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    低氧環(huán)境對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

    2016-11-09 02:27:12張沖徐敏毛成剛錫洪敏聶娜娜高宏李自普
    關(guān)鍵詞:常氧組充質(zhì)臍帶

    張沖,徐敏,毛成剛,錫洪敏,聶娜娜,高宏,李自普

    低氧環(huán)境對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

    張沖,徐敏,毛成剛,錫洪敏,聶娜娜,高宏,李自普

    目的 觀察低氧環(huán)境對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)、干細(xì)胞因子(SCF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)表達(dá)的影響。

    方法 將第 3 代 hUCMSCs 分別置于 20% O2(常氧組)和 5% O2(低氧組)環(huán)境中培養(yǎng),于 8、24、32、48、56、72 h ELISA 法檢測(cè)培養(yǎng)前及培養(yǎng)后上清液中 HGF、IGF-1、SDF-1、VEGF、bFGF、SCF、G-CSF 的濃度。

    結(jié)果 低氧組培養(yǎng)上清液中 HGF、SDF-1、SCF、G-CSF 的濃度于培養(yǎng)后 72 h 明顯高于常氧組(P < 0.05);VEGF 的濃度于培養(yǎng)后 56 h 明顯高于常氧組(P < 0.05);bFGF 濃度于培養(yǎng)后 32 h 明顯高于常氧組(P < 0.05);IGF-1 濃度在培養(yǎng)后較常氧組無(wú)明顯變化(P > 0.05)。

    結(jié)論 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)后可持續(xù)表達(dá)細(xì)胞因子VEGF、HGF、IGF、bFGF、SCF、SDF-1 和 G-CSF,且 5%低氧培養(yǎng)環(huán)境可促進(jìn) VEGF、HGF、bFGF、SCF、SDF-1 和G-CSF 的表達(dá),但對(duì) IGF-1 表達(dá)無(wú)影響。

    間質(zhì)干細(xì)胞; 細(xì)胞低氧; 干細(xì)胞因子

    www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(5):437-440

    人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)存在于臍帶沃頓膠和血管周圍組織,較其他間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有更強(qiáng)的增殖分化能力、HLA-I 表達(dá)和神經(jīng)誘導(dǎo)分化能力,且免疫功能低,無(wú)異體排斥反應(yīng)。同時(shí)還具有來(lái)源廣泛,取材方便,便于保存及運(yùn)輸,對(duì)供體無(wú)影響、無(wú)倫理爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn),因此具有更為廣闊的應(yīng)用前景。MSCs 可分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質(zhì)衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)等多種細(xì)胞因子,參與細(xì)胞遷移募集,促進(jìn)血管生成,改善臟器功能。然而,目前大多體外細(xì)胞培養(yǎng)在常氧環(huán)境下進(jìn)行,與體內(nèi)生理或病理狀態(tài)下的低氧狀態(tài)相差甚遠(yuǎn)。本研究通過(guò)觀察常氧和低氧環(huán)境下hUCMSCs 多種細(xì)胞因子分泌的變化,旨在探討低氧環(huán)境對(duì) hUCMSCs 細(xì)胞因子分泌能力的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院干細(xì)胞中心提供,產(chǎn)婦及家屬同意用于科學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)用間充質(zhì)干細(xì)胞均經(jīng)過(guò)微生物檢測(cè)及流式細(xì)胞儀檢測(cè),細(xì)胞表型符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征:CD34(-),CD45(-),CD90(+),CD105(+),HLA-DR(-)。微生物檢測(cè):支原體檢測(cè)陰性,乙型肝炎病毒陰性,丙型肝炎病毒陰性,梅毒螺旋體陰性,巨細(xì)胞病毒陰性,HIV 陰性,需氧菌培養(yǎng)陰性,真菌培養(yǎng)陰性。

