益生凝結(jié)芽孢桿菌的篩選及生物學(xué)特性研究

張 韻，趙麗娜，曹 琳，王曉彤，周馨魁，古紹彬

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 47102）

益生凝結(jié)芽孢桿菌的篩選及生物學(xué)特性研究

張 韻，趙麗娜，曹 琳，王曉彤，周馨魁，古紹彬*

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 47102）

本實驗依據(jù)益生菌篩選的常規(guī)方法和凝結(jié)芽孢桿菌的判定標準，旨在從健康仔豬糞便中分離獲得益生性能優(yōu)良且安全的益生凝結(jié)芽孢桿菌，并通過體外模擬動物腸道環(huán)境，評價其益生特性和應(yīng)用特點。本研究從70余株豬源芽孢桿菌中篩選鑒定出4株凝結(jié)芽孢桿菌，分別命名為BC147、BC235、BC303和 BC310。結(jié)果表明：4株菌對大腸桿菌K88，雞腸炎沙門菌，豬腸炎沙門菌，金黃色葡萄球菌，鼠傷寒沙門菌均表現(xiàn)出良好的抑菌作用。益生及耐受性研究發(fā)現(xiàn)，四株菌均具有良好黏附能力，并對膽鹽和低酸環(huán)境表現(xiàn)出較強的耐受能力，其中BC303 對仔豬腸黏液的黏附率高達41.67%，在pH 4的條件下其營養(yǎng)細胞存活率高達91.0%，在0.3%膽鹽中暴露2 h，其存活率仍然維持在40%以上。同時，四株菌均具有一定的蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶產(chǎn)生能力。結(jié)果顯示，從健康仔豬腸道及糞便分離篩選獲得的凝結(jié)芽孢桿菌具有良好的益生性和安全性，其在畜禽養(yǎng)殖中具有廣泛應(yīng)用前景。

凝結(jié)芽孢桿菌；體外抑菌實驗；黏附性；水解酶活性

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans），為同型乳酸發(fā)酵菌，是最具潛力的益生菌之一，近年來受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[1]。由于該菌可產(chǎn)生多種代謝物，如抑菌物質(zhì)：LA、lactospore、細菌素和凝固素等；消化酶類：α-淀粉酶、纖維素酶、β-半乳糖苷酶、脂肪酶和蛋白酶等，還可促進動物機體對某些礦物質(zhì)元素（如鐵、磷、鈣和鋅等） 和維生素D的吸收利用，從而表現(xiàn)出良好的益生性能。研究表明凝結(jié)芽孢桿菌除了在維持腸道微生態(tài)平衡中的保健作用外，其對常見腸道疾病如慢性結(jié)腸炎、腹瀉和便秘等有明顯療效，還具有調(diào)節(jié)血糖血脂和捉高免疫力的功效。由于其兼具乳酸菌和芽孢菌共同的特點，以及良好的安全性，1989年被美國FDA 認可其為 “普遍認為安全（GRAS）” 的桿菌，此外還獲得了歐洲歐盟食品安全局（EFSA）的安全資格認定（QPS），至今仍被評定為缺乏產(chǎn)毒潛能[2-3]。目前，該菌在美國、歐洲等地除被應(yīng)用于臨床和食品添加外，還被推薦作為可直接飼喂微生物用于畜牧業(yè)生產(chǎn)[4-5]。我國目前使用的凝結(jié)芽孢桿菌多為外籍菌，且益生菌從生產(chǎn)到進入動物腸道發(fā)揮作用，需經(jīng)歷熱、高壓以及胃酸和膽汁等不利因素的影響。因此，從禽畜腸道獲得具有較好黏附和定植特征的天然菌種，可有效確保菌種良好的益生性能和安全性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 糞便樣品采集自洛陽龍門裴村養(yǎng)豬場15～40日齡健康仔豬糞便；腸黏液采集自該養(yǎng)豬場健康仔豬盲腸及大腸。

1.2 測試用病源菌株 大大腸桿菌K88（E. coliK88），雞腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis）O:1,9,12豬腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis ）O4Hi，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213，鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium) ATCC 13311, 以上菌株由河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院牛明福老師和張敏老師惠贈。

1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0、酵母提取物5.0、NaCl 10.0, pH 7.0～7.2, 配制固體培養(yǎng)基時需添加20 g瓊脂。

