低氧誘導大鼠垂體腺瘤GH3細胞增殖、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究

張歡，石文健，劉永亮，李景武，張于，董桂蘭，董偉

垂體腺瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤之一，占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的14%，約35%的垂體腺瘤呈侵襲性生長［1］，與非侵襲性垂體腺瘤相比，侵襲性垂體腺瘤不僅手術(shù)全切率低，而且術(shù)后復發(fā)率高。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的生物學過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、遠處轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移定植、癌癥干性和化學抗性有關(guān)［2-3］。缺氧是組織中氧分壓低的一種情況，已成為腫瘤病理生理學的一個關(guān)鍵因素。低氧會在多種腫瘤中誘導EMT［4-6］，但在垂體腺瘤中尚不清楚。低氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIF）是一類介導細胞適應低氧應激反應的調(diào)控因子，是細胞適應缺氧的主要驅(qū)動力。研究顯示，HIF-1α與垂體腺瘤的侵襲性行為有關(guān)［7］。在生長激素腺瘤中，HIF-1α可通過促進蛋白激酶A活性增加而導致生長激素過度合成［8］。本研究旨在分析低氧誘導大鼠垂體腺瘤GH3細胞增殖、侵襲和EMT的機制，以期為垂體腺瘤的臨床診療提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2020年9月至2021年6月。

1.2 主要儀器與試劑 HIF-1α干擾片段（HIF-1αsiRNA）購自北京傲銳東源生物科技有限公司，GH3細胞購自美國ATCC公司，［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），內(nèi)鹽；MTS］購自北京澤平科技有限責任公司，RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量試劑盒購自美國Thermo公司，HIF-1α、N-鈣黏蛋白（N-cadherin，N-Cad）、波形蛋白（Vimentin，Vim）、GAPDH一抗購自英國Abcam公司，小室實驗用Transwell板購自美國Corning公司。

1.3 細胞分組 將GH3細胞分為常氧組（不轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA，氧濃度為19.5%）、低氧組（不轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA，氧濃度為2.5%）、常氧+siRNA組（轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA，氧濃度為19.5%）、低氧+siRNA組（轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA，氧濃度為2.5%）。將GH3細胞置于2.5%胎牛血清+15%馬血清中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的GH3細胞先接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至融合度為80%，更換新鮮培養(yǎng)液；將3 μg HIF-1α-siRNA稀釋于5 μl Lipofectamine 3000TM中，加入含5 μl P3000TM的減血清培養(yǎng)基，補充總體系至250 μl，混勻后室溫孵育5 min；將DNA-脂質(zhì)體復合物加入6孔板中，分別將細胞置于不同氧濃度（常氧：19.5% O2；低氧：2.5% O2）的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細胞增殖能力檢測 取各組對數(shù)生長期的GH3細胞置于96孔板中，每孔種1×104個細胞，待細胞貼壁后，瞬時干擾HIF-1α表達，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后分別加入20 μl［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），內(nèi)鹽；MTS］，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測490 nm波長處吸光度值，即細胞增殖能力。實驗獨立重復3次。

1.5 細胞侵襲能力檢測 取各組對數(shù)生長期的GH3細胞，干擾HIF-1α表達24 h后，吸棄培養(yǎng)基，采用4 ℃磷酸鹽緩沖液洗2次，胰酶消化后，4 ℃下1 000 r/min離心5 min（離心半徑60 mm），收集各組細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，在Transwell板小室內(nèi)種200 μl細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出，采用4%甲醛固定，擦去小室內(nèi)的細胞，蘇木素染色后隨機取5個高倍視野（×400），計算細胞數(shù)目，取均值，即細胞侵襲能力。實驗獨立重復3次。

1.6 GH3細胞中 HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平檢測 取各組對數(shù)生長期的GH3細胞，胰酶消化后利用一步法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR。PCR擴增條件為：50 ℃ 20 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共 40個循環(huán)。HIF-1α的正向引物為5'-TGCTCATCAGTTGCCACTTC-3'，反向引物為5'-CCATCCAGGGCTTTCAGATA-3'；N-Cad的正向引物為5'-ACGGGCAGATCACCACTATC-3'，反向引物為5'-TTTCACAAGTCTCGGCCTCT-3'；Vim的正向引物為5'-CCCAGATTCAGGAACAGCAT-3'，反向引物為5'-CACCTGTCTCCGGTATTCGT-3'；內(nèi)參基因GAPDH的正向引物為5'-AACGACCCCTTCATTGACCT-3'，反向引物為5'-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3'。采用 2-ΔΔCt法計算 GH3細胞中 HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平。實驗獨立重復3次。