    1.2 方法

    將第 3 代的 hUCMSCs 按照 1 × 104個(gè)/cm2接種 6 孔培養(yǎng)板,每孔加入培養(yǎng)基 2 ml(DMEM培養(yǎng)基 + 10% FBS),并將其分為 2 組,正常氧濃度組(20% O2、5% CO2、75% N2,簡(jiǎn)稱常氧組);低氧濃度組(5% O2、5% CO2、90% N2,簡(jiǎn)稱低氧組)。將常氧組各培養(yǎng)板放入 20% O2濃度的培養(yǎng)箱中,低氧組各培養(yǎng)板放入 5% O2濃度的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于培養(yǎng)后第 8、24、32、48、56、72 小時(shí)取相應(yīng)培養(yǎng)孔的上清液,離心。應(yīng)用 ELISA法檢測(cè)上清液中各細(xì)胞因子的濃度。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    兩組 hUCMSCs 在不同培養(yǎng)時(shí)間 VEGF、SDF-1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)的表達(dá)水平見(jiàn)表 l。與常氧組比較,低氧組中 HGF、G-CSF 濃度于 72 h 開(kāi)始明顯高于常氧組,VEGF濃度于 56 h 開(kāi)始明顯高于常氧組,bFGF 濃度于32 h 開(kāi)始明顯高于常氧組,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。SDF-1 濃度于培養(yǎng)開(kāi)始 8 h 較常氧組明顯減低(P < 0.05),后隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高,并于 72 h 明顯高于常氧組(P < 0.05)。SCF 濃度于 8、24、32 h 明顯低于常氧組(P 均 < 0.01),后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高,并于 72 h 明顯高于常氧組(P < 0.05)。IGF-1 濃度則較常氧組無(wú)明顯變化(P > 0.05)。

    3 討論

    目前,基于間充質(zhì)干細(xì)胞的替代治療及組織工程等方面已經(jīng)做了大量實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)。間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌作用越來(lái)越受到研究者的重視。Ye 等[1]報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子及調(diào)節(jié)肽等,至少包括 34 種蛋白質(zhì)。大量研究證實(shí)這些因子參與細(xì)胞的存活凋亡、營(yíng)養(yǎng)代謝、增殖分化、遷移歸巢,有利于促進(jìn)血管的生成、組織修復(fù)、改善心臟功能[2-6]。Tang 等[7]將 MSCs 注入大鼠心肌梗死邊緣區(qū),2 周后發(fā)現(xiàn) VEGF、bFGF、SDF-1 表達(dá)明顯升高,且提高了左室收縮功能,而B(niǎo)ax 表達(dá)明顯下降。從而提示 MSCs 可以通過(guò)旁分泌作用抑制心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)血管生成,改善心功能。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn) MSCs 的旁分泌與受損部位的低氧環(huán)境密切相關(guān)。

    機(jī)體正常和受損組織均處于低氧環(huán)境,MSCs移植后也處于低氧微環(huán)境中,因此研究低氧條件對(duì)MSCs 旁分泌作用的影響具有重要意義。國(guó)內(nèi)外學(xué)者均已提出低氧可以作為誘導(dǎo)因素,刺激 MSCs的分泌,如 VEGF、HGF、SDF-1 等,但也有少數(shù)研究者得出不同結(jié)論。Wairiuko 等[8]提出體外低氧應(yīng)激情況下,能激活 MSCs 的分泌活性,顯著促進(jìn) VEGF 和 bFGF 的釋放。Rosova 等[9]對(duì) MSCs進(jìn)行低氧預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中 HGF 釋放明顯增加。Liu 等[10]于體外 3% O2濃度下培養(yǎng)BMSCs,發(fā)現(xiàn) 24、36、48 h 其分泌的 SDF-1 及其表面受體 CXCR4 均較常氧環(huán)境明顯升高,但Jing 等[11]的研究結(jié)果則與其相反。L?nne 等[12]于2.5% 的 O2環(huán)境下培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 3 d,結(jié)果發(fā)現(xiàn) VEGF、IGF、SCF 明顯增加,但 bFGF 較對(duì)照組無(wú)明顯變化。本實(shí)驗(yàn)將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分別置于 20% O2、5% O2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng),于 8、24、32、48、56、72 h 動(dòng)態(tài)檢測(cè)培養(yǎng)基上清液中各生長(zhǎng)因子的濃度,發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可持續(xù)表達(dá) HGF、SDF-1、SCF、G-CSF、VEGF、bFGF、IGF-1 多種細(xì)胞因子。低氧組 HGF、SDF-1、SCF、G-CSF、VEGF、bFGF 濃度隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸升高,并明顯高于常氧組,提示低氧促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 VEGF、bFGF、HGF、SDF-1、SCF、G-CSF 的分泌。但 IGF 濃度則無(wú)明顯變化,考慮此結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道有所差異,原因可能為:① IGF-1 對(duì)低氧環(huán)境的敏感性低,此次低氧預(yù)處理的氧濃度未能達(dá)到其有效刺激濃度。②培養(yǎng)時(shí)間較短,培養(yǎng)液中游離的 IGF-1 太少,仍需進(jìn)一步研究。此外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下,細(xì)胞培養(yǎng)早期 VEGF、HGF、SDF-1、SCF、G-CSF 濃度較常氧環(huán)境低,后隨時(shí)間推移逐漸升高,并分別于不同時(shí)間點(diǎn)高于常氧組,提示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)低氧刺激需要一定的適應(yīng)及反應(yīng)時(shí)間。

