豬源益生芽孢桿菌的分離鑒定與生物學(xué)特性分析

蔣佳璇 王淑京 任志鴻 杜華茂*

(1.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶400715；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

?

豬源益生芽孢桿菌的分離鑒定與生物學(xué)特性分析

蔣佳璇1王淑京2任志鴻2杜華茂1*

(1.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶400715；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

本研究旨在從健康豬腸道正常菌群中篩選出性能良好的芽孢桿菌，以用于提高飼料利用率、減少豬消化道感染及減少感染后抗生素的使用。本研究精選重慶偏遠(yuǎn)山區(qū)從未添食配合飼料且生產(chǎn)性能優(yōu)良的經(jīng)產(chǎn)母豬，從其新鮮糞便中分離耐酸、耐膽鹽的芽孢桿菌，進(jìn)一步篩選能同時(shí)產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的菌株，最后進(jìn)行生化鑒定和基于16S rDNA序列的分子鑒定。結(jié)果表明，試驗(yàn)共篩選出7株能同時(shí)分泌淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶的芽孢桿菌，它們?cè)趐H 3.0條件下處理2 h存活率為30%～90%，在0.5%膽鹽中處理2 h存活率為40%～100%。經(jīng)生化鑒定與分子鑒定為1株嗜熱脂肪芽孢桿菌，1株地衣芽孢桿菌，5株枯草芽孢桿菌。由結(jié)果可知，本研究篩選的7株芽孢桿菌能耐受低pH和高膽鹽環(huán)境，且具備同時(shí)分泌淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶3種胞外酶的能力。

益生菌；芽孢桿菌；生化鑒定；16S rDNA；產(chǎn)酶能力

抗生素濫用引發(fā)的耐藥菌及超級(jí)耐藥菌株嚴(yán)重威脅著人類的健康，開(kāi)發(fā)微生物添加劑是替代飼料抗生素的重要方向。我國(guó)于2013年批準(zhǔn)了34種可直接添加的微生物，美國(guó)食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)42種，其中芽孢桿菌占6種[1]。芽孢桿菌類益生菌除生物占位及生物奪氧作用抑制病原性細(xì)菌外，還通過(guò)其在腸道內(nèi)產(chǎn)生多種水解酶類及生長(zhǎng)刺激因子等提高飼料利用率，從而促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)。葉光斌等[2]用平板法測(cè)得豬源芽孢桿菌3種酶的透明圈直徑/菌落直徑(D/d)值在2～4。唐麗江等[3]、謝鳳行等[4]從土壤分離芽孢桿菌并評(píng)價(jià)產(chǎn)淀粉酶活性，用誘變育種提高其產(chǎn)酶能力，使D/d值翻1倍?，F(xiàn)有報(bào)道篩選的芽孢桿菌多是具有某1種或2種酶的產(chǎn)生能力，同時(shí)具備分泌多種胞外酶能力的芽孢桿菌尚未作研究。能同時(shí)分泌淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶3種胞外酶的芽孢桿菌能更大限度地發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)效果。本研究擬從偏遠(yuǎn)山區(qū)農(nóng)戶未飼用混合飼料且生產(chǎn)性能優(yōu)良的經(jīng)產(chǎn)母豬糞便中篩選出對(duì)低pH和高膽鹽有較好的耐受性，且同時(shí)產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的芽孢桿菌菌株，為飼用益生菌專一性制劑產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮糞便，采自重慶北碚散戶飼養(yǎng)的太湖母豬。

參考菌株S1-2，來(lái)自富硒-枯草芽孢桿菌飼料添加劑(活菌數(shù)5×1010CFU/g，神微生物菌種科技有限公司)。

LB培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基、牛膽鹽、鹽酸。API50CHB/E和API50CH(北京威泰科生物技術(shù)有限公司)、DNA提取試劑盒(北京擎科生物新業(yè)生物技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芽孢桿菌的初篩

取少量糞便標(biāo)本解凍，震蕩混勻后分裝。取1份糞便樣品于80 ℃水浴15 min，梯度稀釋后涂布于LB瓊脂平板，每板50 μL，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h后挑取不同單菌落純化2代。

1.2.2 耐酸及耐膽鹽試驗(yàn)

