SMG-1基因?qū)θ毖趼殉舶┘?xì)胞SKOV3增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

張展，宋華，杜尚珂，石瑛，朱海

(1鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052；2商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

·基礎(chǔ)研究·

SMG-1基因?qū)θ毖趼殉舶┘?xì)胞SKOV3增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

張展1,2，宋華1，杜尚珂1，石瑛1，朱海1

(1鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052；2商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

目的 觀察缺氧狀態(tài)下卵巢癌SKOV3細(xì)胞中生殖器形成抑制基因1(SMG-1)的表達(dá)變化，及沉默SMG-1對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其機(jī)制。方法 培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，分為常氧組和缺氧組，其中缺氧組以終濃度150 μmol/L的二氯化鈷進(jìn)行缺氧處理；48 h后分別采用qRT-PCR法和Western blotting法檢測(cè)SMG-1 mRNA、蛋白。取缺氧處理的SKOV3細(xì)胞分為A、B、C、D組，A組為空白對(duì)照，B組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照，C組僅加入轉(zhuǎn)染試劑，D組轉(zhuǎn)染SMG-1 siRNA。四組分別于轉(zhuǎn)染48 h后測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率，采用qRT-PCR法檢測(cè)STAT3 mRNA，采用Western blotting法檢測(cè)STAT3、p-STAT3蛋白。結(jié)果 與常氧組相比，缺氧組SMG-1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P均<0.05)。以A組為參照(0)，D組細(xì)胞增殖抑制率升高，與B、C組相比，P均<0.05。與其余3組相比，D組細(xì)胞凋亡率升高，STAT3 mRNA及蛋白、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)。結(jié)論 缺氧狀態(tài)下卵巢癌SKOV3細(xì)胞中SMG-1表達(dá)上調(diào)；沉默SMG-1表達(dá)后SKOV3細(xì)胞增殖受到抑制、凋亡增多；SMG-1影響卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的機(jī)制可能與改變STAT3的表達(dá)有關(guān)。

卵巢癌；生殖器形成抑制基因1；缺氧；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；轉(zhuǎn)錄激活因子3

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，早期診斷非常困難，病死率高，發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究[1]發(fā)現(xiàn)，作為一種實(shí)體腫瘤，卵巢癌組織內(nèi)存在缺氧微環(huán)境，缺氧在卵巢癌進(jìn)展過程中扮演至關(guān)重要的角色，可影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移等生物學(xué)行為。生殖器形成抑制基因1(SMG-1)是磷脂酰肌醇-3-激酶相關(guān)激酶(PIKKs)家族成員之一，參與無義介導(dǎo)的mRNA降解(NMD)途徑[2,3]。此外，SMG-1還參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、缺氧及凋亡等多個(gè)生物進(jìn)程，甚至可抑制腫瘤的進(jìn)展[4～7]。本研究觀察了缺氧狀態(tài)下卵巢癌SKOV3細(xì)胞中SMG-1基因、蛋白的表達(dá)變化，及沉默SMG-1對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行初步探索，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞為本課題組保存；RPMI1640培養(yǎng)基購于HyClone生物制品公司；血清購于杭州四季青公司；SMG-1 siRNA購于廣東銳博生物公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；SMG-1(V72)抗體購于美國Cell Signaling公司；STAT3、p-STAT3抗體購于美國Abcam公司；qRT-PCR相關(guān)試劑購于日本TOYOBO公司；Annexin V/PI試劑盒購于美國BD公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧處理 SKOV3細(xì)胞在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)。待細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)經(jīng)0.25%胰酶消化后以1.0×105/孔接種于6孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)滿50%～60%時(shí)開始缺氧處理。將細(xì)胞分為常氧組和缺氧組。缺氧組加入終濃度150 μmol/L的二氯化鈷，常氧組常規(guī)培養(yǎng)。48 h后分別采用qRT-PCR法和Western blotting法檢測(cè)SMG-1 mRNA、蛋白。

1.3 細(xì)胞分組及SMG-1沉默方法 取缺氧處理的SKOV3細(xì)胞(參照“1.2”處理方法)，缺氧24 h后分為A、B、C、D組。A組為空白對(duì)照，不加siRNA和Lipofectamine2000；B組加入空載siRNA(陰性對(duì)照)和Lipofectamine2000；C組僅加入Lipofectamine2000；D組加入SMG-1 siRNA和Lipofectamine2000。轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及150 μmol/L的二氯化鈷)，恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后分別經(jīng)qRT-PCR法和Western blotting法驗(yàn)證SMG-1 siRNA的沉默效果，D組SMG-1表達(dá)量明顯低于A、B、C組(P均<0.05)且D組與A組相比SMG-1表達(dá)抑制率>50%。

1.4 細(xì)胞增殖觀察 各組轉(zhuǎn)染48 h后更換新鮮培養(yǎng)基，再加入CCK-8試劑；此外另設(shè)一組不含細(xì)胞只有新鮮培養(yǎng)基和CCK-8的空白組(CCK-8試劑與培養(yǎng)基比例均為1∶10)；37 ℃避光孵育2 h后在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各組吸光度(A)值。以(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/(A對(duì)照組-A空白組)計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。