1.7 GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平檢測 取各組對數(shù)生長期的GH3細胞，4 ℃下1 000 r/min離心5 min（離心半徑60 mm），收集各組細胞，采用磷酸鹽緩沖液洗3次，加入非變性裂解液，冰上孵育2 h，4 ℃下12 000 r/min離心15 min（離心半徑60 mm），取上清液，采用BCA法檢測樣品總蛋白濃度。電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，采用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入HIF-1α一抗（1∶2 000）、E-Cad一抗（1∶1 000）、Vim一抗（1∶2 000）、GAPDH一抗（1∶10 000），4 ℃下過夜。采用TBST洗膜3次，加入相應的二抗孵育1 h，采用等滲Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液洗膜3次。加入ECL化學發(fā)光液，分析條帶灰度值，即HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平。實驗獨立重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。服從正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力比較 常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組干擾后24、48、72 h細胞增殖能力比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低氧組干擾后24、48、72 h細胞增殖能力高于常氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；常氧+siRNA組干擾后72 h細胞增殖能力低于常氧組，干擾后24、48、72 h細胞增殖能力低于低氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低氧+siRNA組干擾后24 h細胞增殖能力高于常氧組，干擾后24、48、72 h細胞增殖能力低于低氧組、高于常氧+siRNA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組干擾后48、72 h細胞增殖能力分別高于本組干擾后24 h，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組干擾后72 h細胞增殖能力分別高于本組干擾后48 h，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組細胞增殖能力比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of cell proliferation in each group

表1 各組細胞增殖能力比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of cell proliferation in each group

注：a表示與常氧組比較，P＜0.05；b表示與低氧組比較，P＜0.05；c表示與常氧+siRNA組比較，P＜0.05；d表示與本組干擾后24 h比較，P＜0.05；e表示與本組干擾后48 h比較，P＜0.05

組別 干擾后24 h 干擾后48 h 干擾后72 h常氧組 0.42±0.01 0.57±0.03d 0.82±0.02de低氧組 0.59±0.02a 0.89±0.03ad 1.54±0.07ade常氧+siRNA組 0.38±0.01b 0.47±0.03bd 0.60±0.06abde低氧+siRNA組 0.48±0.02abc 0.61±0.02bcd 0.91±0.04bcde F值 37.71 41.26 68.56 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 各組細胞侵襲能力比較 常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組細胞侵襲能力分別為（301.3±6.4）%、（477.3±20.2）%、（188.7±19.4）%、（321.0±17.9）%。常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組細胞侵襲能力比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=49.30，P＜0.001）。低氧組細胞侵襲能力高于常氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；常氧+siRNA組細胞侵襲能力低于常氧組、低氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低氧+siRNA組細胞侵襲能力低于低氧組，高于常氧+siRNA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 各組GH3細胞中 HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平比較 常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組 GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低氧組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平高于常氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；常氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α、Vim mRNA表達水平低于常氧組，HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平低于低氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平低于低氧組，HIF-1α、Vim mRNA表達水平高于常氧+siRNA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of HIF-1α，N-Cad and Vim mRNA expression levels in GH3 cells of each group

表2 各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of HIF-1α，N-Cad and Vim mRNA expression levels in GH3 cells of each group

注：HIF=低氧誘導因子，N-Cad=N-鈣黏蛋白，Vim=波形蛋白；a表示與常氧組比較，P＜0.05；b表示與低氧組比較，P＜0.05；c表示與常氧+siRNA組比較，P＜0.05