挑取生長(zhǎng)旺盛的單菌落到1 mL LB培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩(120 r/min)培養(yǎng)6 h后，按5%的接種量轉(zhuǎn)入pH 3.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，對(duì)照組為pH 7.0的PBS，2 h后將菌液進(jìn)行梯度稀釋涂板，每個(gè)梯度2個(gè)重復(fù)。于37 ℃培養(yǎng)18 h后進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)并按下式計(jì)算存活率。

存活率(%)=(試驗(yàn)組菌落數(shù)/

對(duì)照組菌落數(shù))×100。

挑取耐酸試驗(yàn)存活率高于40%的菌株進(jìn)行耐膽鹽試驗(yàn)。將培養(yǎng)了6 h后的菌液按5%的接種量轉(zhuǎn)入含0.5%牛膽鹽的LB培養(yǎng)基中，對(duì)照組不添加膽鹽。培養(yǎng)24 h后將菌液梯度稀釋后涂板，每個(gè)梯度2個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)18 h后取出平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率，計(jì)算方法同上。

1.2.3 產(chǎn)酶試驗(yàn)

1.2.3.1 產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn)

按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，主要方法如下：用無(wú)菌牙簽蘸取單菌落點(diǎn)種于淀粉平板上，每株菌3個(gè)重復(fù)點(diǎn)，1個(gè)純水對(duì)照點(diǎn)。于37 ℃培養(yǎng)24 h后加入1 mL的碘液使均勻覆蓋平板，4 ℃靜置10 min后分別測(cè)量透明圈直徑(D)及菌落直徑(d)，計(jì)算透明圈直徑/菌落直徑(D/d)值，取平均值。

1.2.3.2 產(chǎn)纖維素酶試驗(yàn)

按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，主要方法如下：將待測(cè)菌株點(diǎn)種于羧甲基纖維素鈉平板上，每株菌3個(gè)重復(fù)點(diǎn)，1個(gè)純水對(duì)照點(diǎn)。于37 ℃培養(yǎng)24 h后，先用0.2%剛果紅染色30 min，然后依次用蒸餾水和1 mol/L NaCl徹底洗去染液，每次洗脫時(shí)間為5 min，再用5%醋酸固定顏色5 min。分別測(cè)量D和d，計(jì)算D/d值，取平均值。

1.2.3.3 產(chǎn)蛋白酶試驗(yàn)

按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，主要方法如下：將待測(cè)菌株點(diǎn)種于酪素平板上，每株菌3重復(fù)點(diǎn)，1個(gè)純水對(duì)照點(diǎn)。于37 ℃培養(yǎng)48 h后取出。分別測(cè)量D和d，計(jì)算D/d值，取平均值。

1.2.4 分離菌株的耐酸與耐膽鹽能力

為了篩選到更適合生產(chǎn)應(yīng)用的菌株，將能產(chǎn)3種酶的菌株再作進(jìn)一步的耐酸性分析，測(cè)定其在pH 2.0、2.5、3.0條件下處理2 h后的存活率。同時(shí)復(fù)檢其對(duì)0.5%膽鹽的耐受性。

1.2.5 生化鑒定

選擇3種產(chǎn)酶試驗(yàn)中D/d值大于1且D-d值大于2 mm的菌株進(jìn)行微生物學(xué)鑒定。

將各株分離菌在LB平板培養(yǎng)18 h，挑取幾個(gè)一致的菌落在API50CHB/E培養(yǎng)安瓿中制成菌懸液，濁度相當(dāng)于2 MCF。貼壁加1滴菌懸液到API50CH試劑條的每個(gè)反應(yīng)孔中，再加1滴礦物油進(jìn)行封閉，放置于37 ℃培養(yǎng)箱，觀察并記錄24、48 h的生化反應(yīng)結(jié)果，根據(jù)API細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定系統(tǒng)判定結(jié)果具體操作方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 16S rDNA序列分析

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照革蘭氏陽(yáng)性菌基因組DNA的提取方法提取各菌株的基因組DNA。按文獻(xiàn)[7]進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rDNA，引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR產(chǎn)物送擎科公司(北京)進(jìn)行雙向測(cè)序。

將所測(cè)序在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得相似性大于99%的菌株及序列。應(yīng)用軟件MEGA 6.0以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用軟件SPSS 19.0對(duì)D/d值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選擇LSD法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05、P<0.01分別表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果與分析

將9個(gè)樣品進(jìn)行80 ℃水浴15 min后涂板，培養(yǎng)24 h共挑出52株菌。將這些菌株和參考菌株S1-2在pH 3.5條件下處理2 h，在0.5%膽鹽條件下處理24 h后，篩選出耐酸、耐膽鹽存活率均大于40%的細(xì)菌共13株，以供產(chǎn)酶能力的檢測(cè)。

