CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性對(duì)華法林個(gè)體化用藥的指導(dǎo)價(jià)值

丁維劍，汪亞南，苗仁華

華法林是維生素K拮抗劑，也稱(chēng)香豆素類(lèi)口服抗凝劑，主要用于靜脈血栓栓塞性疾病的一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防。研究表明，華法林預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病的療效確切且口服給藥便利，是臨床應(yīng)用較廣泛的一線(xiàn)口服抗凝劑［1］。但華法林治療時(shí)間窗較窄，個(gè)體差異較大，需頻繁檢測(cè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（international normalized ratio，INR）并實(shí)時(shí)調(diào)整用藥劑量，以權(quán)衡治療效果和出血風(fēng)險(xiǎn)，這也是導(dǎo)致華法林臨床使用受限的原因之一［2］。華法林的治療效果受到多種因素的影響，以遺傳因素中基因多態(tài)性較為突出［3］。

細(xì)胞色素P450 2C亞家族是一類(lèi)重要的藥物代謝酶，華法林在肝臟中代謝主要依賴(lài)細(xì)胞色素P450。華法林是S-華法林和R-華法林的光學(xué)異構(gòu)體混合物，其中S-華法林主要由CYP2C9代謝，可以提供華法林70%的抗凝活性［4-5］；同時(shí)VKORC1可通過(guò)干擾凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的合成而影響華法林的抗凝作用［6］。因此，CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性與華法林的抗凝作用密切相關(guān)［7］。

近年隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展，有大樣本量的全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome wide association study，GWAS）和臨床研究表明，CYP2C9和VKORC1基因在華法林發(fā)揮抗凝作用中起主要作用［2，8-10］。華法林藥物基因組學(xué)聯(lián)合會(huì)（The International Warfarin Pharmaeogenetics Consortium，IWPC）研究顯示，基于華法林藥物基因組學(xué)（包括基因型）構(gòu)建的藥物基因組學(xué)的臨床用藥模型優(yōu)于基于臨床特征構(gòu)建的臨床用藥模型［11］。目前，IWPC建立的華法林劑量公益網(wǎng)站（www.warfarindosing.org）［12］會(huì)根據(jù)患者的基因型和臨床特征（如性別、種族、年齡、身高、體質(zhì)量、臨床診斷、用藥情況等）自動(dòng)計(jì)算出華法林推薦劑量?；诖耍狙芯恐荚诜治鯟YP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)華法林個(gè)體用藥的指導(dǎo)價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2020年6月至2021年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院藥劑科治療藥物監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測(cè)的住院患者54例，均為漢族人群，其中男31例（占57.4%），女23例（占42.6%）；年齡（75.5±6.8）歲；身高（163.4±7.8）cm；體質(zhì)量（61.9±10.2）kg；臨床診斷：冠心病17例（占31.5%），心功能不全16例（占29.6%），心律失常6例（占11.1%），心力衰竭3例（占5.6%），心房顫動(dòng)2例（占3.7%），腦梗死2例（占3.7%），風(fēng)濕性心臟病2例（占3.7%），胸悶2例（占3.7%），急性冠脈綜合征1例（占1.8%），心絞痛1例（占1.8%），高血壓1例（占1.8%），頭暈和眩暈1例（占1.8%）；CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點(diǎn)基因多態(tài)性：AA/AA基因型48例（占88.9%），AA/GA基因型4例（占7.4%），AC/AA基因型1例（占1.9%），AA/GG基因型1例（占1.9%）。本研究已通過(guò)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器和試劑 主要儀器：超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：SW-CJ-1FD），旋渦混合器（美國(guó)Thermo Fisher生產(chǎn)），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：DK-S22），熒光檢測(cè)儀（西安天隆科技有限公司生產(chǎn)，RT-CyclerTM436/TL998A），臺(tái)式低溫離心機(jī)（長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司生產(chǎn)），微量移液槍?zhuān)ǚ姨m百得實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司生產(chǎn)）。主要試劑：核酸純化試劑（西安天隆科技有限公司生產(chǎn)），測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（西安天隆科技有限公司生產(chǎn)）。

1.3 基因多態(tài)性檢測(cè)方法

1.3.1 采集血液樣本 采集患者靜脈血1～2 ml，置于含乙二胺四乙酸抗凝劑的紫色采血管，采血前患者無(wú)需空腹，可正常飲食。由專(zhuān)人將血液樣本送至治療藥物監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱保存，24 h內(nèi)檢測(cè)。

