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    阿魏酸對人胃癌MGC—803細(xì)胞增殖的影響?

    2016-12-03 11:07:02張艷李海龍王虎平顧靜馬春林吳紅彥
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2016年9期
    關(guān)鍵詞:阿魏酸細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡

    張艷 李海龍 王虎平 顧靜 馬春林 吳紅彥

    摘要:目的 觀察阿魏酸對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響,探討其誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用機制。方法 不同濃度阿魏酸干預(yù)體外培養(yǎng)人胃癌MGC-803細(xì)胞,作用24、48、72 h后,MTT法檢測細(xì)胞增殖;不同濃度(0、5、7.5、10 mg/mL)阿魏酸作用MGC-803細(xì)胞48 h,Annexin V-FITC/PI法和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,RT-qPCR和Western-blot檢測Capase-3、Capase-9、Bax、Bcl-2和Xiap的mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)果 與對照組比較,5、7.5、10、12.5 mg/mL阿魏酸作用MGC-803細(xì)胞的OD值明顯降低,阿魏酸抑瘤作用明顯,阿魏酸作用MGC-803細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為12.93、9.73、5.52 mg/mL;5、7.5、10 mg/mL阿魏酸作用MGC-803細(xì)胞48 h后均能誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡,5、7.5、10 mg/mL阿魏酸均能上調(diào)Capase-3、Capase-9和Bax的mRNA和蛋白表達(dá),下調(diào)Bcl-2和Xiap的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)論 阿魏酸能有效抑制MGC-803細(xì)胞增殖,并能誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡,其作用機制與內(nèi)源性線粒體凋亡途徑和下調(diào)Xiap的表達(dá)有關(guān)。

    關(guān)鍵詞:阿魏酸;胃癌;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

    DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.017

    中圖分類號:R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1005-5304(2016)09-0070-04

    Effects of Ferulic Acid on Gastric Cancer Cell Line MGC-803 Proliferation ZHANG Yan1, LI Hai-long2, WANG Hu-ping1,2, GU Jing2, MA Chun-lin1,2, WU Hong-yan1,2 (1. Basic Medical School, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province, Key Laboratory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

    Abstract: Objective To explore the effects of ferulic acid on gastric cancer cell line MGC-803 proliferation; To discuss the mechanism of apoptosis induced by ferulic acid. Methods Ferulic acid with a variety of concentrations was used to treat gastric cancer cell line MGC-803 for 24, 48, 72 h; MTT experiment was used to detect the growth of gastric cancer cells. After gastric cancer cell line MGC-803 were treated with ferulic acid with a variety of concentrations (0, 5, 7.5, 10 mg/mL) for 48 h, all gastric cancer cells were collected and stained by Annexin V-FITC/PI for the detection of apoptosis by flow cytometry. RT-qPCR and Western-blot methods were used to detect mRNA and protein levels of Caspase-3, Caspase-9, Bax, Bcl-2 and Xiap. Results Compared with the control group, the OD value of cell line MGC-803 treated by ferulic acid with a variety of concentrations (5, 7.5, 10, 12.5 mg/mL) decreased significantly; the anti-tumor effect of ferulic acid was obvious; IC50 of 24, 48, and 72 hours after treated by ferulic acid was 12.93, 9.73 and 5.52 mg/mL respectively. Cell lineMGC-803 treated by ferulic acid with a variety of concentrations (5, 7.5, 10 mg/mL) after 48 h could induce the apoptosis of MGC-803 cells, up-regulate mRNA and protein levels of Caspase-3, Caspase-9, and Bax, down-regulate mRNA and protein levels of Bcl-2 and Xiap. Conclusion Ferulic acid can inhibit the proliferation of MGC-803 cells effectively and induce the apoptosis of MGC-803 cells, which mechanism is related to mitochondria apoptosis pathway and the down-regulation of Xiap expression.