碳酸鈣鑒定平板（g/L）：牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、碳酸鈣 1.0、瓊脂 2.0、pH 7.0～7.2。淀粉培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉2.0、胰蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、NaCl 5.0、瓊脂20.0、pH 7.0～7.2。纖維素酶選擇性培養(yǎng)基（g/L）：羧甲基纖維素鈉20.0、胰蛋白胨 2.5、Na2HPO42.5、KH2PO41.5、瓊脂 20.0、pH 7.0～7.2。蛋白酶選擇性培養(yǎng)基（g/L）：干酪素 5.0、葡萄糖 10.0、酵母粉 10.0、K2HPO41.0、，KH2PO40.5、MgSO40.1、瓊脂 20.0、pH 7.0～7.2。

1.4 芽孢桿菌的分離篩選 對凝結(jié)芽孢桿菌的分離采用熱處理、產(chǎn)酸鑒定和接觸酶陽性鑒定法。稱取1 g樣品于9 mL無菌生理鹽水中，充分混勻，80℃水浴溫育30 min后，按照3%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h；然后，取菌液依次稀釋至10-6，100 μL涂布于碳酸鈣鑒定平板；挑取產(chǎn)生溶鈣圈及生長良好的單菌落進行革蘭染色、芽孢染色和接觸酶實驗，選取革蘭氏陽性、產(chǎn)芽孢且接觸酶為陽性的桿狀細菌作為候選芽孢桿菌，繼續(xù)純化培養(yǎng)，保藏備用。

1.5 生理生化實驗 生理生化鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗、V-P實驗、淀粉酶水解實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗、運動性實驗、卵黃卵磷脂酶實驗和絡(luò)氨酸分解實驗等[6-7]。

1.6 16SrDNA 分子生物學(xué)鑒定 引物設(shè)計：P0：（5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG - 3′）；PC3：（5′- CTAHAGGGTATCTAATCCT- 3′）；由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。

基因組DNA的提?。杭毦鶧NA的提取采用索萊寶公司細菌DNA提取試劑盒。

16SrDNA的擴增與測序：以上述提取的DNA作為模板，以16SrDNA引物P0，PC3為引物進行PCR擴增。 PCR擴增體系（25 μL）：ddH2O：9.5 μL；上游引物：1μL，下游引物：1 μL，模板DNA：1 μL，PCR Mix：12.5 μL，PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 1.5 min，55℃退火1 min，72℃延伸 1.5 min，72℃最終延伸 10 min。

對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測得的基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫做BLAST比對，進行序列同源性分析。

1.7 黏附性實驗 將候選益生凝結(jié)芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)24 h，然后離心（5 000 r/ min，10 min）收集菌體，用無菌PBS洗滌2次后重懸，調(diào)整細菌濃度為108CFU/mL。刮取健康仔豬的腸黏液于無菌PBS中，震蕩后2 000 r/ min離心15 min，收集上清液并調(diào)整蛋白含量為0.5 mg/mL，-20℃保藏待用。取300 μL腸黏液于96孔細胞培養(yǎng)板中，4℃過夜；無菌PBS洗滌2次，加入300 μL的已制備好的菌懸液，37℃孵育2h；PBS洗滌2次，加入1%SDS 0.1 mol/L NaOH（300 μL/孔），60℃孵育1 h；最后，使用血球計數(shù)板進行計數(shù)。黏附百分率為黏附前后細菌個數(shù)之比乘以100%[13-14]。

1.8 耐受性實驗 將篩選到的凝結(jié)芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基中并置37℃恒溫條件下震蕩培養(yǎng)24 h，離心（5 000 r/ min，10 min）收集菌體，菌體重懸于無菌PBS（pH=7）中洗滌1次后制備成菌懸液。耐酸實驗：將菌懸液每1 mL分裝離心后，分別加入pH為1.0、2.0、 3.0、4.0、5.0的10 mL PBS緩沖液中；耐膽鹽實驗：將菌懸液每1 mL分裝離心后，分別加入到10 mL膽鹽濃度為0.03%、0.1%、0.3%、0.5%及0.7%（w/v）的PBS緩沖液（pH=7）中。上述樣品在37℃孵育2 h，涂平板計數(shù)。存活率（%）等于實驗組與對照組活菌數(shù)之比乘以100%。

