)早與萌發(fā)率高，通常接種1周左右可達到100%的萌發(fā)率;三是在茶條槭組織培養(yǎng)中，莖尖培養(yǎng)萌發(fā)率劣于莖段萌發(fā)率，且莖段中木質(zhì)化程度越低，誘導率越高;四是材料的幼嫩程度決定其褐化程度，木質(zhì)化嚴重的材料褐化也嚴重;五是光照對褐化有影響，在接種培養(yǎng)時，不改變其培養(yǎng)溫度與濕度，適當降低其光照強度，對防止褐變有一定效果。

4 ? ?參考文獻

[1] 董杰，齊鳳慧，詹亞光.茶條槭懸浮培養(yǎng)體系的建立與沒食子酸合成的優(yōu)化條件[J].植物學通報，2008，25（6）：734-740.

[2] 李巖巖.茶條槭（Acer ginnala）組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2007.

[3] 李海燕.茶條槭（Acer ginnala Maxim.）組織培養(yǎng)及愈傷組織中沒食子酸代謝調(diào)控的研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學，2007.

[4] 李海艷，宋繼園，董杰，等.茶條槭愈傷組織的再生體系建立及其沒食子酸含量的測定[J].植物學通報，2008，25（2）：212-219.

[5] 孟月娥，周子發(fā)，李艷敏，等.茶條槭的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].植物生理學通訊，2005，41（6）：790.

[6] 李巖巖.茶條槭組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究[J].山東林業(yè)科技，2010（2）：48-50.