    Key words: ferulic acid; gastric cancer; cell proliferation; cell apoptosis

    阿魏酸是多種中藥如川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊、蒲公英、酸棗仁等的有效成分之一,現(xiàn)代藥理研究表明,阿魏酸具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗凝、解毒、保肝、調(diào)節(jié)免疫等功效[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn),阿魏酸乙酯可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)凋亡[2]。然而,阿魏酸是否可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)凋亡尚不清楚。本實驗擬用阿魏酸干預(yù)胃癌MGC-803細(xì)胞,觀察其對胃癌細(xì)胞增殖的影響,并探討其誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機制。

    1 實驗材料

    1.1 細(xì)胞株

    胃癌MGC-803細(xì)胞,北京協(xié)和腫瘤研究所。

    1.2 主要試劑與儀器

    高糖DMED培養(yǎng)基(健順生物公司),胎牛血清(杭州四季青公司),阿魏酸(上海紫一試劑廠),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司),PCR擴增試劑盒(上海柏業(yè)生物公司),一抗兔抗Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Xiap和GAPDH(Affinity公司),二抗(Immunoway生物公司),噻唑藍(lán)(MTT,北京索來寶科技有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(力康公司),低溫離心機(Beckman公司),電泳儀(北京六一儀器廠),微量上樣器(上海生工生物工程有限公司)。

    2 實驗方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    用含10%FBS高糖DMEM,加入青霉素100 U/mL、鏈霉素1 mg/mL,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞。每隔2 d換完全培養(yǎng)基,待細(xì)胞密度達(dá)90%時按1∶2比例傳代。取對數(shù)期細(xì)胞用于下一步實驗。

    2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖

    取對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞計數(shù),按照5×103個/mL密度接種于96孔板,每孔100 μL(另設(shè)只加PBS的空白調(diào)零孔),每組8孔,37 ℃孵育過夜。正常組加100 μL DMEM完全培養(yǎng)基,藥物組加80 μL DMEM完全培養(yǎng)基及藥物20 μL,使終體積為200 μL。藥物作用24、48、72 h后各組每孔加20 μL MTT,繼續(xù)孵育4 h,小心吸去上清液,每孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO),振蕩10 min,于酶標(biāo)儀波長490 nm處檢測各孔光密度(OD)值,計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=1-(實驗組平均值÷對照組平均值)×100%。

    2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

    不同濃度阿魏酸(0、5、7.5、10 mg/mL)作用于對數(shù)期MGC-803細(xì)胞48 h,用胰酶消化并收集細(xì)胞,用PBS洗滌細(xì)胞并吹打成細(xì)胞懸液,取部分細(xì)胞懸液加入Binding Buffer,再加5 μL Annexin V混勻后,加5 μL碘化丙啶混勻,室溫、避光反應(yīng)10 min,流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

    2.4 RT-qPCR檢測Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)

    不同濃度阿魏酸(0、5、7.5、10 mg/mL)作用于對數(shù)期MGC-803細(xì)胞48 h,提取各加藥組和對照組(只加培養(yǎng)液)的總RNA,37 ℃、15 min,85 ℃、5 s反轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR引物均由大連寶生物公司合成(見表1)。擴增條件:95 ℃、10 min,95 ℃、15 s,60 ℃、30 s,40個循環(huán)擴增,RT-qPCR檢測Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá),實驗重復(fù)3次。PCR反應(yīng)結(jié)束后分析融解曲線,從而判定擴增產(chǎn)物是否有非特異性擴增;分析擴增曲線,計算Ct值,2?ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。

    不同濃度阿魏酸(0、5、7.5、10 mg/mL)作用于對數(shù)生長期MGC-803細(xì)胞干預(yù)48 h,加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)提取總蛋白,將蛋白煮沸變性后,經(jīng)8%SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1.5 h,一抗(Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax和Xiap)孵育過夜,TBST洗膜3次,二抗孵育2 h,TBST洗膜3次,加入ECL于Bio-rad凝膠成像儀中進(jìn)行反應(yīng),采用美國Image J2x軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行定量分析,灰度值以累積吸光度值表示,結(jié)果以目的蛋白與GAPDH累積吸光度的比值表示。

    3 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示,經(jīng)正態(tài)性檢驗,均服從正態(tài)分布,組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    4 結(jié)果