1.9 致病菌拮抗實驗 驗所用病原菌為畜禽腸道常見致病菌。菌株抑菌性的研究采用的方法是牛津杯法。在LB液體培養(yǎng)基中分別接種各類病原菌，37℃過夜培養(yǎng)，然后分別取1 mL病原菌菌液（標定為108CFU/mL）加入100 mL牛肉膏蛋白胨瓊脂溶液中，充分混勻，倒入加有牛津杯的平板中，冷卻后，取出牛津杯，將凝結(jié)芽孢桿菌的培養(yǎng)菌液（100 μL）經(jīng)0.25 μL濾膜過濾后分別加入到平板上用牛津杯打出的直徑為6 mm的孔中，37℃孵育24 h后，測量抑菌圈直徑。

1.10 產(chǎn)酸活性及水解酶活性測試 水解酶活性的采用的方法是牛津杯法。將凝結(jié)芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)中并置37℃恒溫條件下震蕩培養(yǎng)24 h，吸取100 μL培養(yǎng)液分別加入淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶選擇性平板上的牛津杯孔內(nèi)。37℃培養(yǎng)24 h。然后在淀粉酶平板上滴加盧氏碘液（5 mmol/L I2、5 mmol/L KI），觀察菌落周圍是否出現(xiàn)水解圈；在纖維素酶平板，滴加1 mg/mL的剛果紅溶液染色30 min，后滴加1 mol/L NaCl，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)水解圈；蛋白酶活性可直接觀察透明圈。

表1 4株候選益生芽孢桿菌生理生化及形態(tài)特征

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離篩選及鑒定 本研究通過熱處理、革蘭染色、芽孢染色、接觸酶實驗和碳酸鈣鑒定平板進行分離篩選，分離出76株芽孢桿菌，形態(tài)及染色觀察發(fā)現(xiàn)BC147、BC235、BC310、BC303菌落呈圓形，除觀察到BC147孢子為中生為，其他3株菌均為端生；生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)，上述4株菌標準凝結(jié)芽孢桿菌的生理生化特征基本一致（結(jié)果見表1），初步鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌。

為進一步確認4種菌的種屬關(guān)系，通過細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取了BC147、BC235、BC310、BC303基因組的DNA，并以P0: 5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ 和PC3: 5′-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3′為PCR上下游引物，進行PCR 擴增，擴增出約750 bp 的特異條帶并測序。序列結(jié)果與 GenBank （httP:// www.ncbi.nlm.nih.gov）中的16S rDNA 序列進行Blastn 相似性分析發(fā)現(xiàn)，4株菌株均與凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans） 的16S rDNA 序列的同源性達到了97%。采用EzTaxon在線比對進行有效物種的相似性搜索，然后采用MEGA 5.0 和 NJ算法構(gòu)建出4株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），從進化距離分析發(fā)現(xiàn)BC147、BC235、BC310、BC303與Bacilluscoagulans IAM 12463標準模式菌株接近，這與生理生化鑒定結(jié)果一致，因此將它們鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌。

表 2 4株凝結(jié)芽孢桿菌對常見腸道病原菌的拮抗作用

圖1 BC147、BC235、BC310和BC303的16SrDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 病原菌拮抗實驗 對分離到的4株凝結(jié)芽孢桿菌進行常見畜禽腸道病原菌抑菌實驗，結(jié)果見表2。4株菌對所測試的腸道常見病原菌大腸桿菌K88（E.coli K88），雞腸炎沙門氏菌（S. enteritidis）O:1,9,12，豬腸炎沙門氏菌（S. enteritidis ）O4Hi，金黃色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 29213和鼠傷寒沙門氏菌（S. typhimurium） ATCC 13311均表現(xiàn)出拮抗作用，其中對鼠傷寒沙門氏菌拮抗效應(yīng)最為明顯。4株菌對同一病原菌間的抑菌效果差異不顯著。

2.3 黏附性 益生菌進入腸道后，通過黏附在腸黏膜上抑制致病菌的定植，并與腸道黏膜細胞共同構(gòu)成生物屏障，改善腸道微生態(tài)平衡，保護宿主抵御外來微生物的入侵[7]。圖2顯示，4株凝結(jié)芽孢桿菌對豬腸黏液均有不同程度的黏附性能，其中BC303對腸黏液的黏附能力最強，達41.67%±3.73%，良好的黏附性決定其更好的發(fā)揮其益生特性。