1.3.2 從血液樣本中富集白細(xì)胞 在1.5 ml離心管中加入1.0 ml 1×NH4Cl的預(yù)處理液，然后加入200 μl混勻的全血，上下顛倒10次，室溫靜置5 min，室溫3 000 r/min離心5 min（離心半徑6.45 cm），之后將上層透明紅色液體吸干凈；加入1 ml 1×NH4Cl的徹底重懸白細(xì)胞，離心后將上層液體吸干凈，注意避免吸走管底白細(xì)胞。向富集白細(xì)胞的離心管中加入30～50 μl核酸純化試劑，反復(fù)吹打混勻，室溫靜置20～30 min，期間顛倒混勻2次，待檢測(cè)。

1.3.3 上樣 根據(jù)待檢測(cè)的基因位點(diǎn)，取對(duì)應(yīng)的測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒，將樣本編號(hào)標(biāo)注在試劑管蓋上；向相應(yīng)編號(hào)的試劑中加入1.5 μl處理后的白細(xì)胞樣本（加樣時(shí)應(yīng)再次混勻，槍頭在管內(nèi)液體中間吸足1.5 μl樣本，若加入量過(guò)少會(huì)直接影響結(jié)果），蓋緊管蓋，短暫離心后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 運(yùn)行 提前打開(kāi)熒光檢測(cè)儀，軟件為儀器自帶的熒光檢測(cè)軟件。儀器進(jìn)行自檢運(yùn)行，打開(kāi)熒光檢測(cè)軟件，選擇待檢測(cè)的基因位點(diǎn)，設(shè)置待檢樣本（注意待檢樣本放入儀器的位置順序與軟件設(shè)置的位置順序一致）；放入樣本后開(kāi)始運(yùn)行。

1.3.5 結(jié)果分析、判讀 運(yùn)行完成后，軟件“結(jié)果”欄給出樣本基因型分析結(jié)果。

1.4 華法林治療情況 根據(jù)《華法林抗凝治療的中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》［13］，住院患者口服華法林2～3 d后每日或隔日檢測(cè)INR，直到INR達(dá)標(biāo)（根據(jù)既往華人的研究結(jié)果，以INR為1.5～2.5判定為達(dá)標(biāo)［14-16］）并維持至少2 d，之后可根據(jù)患者具體情況數(shù)天至1周檢測(cè)1次INR，出院后每4周檢測(cè)1次INR。根據(jù)CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點(diǎn)基因多態(tài)性并參照華法林劑量公益網(wǎng)站計(jì)算華法林推薦劑量，以華法林推薦劑量±0.2 mg作為華法林推薦劑量范圍。比較華法林使用劑量為推薦劑量者與華法林使用劑量為非推薦劑量者華法林治療2～3 d后INR達(dá)標(biāo)率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用Fisher's確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料及基因分型 54例患者于服用華法林2～3 d后檢測(cè)INR者23例，其中男14例（占60.9%），女9例（占39.1%）；年齡（75.6±6.5）歲；身高（162.9±8.4）cm；體質(zhì)量（62.6±12.0）kg；臨床診斷：心功能不全11例（占47.8%），冠心病7例（占30.4%），心律失常2例（占8.7%），心力衰竭1例（占4.3%），心房顫動(dòng)1例（占4.3%），腦梗死1例（占4.3%）；CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因多態(tài)性：AA/AA基因型18例（占78.3%），AA/GA基因型3例（占13.0%），AC/AA基因型1例（占4.3%）、AA/GG基因型1例（占4.3%）。

2.2 華法林用藥及INR檢測(cè)情況 23例患者中華法林使用劑量為推薦劑量者11例，華法林治療2～3 d后INR達(dá)標(biāo)10例；華法林使用劑量為非推薦劑量者12例，華法林治療2～3 d后INR達(dá)標(biāo)2例。華法林使用劑量為推薦劑量者華法林治療2～3 d后INR達(dá)標(biāo)率高于華法林使用劑量為非推薦劑量者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)表1。

表1 23例患者華法林用藥及INR檢測(cè)情況Table 1 Warfarin administration and INR detection in 23 patients