    表 1 低氧組和常氧組 hUCMSCs 細(xì)胞因子的表達(dá)()Table 1 The concentrations between hypoxia group and normoxia group ()

    表 1 低氧組和常氧組 hUCMSCs 細(xì)胞因子的表達(dá)()Table 1 The concentrations between hypoxia group and normoxia group ()

    注:與常氧組相比,aP < 0.05,bP < 0.01。Note: Compared with normoxia group,aP < 0.05,bP < 0.01.

    時(shí)間(h) Time (h)8 24 32 48 56 72 VEGF(pg/ml)常氧組 Normoxia group 970.2 ± 114.2 953.8 ± 191.2 884.0 ± 135.2 884.2 ± 150.0 865.2 ± 67.2 836.4 ± 86.8低氧組 Hypoxia group 914.8 ± 142.0 919.4 ± 86.8 957.4 ± 59.9 972.8 ± 48.7 1007.4 ± 86.4a1079.5 ± 87.0bHGF(ng/L)常氧組 Normoxia group 1400.5 ± 125.6 1398.4 ± 95.4 1320.0 ± 140.6 1302.2 ± 180.6 1299.8 ± 107.5 1216.9 ± 62.0低氧組 Hypoxia group 1276.5 ± 162.0 1298.7 ± 126.8 1302.0 ± 76.6 1342.5 ± 88.0 1365.8 ± 95.2 1383.9 ± 87.0aSDF-1(ng/L)常氧組 Normoxia group 1301.5 ± 139.0 1162.4 ± 150.4 1246.6 ± 89.8 1230.8 ± 140.5 1227.5 ± 176.9 1142.8 ± 96.6低氧組 Hypoxia group 1078.0 ± 191.0a1001.4 ± 186.8 1111.0 ± 158.0 1091.4 ± 207.0 1147.2 ± 323.4 1309.0 ± 148.4abFGF(pg/ml)常氧組 Normoxia group 80.2 ± 15.0 76.2 ± 20.0 67.0 ± 14.3 65.2 ± 16.0 64.7 ± 16.0 64.7 ± 16.4低氧組 Hypoxia group 86.0 ± 15.6 83.5 ± 17.1 84.4 ± 4.6a87.7 ± 10.2a88.9 ± 10.6b90.0 ± 11.6bIGF-1(μg/L)常氧組 Normoxia group 51.0 ± 4.4 48.6 ± 7.7 49.3 ± 7.1 48.1 ± 8.2 47.2 ± 8.4 45.4 ± 6.8低氧組 Hypoxia group 50.6 ± 4.0 48.0 ± 6.3 49.8 ± 6.6 51.9 ± 6.2 48.6 ± 8.8 49.5 ± 10.1 SCF(ng/L)常氧組 Normoxia group 581.4 ± 55.6 525.6 ± 50.2 512.0 ± 42.7 504.8 ± 64.2 502.4 ± 57.3 459.8 ± 39.4低氧組 Hypoxia group 465.6 ± 44.7b420.6 ± 48.8b424.5 ± 12.0b425.6 ± 44.8a460.4 ± 38.0 505.4 ± 35.9aG-CSF(ng/L)常氧組 Normoxia group 363.5 ± 64.6 330.6 ± 106.2 381.1 ± 61.7 393.8 ± 149.0 341.2 ± 72.2 318.2 ± 71.5低氧組 Hypoxia group 288.6 ± 77.3 334.2 ± 102.5 346.2 ± 26.6 387.2 ± 127.7 402.4 ± 36.7 472.0 ± 50.0a