圖2 實驗菌株對腸黏液的黏附率（n=3）

圖3 菌株對酸的耐受性（n=3）

圖4 菌株對膽鹽的耐受性（n=3）

2.4 耐酸及耐膽鹽特性 動物腸胃道酸度為pH 2～3，小腸接近中性達到pH5～7，因此本研究中耐酸性實驗的pH控制在1～5。凝結(jié)芽孢桿菌營養(yǎng)細胞在不同pH環(huán)境下暴露2 h后的存活率見圖3所示。由圖3可知，4株菌在pH 1～2的極端條件下暴露2 h后仍有15%以上的存活率，在pH 3時BC147耐受性急劇增加，存活率達到78.0%±5.8%；而BC303在pH4時其營養(yǎng)細胞存活率回復(fù)到了91%±3.5%。由此可見，分離獲得的4株凝結(jié)凝結(jié)芽孢桿菌具有較強的耐酸受能力，在pH 3以上均能很好存活，當(dāng)芽孢通過胃酸環(huán)境進入小腸后在pH5～7的小腸環(huán)境中可順利萌發(fā)和增殖，為其益生特性的發(fā)揮奠定了重要基礎(chǔ)。凝結(jié)芽孢桿菌膽鹽耐受力如圖4所示，在膽鹽濃度為0.03%時，菌株均能良好生存，在膽鹽濃度為0.1%和0.3%時，BC303的存活率達到了40%以上，而在膽鹽濃度為0.5%時，BC235耐受率仍在45.3%±3.2%。因此BC235和BC303具有良好的耐膽鹽能力。綜合分析耐酸性和耐膽鹽能力，BC303呈現(xiàn)出更好的耐受性，能更好地適應(yīng)胃酸和腸道膽鹽環(huán)境，更好地發(fā)揮其生物學(xué)特性。

2.5 胞外水解酶活性 淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素是動物飼料的主要成分，為提高飼料利用率，人們通常來受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[1]。由于其兼具乳酸菌和芽孢菌共同的特點，以及良好的安全性，1989年就被美國FDA 認可其為 “普遍認為安全（GRAS）”的桿菌，并被列入美國農(nóng)業(yè)部GRAS和美國飼料控制委員會（AAFCO）名單中；同時其還被歐洲食品與飼料菌種協(xié)會（EFFCA）和國際乳品聯(lián)合會（IDF）共同認定為GRAS菌種[2]，并獲得了歐洲歐盟食品安全局（EFSA）的安全資格認定（QPS），且至今仍被評定為缺乏產(chǎn)毒潛能[3]。目前，該菌在美國、歐洲等地除被應(yīng)用于臨床和食品添加外，還被推薦將淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等飼用酶添加到飼料中，以補充動物體內(nèi)內(nèi)源酶的不足，從而提高飼料中營養(yǎng)成分的吸收率。近年來，隨著益生菌在中國養(yǎng)殖行業(yè)的興起，產(chǎn)酶益生菌兼具益生菌和飼用酶的特點受到越來越廣泛的關(guān)注。BC147、BC235、BC310和BC303胞外水解酶特性如圖5所示，經(jīng)過夜培養(yǎng)在淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶選擇性平板上呈現(xiàn)出明顯的水解圈，4菌產(chǎn)纖產(chǎn)維素酶和蛋白酶能力明顯強于產(chǎn)淀粉酶的能力。

圖5 候選菌株在3種水解酶選擇性培養(yǎng)基上的水解特性

3 討 論

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans），屬于硬（或厚）壁菌門，芽孢桿菌屬，革蘭氏陽性菌，為同型乳酸發(fā)酵菌；其作為最具潛力的益生菌之一，近年作為可直接飼喂微生物用作畜牧業(yè)生產(chǎn)[4-5]。在動物源食品藥物殘料超標日益嚴峻的形勢下，新型益生菌的引入，對減少藥物的使用，降低動物性食品源頭污染具有極其重要的作用。從健康動物的糞便或腸道中分離篩選凝結(jié)芽孢桿菌菌株是保證菌株安全無毒的前提，同時也確保菌株在進入動物腸道后能夠更好定植并生長繁殖。因此，動物源益生菌的篩選受到越來越廣泛的關(guān)注。本文從黏附性、耐受性、抗菌性及產(chǎn)酸和產(chǎn)水解酶活性出發(fā)，對篩選到的4株候選益生芽孢桿菌益生特性進行研究。