3 討論

本研究結(jié)果顯示，54例患者共檢測(cè)出4種CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因型，分別為AA/AA基因型48例（占88.9%）、AA/GA基因型4例（占7.4%）、AC/AA基因型1例（占1.9%）、AA/GG基因型1例（占1.9%）。既往研究表明，中原地區(qū)漢族和回族人群CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因突變頻率很低，其中攜帶AA/AA基因型的患者占總體的80%～90%，攜帶雜交突變基因型的患者占總體的10%～20%［17-19］，本研究結(jié)果與之相似，表明本研究樣本量雖然有限，但具有代表性。

《華法林抗凝治療的中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》［13］指出，華法林最佳抗凝強(qiáng)度為INR介于2.0～3.0之間，此時(shí)出血和血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn)均最低，不建議低強(qiáng)度抗凝治療（INR＜2.0），以免增加卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，在東亞地區(qū)，采用低強(qiáng)度華法林治療（INR為1.5～2.5）的患者與采用最佳抗凝強(qiáng)度治療（INR為2.0～3.0）的患者心血管死亡率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明低強(qiáng)度華法林治療較為安全［14］；且該研究結(jié)果也在老年心臟機(jī)械瓣膜置換術(shù)后患者和穩(wěn)定型冠心病伴心房顫動(dòng)患者中得到證實(shí)［20-21］。TAO等［15］通過(guò)人工智能自適應(yīng)神經(jīng)模糊推理系統(tǒng)（adaptive neural-based fuzzy inference system，ANFIS）預(yù)測(cè)個(gè)體化華法林的用藥劑量，該研究選取中國(guó)15個(gè)省份21 863例心臟瓣膜置換術(shù)后接受華法林治療的患者為研究對(duì)象，通過(guò)ANFIS預(yù)測(cè)患者術(shù)后華法林用藥劑量并與國(guó)際推薦的INR（2.5～3.5）相比，證實(shí)中國(guó)人需要更低的抗凝強(qiáng)度（INR為1.5～2.5）。另外，華法林中強(qiáng)度抗凝治療組患者出血事件總發(fā)生率高于華法林低強(qiáng)度抗凝治療組，提示華法林低強(qiáng)度抗凝治療有助于預(yù)防出血事件，安全性更高［16］。上述研究均表明，華法林低強(qiáng)度抗凝治療可以減少出血發(fā)生，且不增加血栓栓塞發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究將華法林低強(qiáng)度抗凝治療（INR為1.5～2.5）作為INR達(dá)標(biāo)的判定標(biāo)準(zhǔn)。

參照華法林劑量公益網(wǎng)站計(jì)算出的華法林推薦劑量，本組患者華法林使用劑量為推薦劑量者11例，華法林使用劑量為非推薦劑量者12例，提示臨床上仍有很大一部分患者未按照華法林的推薦劑量給藥，且存在劑量調(diào)整不規(guī)范情況，進(jìn)而導(dǎo)致INR不達(dá)標(biāo)或達(dá)標(biāo)時(shí)間延長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，華法林使用劑量為推薦劑量者華法林治療2～3 d后INR達(dá)標(biāo)率高于華法林使用劑量為非推薦劑量者，提示按照CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點(diǎn)基因多態(tài)性推薦華法林用藥劑量可提高華法林抗凝效果及用藥合理性。此外，臨床上還有一大部分使用華法林治療的患者未進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)，究其原因可能為基因檢測(cè)費(fèi)用昂貴，患者不愿意檢測(cè)。近年來(lái)，諸多研究采用IWPC模型計(jì)算華法林預(yù)測(cè)劑量［22-23］，以期減少單純根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行抗凝治療帶來(lái)的弊端、科學(xué)指導(dǎo)華法林抗凝治療、降低華法林用藥過(guò)量導(dǎo)致的出血風(fēng)險(xiǎn)；但其對(duì)中國(guó)漢族人群華法林用藥劑量的預(yù)測(cè)效果有限，故適合中國(guó)漢族人群華法林低強(qiáng)度抗凝治療藥物的基因組學(xué)模型仍需大規(guī)模臨床研究進(jìn)一步構(gòu)建。

綜上所述，按照CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位點(diǎn)基因多態(tài)性推薦華法林用藥劑量可使患者INR盡快達(dá)標(biāo)，進(jìn)而提高華法林抗凝效果及用藥合理性。但本研究納入的樣本量較小，基因多態(tài)性檢測(cè)能否真正為臨床治療提供理論依據(jù)還需大規(guī)模臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：丁維劍進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)撰寫(xiě)、修訂論文，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；丁維劍、苗仁華進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，結(jié)果分析與解釋?zhuān)煌魜喣线M(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析。

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