2.1 產(chǎn)酶能力

采用透明圈法定性檢測(cè)菌株產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的能力，若有透明圈產(chǎn)生，則說(shuō)明該菌株能產(chǎn)生該酶。D/d值反映了產(chǎn)酶能力的大小，若D/d值大于1，則表示此菌具備向胞外分泌該酶的能力，D/d值越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

A：淀粉酶 amylase；B：纖維素酶 cellulase；C：蛋白酶 protease。

1：P1.1-4；2：P1.1-10；3：P1.2-1；4：P1.2-3；5：P1.3-1；6：P1.3-5；7：P1.4-2。

圖1 產(chǎn)酶試驗(yàn)結(jié)果圖

Fig.1 Image of enzyme production experiment

商品化參考菌株S1-2及7株分離菌(P1.1-4、P1.1-10、P1.2-1、P1.2-3、P1.3-1、P1.3-5、P1.4-2)能同時(shí)產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶(圖1)。各菌的透明圈大小不一，初步說(shuō)明菌株之間產(chǎn)酶能力存在差異。其余6株菌因?yàn)椴煌瑫r(shí)表達(dá)3種酶，未在文中列出。但值得一提的是菌株S1.1-10，雖然不產(chǎn)生淀粉酶，但其產(chǎn)蛋白酶的D/d值是菌株S1-2的3倍。

測(cè)量各菌株的D和d，并計(jì)算兩者的比值，由3次試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差并進(jìn)行多重比較(表1)。由表1可知，所分離的7株芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶水平與S1-2沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。就淀粉酶而言，P1.1-10、P1.2-1、P1.2-3、P1.3-1、P1.3-5與S1-2沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，P1.4-2的產(chǎn)酶量顯著低于S1-2(P<0.05)，而P1.1-4的產(chǎn)酶量極顯著高于S1-2(P<0.01)。分離的菌株有較強(qiáng)產(chǎn)蛋白酶的能力，其中P1.1-10、P1.3-1產(chǎn)酶量高于S1-2，差異極顯著(P<0.01)，P1.2-1、P1.2-3產(chǎn)酶量顯著高于S1-2(P<0.05)。其余3株菌與S1-2沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。由此看來(lái)，沒(méi)有一株菌能同時(shí)高產(chǎn)3種酶，所以今后的益生菌制劑需要采取將幾種菌配合使用。

2.2 對(duì)酸性條件及膽鹽的耐受性

動(dòng)物胃中的pH在2.0～4.0之間，食物在胃中的排空時(shí)間為2～4 h。我們進(jìn)一步考察7株能同時(shí)分泌3種酶的細(xì)菌在pH 2.0、2.5、3.0條件下處理2 h后的存活率。隨著pH的降低，7株菌存活率有不同程度地下降(圖2)，在pH 2.0極端條件下處理2 h后，仍然有存活細(xì)菌(圖中未給出)。這7株菌對(duì)酸的耐受能力差異較大，P1.1-4和P1.4-2耐受能力較強(qiáng)，在pH 3.0時(shí)有較高存活率且明顯大于參考菌株S1-2。

經(jīng)0.5%膽鹽培養(yǎng)基處理2 h后，S1-2、P1.2-3、P1.4-2的存活率分別為33.6%、40.0%、84.4%。其他5株菌100%存活，表現(xiàn)出不同程度地生長(zhǎng)，其中P1.1-4和P1.2-1的菌數(shù)翻了1倍(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.3 生化鑒定及16S rDNA分子鑒定

根據(jù)API鑒定系統(tǒng)，將P1.2-1鑒定為B.stearothermophilus，P1.3-5鑒定為B.licheniformis。雖然對(duì)谷氨酸和D-龍膽二糖等的發(fā)酵反應(yīng)并不一致，系統(tǒng)將P1.1-4、P1.1-10、P1.2-3、P1.3-1、P1.4-2及S1-2都鑒定為B.subtilis(表3)。API鑒定系統(tǒng)還規(guī)定，生化反應(yīng)鑒定百分率(Id)高于80%才有意義，若低于80%則需重新鑒定；T指數(shù)表示菌的典型性，T指數(shù)越高則菌越典型。從Id值及T指數(shù)來(lái)看，將S1-2鑒定為B.subtilis屬于“極好”的鑒定，滿足Id≥99.9%，T指數(shù)≥0.75的條件；對(duì)P1.2-3及P1.4-2的鑒定屬于"很好"，滿足99.0%≤Id≤99.8%，T指數(shù)≥0.75的條件；對(duì)P1.3-1鑒定結(jié)果為基本可信，其他鑒定結(jié)果屬于"好"，滿足90.9%≤Id≤98.9%，T指數(shù)≥0.25的條件。總之，對(duì)8株菌的鑒定結(jié)果是有意義的，是可信的。

