正交設(shè)計(jì)優(yōu)選白洋淀蘆根中阿魏酸的提取工藝

李洪　張靜　王麟　王曉欣　高玉梅

【摘 要】目的：正交設(shè)計(jì)優(yōu)選白洋淀蘆根中阿魏酸甲醇回流法最佳提取工藝。方法：用正交實(shí)驗(yàn)法，以阿魏酸含量為考察指標(biāo)，對(duì)甲醇濃度、回流次數(shù)、甲醇用量等影響因素進(jìn)行研究，優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果：最佳工藝為加10倍量70%甲醇，回流提取2次，每次45分鐘。結(jié)論：用該工藝提取效率高穩(wěn)定性好，為從白洋淀蘆根中提取阿魏酸提供了參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】阿魏酸；正交試驗(yàn)；白洋淀蘆根；提取工藝

0 引言

蘆根為禾本科植物蘆葦新鮮或者干燥根莖[1]，它性寒、味甘，入肺、胃經(jīng)，具有清熱瀉火、生津止渴、除煩、止嘔、利尿之功效，臨床常用于熱病煩渴，肺熱咳嗽，肺癰吐痰，胃熱嘔吐，熱淋澀痛等癥的治療。蘆根作為中國(guó)傳統(tǒng)藥物，在中醫(yī)臨床治療中有著廣泛的應(yīng)用[2-3]。而白洋淀地區(qū)的蘆葦資源豐富，自古就有“蘆葦之鄉(xiāng)，甲于河北”的美譽(yù)。該地區(qū)出產(chǎn)的蘆根產(chǎn)量大、質(zhì)量好，作為河北省特色藥材，是北方地區(qū)蘆根藥材的重要來(lái)源之一。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前關(guān)于蘆根藥材的質(zhì)量控制研究較少，主要是以阿魏酸的高效液相含量測(cè)定和藥材HPLC指紋圖譜為主[4-6]，而關(guān)于白洋淀地區(qū)蘆根的研究更是未見報(bào)道，缺乏白洋淀蘆根相關(guān)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及方法。本研究通過以阿魏酸為指標(biāo)，采用高效液相色譜（HPLC）法，觀察不同提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑用量及提取溶劑的濃度對(duì)白洋淀蘆根中阿魏酸提取的影響，選取最佳提取工藝，為白洋淀蘆根的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀Agilent 1100（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；CX-250型超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）；電熱恒溫水浴鍋（天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）；賽多利斯BS210S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；乙醇濃度檢測(cè)儀（河北省河間市宏利儀表廠）；白洋淀蘆根（購(gòu)自安國(guó)金康迪中藥飲片廠）；乙腈、甲醇為色譜純；水為屈臣氏蒸餾水；阿魏酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110773-200813）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈-水溶液（26：2：72）；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；流速：1.0 mL/min。

1.2.2 考察因素選取

白洋淀蘆根中主要活性成分阿魏酸易溶于甲醇[4]，因此確定甲醇為提取溶劑，以阿魏酸為檢測(cè)指標(biāo)，觀察提取時(shí)間、提取次數(shù)、甲醇用量（相對(duì)于藥材質(zhì)量）及甲醇濃度為考察因素，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平層次（見表1），采用4因素3水平8次[L9（34）]正交試驗(yàn)進(jìn)行研究測(cè)定。

表1 相關(guān)因素的3個(gè)水平層次劃分表

1.2.3 供試品溶液制備

按處方比例分別稱取5種中藥材，放入具塞錐形瓶中，精密稱重，分別用規(guī)定濃度的甲醇按照正交設(shè)計(jì)進(jìn)行超聲提取9次，放涼，再用同等濃度甲醇補(bǔ)足重量，定容，稱重，合并提取液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，備用。

1.2.4 對(duì)照品溶液制備

精密稱取阿魏酸對(duì)照品7.20mg，置100mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻；從中精密吸取5mL至10mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，作為阿魏酸對(duì)照品溶液。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取對(duì)照品溶液1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL注入液相色譜儀，按1.2.1項(xiàng)色譜條件下記錄色譜圖，測(cè)定峰面值。以阿魏酸素峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，做線性回歸，得回歸方程：Y=7.73×104X-1.84×104，r=0.999 9。結(jié)果表明，阿魏酸對(duì)照品在0.038-0.38μg的范圍內(nèi)進(jìn)樣量和峰面積與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.6 樣品測(cè)定

精密吸取供試品溶液15 μL，注入高效液相色譜儀，按1.2.1項(xiàng)色譜條件下記錄色譜圖，測(cè)定其峰面積值。

2 結(jié)果及分析

2.1 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

注：F0.05（2，2）= 19.00； F0.01（2，2）= 99.00

由表2、表3可見，以阿魏酸為指標(biāo)，對(duì)白洋淀蘆根中阿魏酸提取工藝因素影響大小是：A> D > B > C，A因素對(duì)提取工藝影響最大，即提取時(shí)間，B、C、D因素因素在實(shí)驗(yàn)水平上的影響無(wú)顯著意義。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白洋淀蘆根中阿魏酸的提取工藝最佳條件：A2 B2 C3 D2，即采用10倍藥材量的70%乙醇，提取2次，每次45 min。

2.2 工藝驗(yàn)證

取白洋淀蘆根適量，按照最佳工藝條件確定的提取時(shí)間、提取次數(shù)、乙醇用量及濃度，平行試驗(yàn)測(cè)定3組（見表4）。

表4 工藝驗(yàn)證

由表4可見，本方法檢驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3 討論

本研究選取阿魏酸為測(cè)定白洋淀蘆根的觀測(cè)指標(biāo)，采用HPLC法檢測(cè)，以甲醇為提取試劑。取適量阿魏酸對(duì)照品，加甲醇制成溶液，用紫外分光光度計(jì)掃描，結(jié)果在320 nm處有最大吸收，參考2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》，確定檢測(cè)波長(zhǎng)是320 nm。經(jīng)L9（34）正交試驗(yàn)得出影響白洋淀蘆根中阿魏酸提取工藝的因素：提取時(shí)間>提取次數(shù)>乙醇用量>乙醇濃度，提取時(shí)間因素對(duì)提取工藝影響最大。冠心2號(hào)凍干粉針劑最佳提取工藝條件為：用藥材10倍量75%的乙醇，提取2次，每次45min。本方法簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確可靠，可用于白洋淀蘆根的質(zhì)量控制與檢測(cè)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：152-153.

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[責(zé)任編輯：楊玉潔]