益生菌對動物腸道的黏附能力是其發(fā)揮益生作用的重要標準。在大部分的實驗研究中，對益生菌的黏附特性研究均采用體外細胞模型[8]，且黏附到腸道黏液則是其定植于腸道上皮細胞的先決條件，因此本研究采用的對仔豬腸黏液的黏附來表征和評價其黏附能力。Li等[9]篩選的乳酸菌Lactobacillus acidoPhilus I021、Lactobacillusgasseris1031和Lactobacillus reuteri I2021對仔豬腸道的黏附率分別達到了17.9%± 1.1%、9.8%± 1.1%、13.1%± 1.4%，并表現(xiàn)出良好的益生性能。而本研究篩選到的4株益生凝結(jié)芽孢桿菌均表現(xiàn)出更強的黏附性能，其中BC303對仔豬前腸黏液黏附率最高，達到41.67%±3.73%。在腸道黏膜上的高效定植能夠與致病菌進行競爭性排斥，從而調(diào)整腸道微生物組成，維持腸道微生態(tài)平衡。

良好的耐受性也是益生菌發(fā)揮作用的基本條件，動物胃部酸度為pH 2～3。只有具有較高的耐受性才能使菌株在胃腸道內(nèi)存活、生長并發(fā)揮益生特性。本研究篩選到的BC147在pH3時耐受率高達78.0%±5.8%，BC303在pH4的條件下耐受率高達91%±3.5%；在膽鹽濃度為0.1%和0.3%時，BC303的耐受率為40%以上，而在膽鹽濃度為0.5%時，BC235耐受率仍在45.3%±3.2%。營養(yǎng)細胞狀態(tài)的候選益生凝結(jié)芽孢桿菌表現(xiàn)出高的耐受性能力，為其在胃酸環(huán)境及腸道環(huán)境下穩(wěn)定存活，更好地發(fā)揮其益生特性奠定了基礎(chǔ)。

凝結(jié)芽孢桿菌可以產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，如l-乳酸、凝固素和lactosPorin等，這些代謝產(chǎn)物可有效調(diào)整腸道菌群的結(jié)構(gòu)，增加腸道正常微生物數(shù)量，消除來自外部環(huán)境的抗原，提高上皮細胞的生存力，構(gòu)建完整的生物屏障系統(tǒng)，刺激抗體和抗炎細孢因子的分泌，加強對共生細菌的免疫反應(yīng)，提高腸道黏膜免疫力，改善腸道微環(huán)境等。因此，抑菌特性及其產(chǎn)酸能力也是凝結(jié)芽孢桿菌益生特性的一項重要指標。通過對其抑菌特性研究發(fā)現(xiàn)，4株凝結(jié)芽孢桿菌均能對大腸桿菌K88（E.coli K88），雞腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）O:1,9,12，豬腸炎沙門氏菌O4Hi，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium） ATCC 13311產(chǎn)生抑制作用。

眾所周知，動物飼料的主要成分是淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和纖維素等。為提高飼料的利用率，一般采用外加水解酶的形式來提高動物對飼料的吸收與利用。近年來，隨著飼用益生菌在國內(nèi)養(yǎng)殖行業(yè)的興起，有關(guān)產(chǎn)酶益生菌的研究越來越受到廣泛關(guān)注。與普通的飼用酶相比，產(chǎn)酶益生菌除本身具有的益生性外，還具有更酶制劑難以比擬的優(yōu)點。首先產(chǎn)酶益生菌大部分是屬于芽孢桿菌，由其制成的微生態(tài)產(chǎn)品，性能穩(wěn)定，耐熱性號，而普通的飼用酶多是微生物發(fā)酵產(chǎn)生，其制成的產(chǎn)品其耐熱性能相對較差。其次，產(chǎn)酶益生菌進入腸道后生長繁殖，在腸道內(nèi)，由于受到飼料中各成分（纖維素、半纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、果膠等）的誘導(dǎo)和刺激，能針對攝入的飼料成分產(chǎn)生相應(yīng)的分解酶，提高消化酶的濃度和活性，增加飼料成分的消化作用位點。而在飼料中直接添加的酶制劑，包括近年興起的組合酶（或復(fù)合酶）則均沒有這一特性；因為酶制劑所含酶的種類固定，對飼料的消化沒有機動性與針對性，且當(dāng)其進入體內(nèi)時還會被機體消化一部分。如果要提高酶制劑效果，必須針對性地增加酶的種類，并提高酶添加量，這必將導(dǎo)致成本增加；另一方面過度添加酶制劑將會抑制動物機體原有消化酶的分泌，長期使用將會引起動物消化機能下降。

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S816

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-109

2016-06-27；

2016-07-26

國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目資助（2015104640 24）；河南省重點科技攻關(guān)項目資助（162102210199）

張韻（1995-），女，湖南邵陽，大學(xué)本科

*通訊作者：古紹彬，博士，教授，E-mail:shaobingu@haust.edu.cn