表1 透明圈直徑/菌落直徑值

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

圖2 7株菌在不同pH條件下耐受2 h和高膽鹽條件下耐受24 h后的存活率

菌株Strains有意義的分類單位Meaningfulclassificationunit鑒定百分率Identification/%T指數(shù)T-indexS1-2Bacillussubtilis99.90.79P1.1-4Bacillussubtilis98.10.77P1.1-10Bacillussubtilis99.90.49P1.2-1Bacillusstearothermophilus96.20.50P1.2-3Bacillussubtilis99.60.85P1.3-1Bacillussubtilis80.10.95P1.3-5Bacilluslicheniformis97.20.83P1.4-2Bacillussubtilis99.60.82

通過(guò)對(duì)7株備選株的16S rDNA測(cè)序進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(未提供)，結(jié)果顯示7株菌的16S rDNA序列均與芽孢桿菌相似性極高，但親緣關(guān)系較近的種與生化鑒定的種并不完全一致。如表4所示，與S1-2、P1.1-10、P1.3-1和P1.4-2最近的種是B.subtilis，與API鑒定結(jié)果一致，其他4株菌則不同。

表4 16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果

3 討 論

3.1 樣品來(lái)源

由于益生菌具有種屬特異性，所以選用豬糞便作為芽孢桿菌的分離材料以備后續(xù)豬飼料添加劑之用。據(jù)Lu等[8]報(bào)道，運(yùn)用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)比較分析仔豬和育肥豬在飼喂天然飼養(yǎng)和合成飼料時(shí)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明天然飼養(yǎng)條件下腸道菌群種類更為豐富且致病菌的比例更低。Alexopoulos等[9]報(bào)道，地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌益生菌添加劑不僅降低了母豬產(chǎn)后體重驟減的幅度，提高母豬產(chǎn)后進(jìn)食率和產(chǎn)奶量，降低母豬泌乳障礙綜合征的發(fā)生率，而且減少了仔腹瀉的發(fā)生，使體重增加，并最終提高了仔豬的存活率。對(duì)于芽孢桿菌的抗菌活性，Ye等[10]的研究結(jié)果表明腸道中的芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、志賀氏菌等都有不同程度的抑制作用，可作為主要研究菌種來(lái)開(kāi)發(fā)。所以本次試驗(yàn)選擇偏遠(yuǎn)山區(qū)農(nóng)戶未飼用混合飼料且生產(chǎn)性能優(yōu)良的經(jīng)產(chǎn)母豬，擬從其健康的腸道菌群中分離出適合作飼料添加劑的益生性芽孢桿菌。

3.2 耐酸耐膽鹽能力分析

飼用益生菌中的乳酸桿菌、鏈球菌等胃腸道固有菌類營(yíng)養(yǎng)要求較高，生長(zhǎng)條件苛刻，不適用于工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)[11]。而芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)要求低，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，作為益生菌可提高飼料的消化性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且對(duì)胃酸、膽汁、輻射等惡劣條件有很強(qiáng)的抵抗力，獲得的芽孢休眠體穩(wěn)定性能好，可在腸道中萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞參與腸道菌群與有害菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生存空間，并可刺激免疫系統(tǒng)改善宿主功能。本次研究篩選的7株能同時(shí)分泌淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶的菌株對(duì)pH 3.0的耐受性能達(dá)到2 h內(nèi)30%～90%的存活率，且大多數(shù)在0.5%膽鹽中100%存活，有2株菌還能繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖。因此，這幾株菌作為微生物添加劑是可以發(fā)揮生物占位和生物奪氧作用的。