組別 HIF-1α mRNA N-Cad mRNA Vim mRNA常氧組 0.012±0.002 0.029±0.003 0.004 0±0.001 0低氧組 0.091±0.018a 0.166±0.013a 0.012 0±0.001 0a常氧+siRNA組 0.003±0.001ab 0.006±0.006b 0.001 0±0.000 1ab低氧+siRNA組 0.011±0.001bc 0.046±0.007b 0.002 0±0.000 2bc F值 20.66 68.65 37.75 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平比較 常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。低氧組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平高于常氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；常氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平低于常氧組、低氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低氧+siRNA組GH3細胞中Vim蛋白表達水平高于常氧組，HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平低于低氧組、高于常氧+siRNA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 BCA法檢測各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平的電泳圖Figure 1 The electrophoretic patterns of HIF-1α，N-Cad and Vim protein expression levels in GH3 cells of each group detected by BCA method

表3 各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of HIF-1α，N-Cad and Vim protein expression levels in GH3 cells of each group

表3 各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of HIF-1α，N-Cad and Vim protein expression levels in GH3 cells of each group

注：a表示與常氧組比較，P＜0.05；b表示與低氧組比較，P＜0.05；c表示與常氧+siRNA組比較，P＜0.05

組別 HIF-1α蛋白 N-Cad蛋白 Vim蛋白常氧組 0.323±0.052 0.430±0.021 0.660±0.032低氧組 0.910±0.035a 1.110±0.055a 1.260±0.095a常氧+siRNA組 0.140±0.026ab 0.203±0.024ab 0.340±0.052ab低氧+siRNA組 0.283±0.038bc 0.493±0.012bc 0.983±0.044abc F值 76.27 143.60 42.94 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細胞和腫瘤周圍浸潤的免疫細胞、新生血管及其內(nèi)皮細胞、腫瘤相關(guān)成纖維細胞和細胞外基質(zhì)共同構(gòu)成的［9］，在實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要作用。作為腫瘤微環(huán)境的特征之一，低氧與多種腫瘤侵襲性和預后不良相關(guān)［10-11］。HIF-1α是細胞對缺氧做出反應的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，與腫瘤EMT［7］、血管生成［12］、藥物抗性［13］密切相關(guān)。本研究旨在分析低氧誘導大鼠垂體腺瘤GH3細胞增殖和EMT的機制。

國際癌癥基因組聯(lián)盟發(fā)起的“全基因組泛癌分析”計劃顯示，在27類1 188種癌癥中腫瘤組織內(nèi)低氧程度與基因突變頻率增加有關(guān)，低氧在基因組重構(gòu)和腫瘤惡性進展中起關(guān)鍵作用［11］。腫瘤組織內(nèi)低氧環(huán)境有助于腫瘤的可塑性和異質(zhì)性［14］。國內(nèi)有報道稱，低氧促進小鼠垂體腺瘤GT1-1細胞增殖，在12 h達到峰值，隨后呈下降趨勢［15］。本研究結(jié)果顯示，低氧組干擾后24、48、72 h細胞增殖能力高于常氧組；常氧+siRNA組干擾后72 h細胞增殖能力低于常氧組，干擾后24、48、72 h細胞增殖能力低于低氧組；低氧+siRNA組干擾后24 h細胞增殖能力高于常氧組，干擾后24、48、72 h細胞增殖能力低于低氧組、高于常氧+siRNA組；常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組干擾后48、72 h細胞增殖能力分別高于本組干擾后24 h；常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組干擾后72 h細胞增殖能力分別高于本組干擾后48 h；提示低氧可促進垂體腺瘤細胞增殖，而干擾HIF-1α未能完全阻斷低氧的促腫瘤細胞增殖作用。低氧組細胞侵襲能力高于常氧組；常氧+siRNA組細胞侵襲能力低于常氧組、低氧組；低氧+siRNA組細胞侵襲能力低于低氧組，高于常氧+siRNA組；提示低氧可促進垂體腺瘤細胞侵襲，而干擾HIF-1α未能完全阻斷低氧的促腫瘤細胞侵襲作用。推測在垂體腺瘤中除了HIF-1α外，還有其他的調(diào)控機制，如2-酮戊二酸依賴性［16］、低氧誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應［17］，但這需要進一步研究驗證。

HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β組成的異源二聚體，其中HIF-1α可反映機體缺氧程度，通過代謝、增殖和血管生成等多個生理過程參與癌癥的發(fā)生發(fā)展［8］。HIF-1α能增強內(nèi)皮細胞向低氧組織的遷移，即促進EMT，進而促進新生血管形成［18］。垂體腺瘤中EMT與腺瘤的侵襲性密切相關(guān)，誘導EMT可促進GH3細胞的侵襲和增殖，相反則抑制GH3細胞的侵襲和增殖，并引起GH3細胞阻滯于G1期［19］。大部分垂體腺瘤均有HIF-1α表達并且其水平與垂體腺瘤的侵襲性密切相關(guān)［20］。與血管豐富的正常腦垂體相比，垂體腺瘤具有較低的血管密度，但腫瘤內(nèi)的缺氧條件仍可激活一些誘導途徑，導致血管密度增加或形成更有序的微血管幾何形狀以維持腫瘤生長［21］。本研究結(jié)果顯示，低氧組GH3細胞中HIF-1α mRNA及其蛋白表達水平高于常氧組；常氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α mRNA及其蛋白表達水平低于常氧組、低氧組；低氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α mRNA及其蛋白表達水平低于低氧組、高于常氧+siRNA組；提示低氧狀態(tài)下GH3細胞的HIF-1α表達水平明顯升高，本研究采用的siRNA技術(shù)未能完全阻斷HIF-1α的表達。E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-Cad）通常在上皮細胞中表達，其表達下調(diào)破壞細胞內(nèi)連接使上皮細胞獲得遷移能力。當E-Cad轉(zhuǎn)變?yōu)镹-Cad時，導致腫瘤細胞侵襲和擴散［22-23］。本研究結(jié)果顯示，低氧組GH3細胞中N-Cad mRNA表達水平高于常氧組；常氧+siRNA組GH3細胞中N-Cad mRNA表達水平低于低氧組；低氧+siRNA組GH3細胞中N-Cad mRNA表達水平低于低氧組；低氧組GH3細胞中N-Cad蛋白表達水平高于常氧組；常氧+siRNA組GH3細胞中N-Cad蛋白表達水平低于常氧組、低氧組；低氧+siRNA組GH3細胞中N-Cad蛋白表達水平低于低氧組、高于常氧+siRNA組；提示E-Cad轉(zhuǎn)化為N-Cad是低氧誘導GH3細胞發(fā)生EMT的主要機制。這一表現(xiàn)和既往應用細胞周期抑制劑帕博西尼影響GH3細胞侵襲的機制相同［24］，即影響E-Cad向N-Cad的轉(zhuǎn)化。Vim作為EMT的正調(diào)節(jié)因子，其上調(diào)被認為是EMT的先決條件［25］。本研究結(jié)果顯示，低氧組GH3細胞中Vim mRNA表達水平高于常氧組；常氧+siRNA組GH3細胞中Vim mRNA表達水平低于常氧組、低氧組；低氧+siRNA組GH3細胞中Vim mRNA表達水平低于低氧組、高于常氧+siRNA組；低氧組GH3細胞中Vim蛋白表達水平高于常氧組；常氧+siRNA組GH3細胞中Vim蛋白表達水平低于常氧組、低氧組；低氧+siRNA組GH3細胞中Vim蛋白表達水平高于常氧組、常氧+siRNA組，低于低氧組；提示在低氧促進GH3細胞發(fā)生EMT的過程中，Vim也發(fā)揮重要作用。

綜上所述，低氧通過上調(diào)HIF-1α表達而促進GH3細胞增殖和細胞侵襲，低氧通過上調(diào)N-Cad、Vim表達而促進EMT的發(fā)生，干擾HIF-1α表達可部分阻斷這些作用。深入了解HIF-1α通路參與垂體腺瘤發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機制可為垂體腺瘤的藥物治療提供新思路和理論依據(jù)。然而，本研究并未構(gòu)建過表達HIF-1α模型，從過表達HIF-1α和干擾HIF-1α表達兩方面證實HIF-1α與EMT的關(guān)系。在未來的研究中，本研究組計劃構(gòu)建穩(wěn)定高表達HIF-1α和干擾HIF-1α表達的動物模型，比較兩者的動物表型，為垂體腺瘤中靶向HIF-1α治療提供新的證據(jù)。

作者貢獻：張歡撰寫論文，進行結(jié)果分析與解釋；石文健、劉永亮、李景武進行數(shù)據(jù)收集；張于、董桂蘭進行數(shù)據(jù)整理、分析；董偉進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，負責文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。