    如上所述,低氧可以通過(guò)改變 MSCs 的細(xì)胞因子表達(dá),影響其旁分泌作用,但具體機(jī)制仍不明確。Martin-Rendon 等[13]將 MSCs 在體外經(jīng)低氧處理 24 h 后,發(fā)現(xiàn)約有 231 種 mRNA 受到缺氧的調(diào)節(jié)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)主要與低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、NF-κB 等有關(guān)。郭輝等[14]分別在 21%和 3% O2環(huán)境中培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 24 h,發(fā)現(xiàn)低氧組 HIF-1α 蛋白表達(dá)明顯增高。HIF-1α 是細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,也是影響 MSCs 旁分泌作用的主要原因。HIF-1α 調(diào)控的靶基因有 60 多個(gè)[15]。VEGF 及 SDF-1 是已經(jīng)證實(shí)的 HIF-1α 的兩大重要靶基因[16-19]。低氧增加間充質(zhì)干細(xì)胞 HIF-1α 的活性,促使 HIF-1α 與VEGF、SDF-1 編碼基因的低氧反應(yīng)元件結(jié)合,增加 VEGF、SDF-1 的分泌。HIF-1α 還可以誘導(dǎo)IGF-1、HGF 等多種細(xì)胞因子的表達(dá)。NF-κB 是一種存在于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子。近期的研究數(shù)據(jù)表明 NF-κB 在誘導(dǎo)因素的作用下可以促進(jìn) VEGF、bFGF 等細(xì)胞因子的分泌。Crisostomo 等[20]將人間充質(zhì)干細(xì)胞置于含 NF-κB 抑制劑的培養(yǎng)基,并于1% O2環(huán)境中培養(yǎng),24 h 后檢測(cè)培養(yǎng)液中 VEGF、bFGF、HGF 及 IGF 的濃度,發(fā)現(xiàn)低氧 +NF-κB 抑制劑組中各細(xì)胞因子的濃度較對(duì)照組明顯減低。此外細(xì)胞因子之間的相互作用也影響 MSCs 的分泌。SDF-1 與 CXCR4+ 間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合,可促進(jìn) VEGF、bFGF、HGF、IGF-1 等的分泌[10,21]。bFGF、G-CSF 可以促進(jìn) HGF 的表達(dá)[22]。上述因子通過(guò)相互作用,可以形成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),影響細(xì)胞的旁分泌作用。

    綜上所述,間充質(zhì)干細(xì)胞可持續(xù)分泌一些細(xì)胞因子,適度低氧刺激有利于間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌,但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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    Objective To observe the effects of low oxygen on the expression of VEGF, HGF, bFGF, SDF-1, SCF, IGF, G-CSF in human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs).

    Methods The third generation of hUCMSCs was divided into hypoxia group and normoxia group cultured in 5% oxygen and 20% oxygen, respectively. The concentration of HGF, IGF-1, SDF-1, VEGF, bFGF, SCF and G-CSF was detected by ELISA after culturing 8, 24, 32, 48, 56 and 72 h, respectively.

    Results The concentration of HGF, SDF-1, SCF and G-CSF in hypoxia group was significantly higher than that of normoxia group after 72 h culture (P < 0.05); The concentration of VEGF and bFGF in hypoxia group was significantly higher than that of normoxia group after 56 h and 32 h culture, respectively (P < 0.05). However, the concentration of IGF-1 in hypoxia group had no significant change as compared to that of normoxia group (P > 0.05).

    Conclusions The continuous expression of cytokines in hUCMSCs, such as HGF, IGF-1, SDF-1, VEGF, bFGF, SCF and G-CSF,could be found, and the expression level of the above cytokines except IGF-1 is increased by 5% oxygen.

    Author Affiliation: Department of Cardiorenal Pediatrics (ZHANG Chong, XU Min, MAO Cheng-gang, NIE Na-na, LI Zi-pu),Neonatal Department (XI Hong-min), Stem Cell Center (GAO Hong), Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003,China

    www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):437-440

    Effects of low oxygen on the expression of related cytokines in human umbilical cord mesenchymal stem cells

    ZHANG Chong, XU Min, MAO Cheng-gang, XI Hong-min, NIE Na-na, GAO-Hong, LI Zi-pu

    Mesenchymal stem cells; Cells hypoxia; Stem cell factor

    LI Zi-pu, Email: 13370871121@163.com

    10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.009

    266003 青島大學(xué)附屬醫(yī)院心腎免疫兒科(張沖、徐敏、毛成剛、聶娜娜、李自普),新生兒科(錫洪敏),干細(xì)胞中心(高宏)

    李自普,Email:13370871121@163.com

    2016-05-25

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