1.5 凋亡細(xì)胞檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后用胰酶(不含EDTA)消化收集各組細(xì)胞，用冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后加入500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞，然后依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 缺氧SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3) mRNA及蛋白檢測(cè) TRIzol法分別提取A、B、C、D組細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑的操作說明進(jìn)行操作，檢測(cè)各組細(xì)胞中的STAT3 mRNA。STAT3基因上游引物序列為5′-AGGATAGAGATAGACCAGTGGAGAC-3′，下游引物序列為5′-TCAGTGAAAGCAAAGAAGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度197 bp；內(nèi)參基因β-actin上游引物序列為5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物序列為5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度185 bp。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。RIPA法分別提取A、B、C、D組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，每組蛋白上樣量40 μg。采用120 V恒壓進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(稀釋比例1∶1 000)4 ℃過夜，TBS洗滌后孵育二抗(稀釋比例1∶5 000)，TBST洗滌后通過ODYSSEY Clx檢測(cè)與成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 缺氧組與常氧組SMG-1 mRNA、蛋白表達(dá)比較 缺氧組SMG-1 mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為4.19±0.94、0.58±0.11，常氧組分別為1.12±0.17、0.26±0.06。與常氧組相比，缺氧組SMG-1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P均<0.05)。

2.2 A、B、C、D組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率比較 以A組為參照(0)，D組細(xì)胞增殖抑制率高于B、C組(P均<0.05)。D組細(xì)胞凋亡率高于其余3組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 四組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率比較±s)

注：與B、C組比較，*P<0.05；與A、B、C組比較，△P<0.05。

2.3 A、B、C、D組細(xì)胞中STAT3 mRNA及蛋白表達(dá)比較 與其余三組相比，D組STAT3 mRNA及蛋白、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)。詳見表2。

表2 四組細(xì)胞中STAT3 mRNA及蛋白、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與A、B、C組比較，*P<0.05。

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)體腫瘤內(nèi)部細(xì)胞往往處于不同程度的缺氧狀態(tài)，缺氧微環(huán)境與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，卵巢癌也是如此。SMG-1作為一種新型的腫瘤相關(guān)因子引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。研究[6]顯示，缺氧條件下SMG-1可被激活且對(duì)HIF-1α有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。本研究采用二氯化鈷對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理，發(fā)現(xiàn)缺氧狀態(tài)下SKOV3細(xì)胞中SMG-1表達(dá)水平升高，提示缺氧可誘導(dǎo)SMG-1表達(dá)，與相關(guān)研究結(jié)果一致，而缺氧誘導(dǎo)SMG-1表達(dá)的相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)SMG-1與多種細(xì)胞系的凋亡有關(guān)，如沉默SMG-1后人骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡明顯增多[8]，SMG-1可通過保持秀麗隱桿線蟲體內(nèi)細(xì)胞端粒完整性從而抵抗細(xì)胞凋亡[2]，抑制SMG-1表達(dá)可促使人絨毛膜癌JAR細(xì)胞系發(fā)生凋亡[9]，在頭頸部鱗癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌等的相關(guān)研究也得出了類似結(jié)論[10～15]。綜合已有的研究結(jié)果可看出，SMG-1的功能在不同種屬間及不同細(xì)胞間可能具有多元性和復(fù)雜性。為研究缺氧狀態(tài)下SMG-1對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)si-RNA沉默SMG-1表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)SKOV3細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率增高，推測(cè)在缺氧微環(huán)境下SMG-1可能有抑制卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用，而沉默SMG-1可促進(jìn)缺氧的SKOV3細(xì)胞凋亡。

已有研究[5,15]證實(shí)，SMG-1可通過抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路來抑制細(xì)胞凋亡。有學(xué)者[11,16]發(fā)現(xiàn)，SMG-1能通過抑制mTOR通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，其中mTOR可通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步探究SMG-1對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制，本研究檢測(cè)了SKOV3細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子STAT3基因及蛋白。STAT家族包括7個(gè)成員(STAT1～STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6)，其中對(duì)STAT3的研究較為深入。STAT3在不同因子刺激下可發(fā)生絲氨酸(Ser727)或酪氨酸(Tyr705)殘基位點(diǎn)的磷酸化，形成p-STAT3，進(jìn)而形成二聚體轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮一系列精密的調(diào)控作用。STAT3在包括卵巢癌在內(nèi)的很多人類腫瘤中可被持續(xù)性激活且具有抗凋亡活性[17,18]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，阻斷JAK2/STAT3可通過線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在卵巢癌細(xì)胞系中，沉默STAT3可使細(xì)胞增殖受抑制、凋亡增加[20]。本研究結(jié)果顯示，沉默SMG-1的SKOV3細(xì)胞中STAT3 mRNA、STAT3蛋白、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，表明SMG-1在參與細(xì)胞凋亡過程中還可對(duì)其他凋亡相關(guān)因子表達(dá)產(chǎn)生影響，推測(cè)SMG-1對(duì)細(xì)胞凋亡的作用可能與改變STAT3的表達(dá)有關(guān)，但這需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜合本次研究結(jié)果，我們認(rèn)為，缺氧可誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞中SMG-1表達(dá)上調(diào)，而沉默SMG-1表達(dá)后SKOV3細(xì)胞增殖受抑制、凋亡增多，推測(cè)SMG-1對(duì)卵巢癌細(xì)胞的促凋亡作用機(jī)制可能與影響STAT3表達(dá)有關(guān)。

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張展(E-mail： zhangzhanzdsfy@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.008

R392.12

A

1002-266X(2017)03-0029-03

2016-09-25)