    4.1 阿魏酸對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響

    與對照組比較,5、7.5、10、12.5 mg/mL阿魏酸作用胃癌MGC-803細(xì)胞各時點OD值明顯降低,阿魏酸各劑量組抑瘤作用明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05,P<0.01),并與濃度呈正相關(guān),見表2。阿魏酸作用胃癌MGC-803細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為12.93、9.73、5.52 mg/mL。

    4.2 阿魏酸對胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可明顯誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞發(fā)生凋亡,見圖1。其細(xì)胞凋亡率分別為(22.47±3.20)%、(47.45±8.76)%、(74.55±10.34)%,較對照組(2.50±0.42)%明顯升高。

    4.3 阿魏酸對胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax和Xiap mRNA表達(dá)的影響

    與對照組比較,5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可使胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA表達(dá)上調(diào),Bcl-2和Xiap mRNA表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.001),溶解曲線分析表明擴增產(chǎn)物特異性好。結(jié)果見表3。

    4.4 阿魏酸對胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax和Xiap蛋白表達(dá)的影響

    與對照組比較,5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可使胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)不同程度上調(diào),Bcl-2和Xiap蛋白表達(dá)不同程度下調(diào)(P<0.05,P<0.001)。結(jié)果見表4、圖2。

    5 討論

    細(xì)胞凋亡是一種有序的或程序性的死亡方式,受多種基因調(diào)控,是細(xì)胞核受某些特定信號刺激后進(jìn)行的正常生理反應(yīng)。細(xì)胞凋亡途徑包括線粒體凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號途徑、死亡受體途徑。細(xì)胞凋亡的啟動和進(jìn)行受到精確調(diào)控,具有獨特而復(fù)雜的信號傳導(dǎo)系統(tǒng),其中,Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的2個成員,通常以復(fù)合物的形式存在。前者為促凋亡因子,后者為抗凋亡因子,在細(xì)胞凋亡過程,促凋亡蛋白Bax可促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)變而開放,進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜電位的下降,細(xì)胞色素C釋放,進(jìn)而激活Caspase,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡??沟蛲龅鞍譈cl-2則可拮抗Bax的上述作用而抑制細(xì)胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中最重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者之一,在蛋白酶級聯(lián)切割過程中處于核心位置,一旦Caspase被激活就會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。它可以通過死亡受體介導(dǎo)途徑與線粒體依賴途徑來誘發(fā)細(xì)胞凋亡,Caspase-9屬于上游起始Caspase,主要在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑中活化從而激活效應(yīng)Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。

    Xiap充當(dāng)?shù)蛲鲆种频鞍?,并可能與通過其BIR2和BIR3結(jié)構(gòu)域與Caspase-9的相互作用,抑制其活化并因此激活下游Caspase-3[4]。相關(guān)研究表明,使用siRNA技術(shù)沉默Xiap基因后,可抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長,并增加細(xì)胞死亡[5];增強骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素、順鉑的敏感度[6],增加白血病細(xì)胞[7]和膀胱癌細(xì)胞[8]對阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感度。慢病毒介導(dǎo)的shRNA沉默Xiap基因后在體外和體內(nèi)抑制SW1990胰腺癌細(xì)胞的增殖[9]。

    本實驗結(jié)果顯示,5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可使MGC-803胃癌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax的mRNA和蛋白表達(dá)不同程度上調(diào),Bcl-2和Xiap的 mRNA和蛋白表達(dá)不同程度下調(diào),表明阿魏酸可能通過Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的改變進(jìn)而通過上述途徑導(dǎo)致線粒體膜電位下降,細(xì)胞色素C釋放,Caspase-9和Caspase-3激活,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此,阿魏酸誘導(dǎo)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡通過線粒體途徑發(fā)揮作用。阿魏酸及其鈉鹽發(fā)揮抗腫瘤作用涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、化療增敏、抗血管生成等多個方面[10],其中誘導(dǎo)凋亡是阿魏酸發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑之一,而其他作用機制仍有待進(jìn)一步研究。

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