3.3 產(chǎn)酶性能

所有菌株產(chǎn)淀粉酶與纖維素酶的能力普遍較低，D/d值在1～2左右，P1.1-4最大，也僅為2.03。令人可喜的是，有4株分離菌株產(chǎn)蛋白酶的能力很強(qiáng)，D/d值達(dá)到6～7之間，是葉光斌等[2]報(bào)道菌株的2～3倍。P1.1-10分離株產(chǎn)蛋白酶最強(qiáng)，D/d值達(dá)到10，但它不表達(dá)淀粉酶。產(chǎn)酶透明圈的大小不能完全說(shuō)明酶活性的高低，所以透明圈小的菌株不一定酶活性低。從這次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，健康豬腸道的芽孢桿菌的理化特性存在很強(qiáng)的多樣性，不同菌株產(chǎn)同一種酶的能力差異很大。因此，調(diào)節(jié)腸道功能的微生態(tài)制劑，在耐酸耐膽鹽的前提下，要綜合考慮其產(chǎn)酶水平，將不同菌株按適當(dāng)?shù)谋壤浜喜拍苓_(dá)到對(duì)粗蛋白質(zhì)及碳水化合物的良好分解作用，尤其以提高粗蛋白質(zhì)的消化利用率最重要。

3.4 生化鑒定和分子鑒定

對(duì)于優(yōu)選的7株芽胞桿菌，我們采取2種方法進(jìn)行鑒定。其一是用梅里埃生化試劑條進(jìn)行49項(xiàng)生化反應(yīng)，其二是基于16S rDNA部分序列的分子鑒定，但鑒定結(jié)果并不完全一致，僅S1-2、P1.1-10、P1.3-1和P1.4-2都鑒定為B.subtilis。本文暫時(shí)采用API的生化鑒定結(jié)果，今后再做更全面的分子鑒定。生化鑒定結(jié)果與分子鑒定結(jié)果不相符的情況經(jīng)常發(fā)生，原因在于16S rDNA分子的進(jìn)化與用于酶鑒定的管家基因的進(jìn)化并不完全同步，也可能是所比對(duì)的16S rDNA序列長(zhǎng)度有限，不能很好地代表菌株的遺傳信息[12]。從這次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，健康豬腸道的芽孢桿菌存在很明顯的生物多樣性，但也存在菌群優(yōu)勢(shì)，本試驗(yàn)分離到5株枯草芽孢桿菌，1株嗜熱脂肪芽孢桿菌，1株地衣芽孢桿菌。寧豫昌等[13]從豬糞便中分離13株芽孢桿菌，其中有9株為枯草芽孢桿菌。據(jù)此初步認(rèn)為枯草芽孢桿菌為豬腸道的優(yōu)勢(shì)芽孢菌。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)高溫、耐酸和耐膽鹽試驗(yàn)分離對(duì)低pH和高膽鹽都有良好耐受性的菌株，再通過(guò)選擇性培養(yǎng)基透明圈試驗(yàn)從中篩選到7株能同時(shí)分泌淀粉酶、蛋白酶及纖維素酶3種胞外酶的優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)生化反應(yīng)和16S rDNA分子鑒定其均為芽孢桿菌屬。

致謝：

西南大學(xué)謝和芳教授對(duì)本文試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法和統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析提出了寶貴意見(jiàn)，在此深表謝意。

[1] 高林,白子金,馮波,等.微生物飼料添加劑研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志,2014,34(2):1-6.

[2] 葉光斌,王彩虹,熊俐,等.3株芽孢桿菌產(chǎn)酶性質(zhì)的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(7):240-242.

[3] 唐麗江,王振華,王迪.高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌菌株的篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(12):5362-5363,5371.

[4] 謝鳳行,趙玉潔,周可,等.產(chǎn)胞外淀粉酶枯草芽孢桿菌的分離篩選及其紫外誘變育種[J].華北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,24(3):78-82.

[5] ZHAO W,ZHENG J,WANG Y G,et al.A marked enhancement in production of amylase byBacillusamyloliquefaciensin flask fermentation using statistical methods[J].Journal of Central South University of Technology,2011,18(4):1054-1062.

[6] VIJAYARAGHAVAN P,ARUN A,AL-DHABI N A,et al.NovelBacillussubtilisIND19 cell factory for the simultaneous production of carboxy methyl cellulase and protease using cow dung substrate in solid-substrate fermentation[J].Biotechnology for Biofuels,2016,9:73.

[7] ASH C,FARROW J A E,WALLBANKS S,et al.Phylogenetic heterogeneity of the genusBacillusrevealed by comparative analysis of small-subunit-ribosomal RNA sequences[J].Letters in Applied Microbiology,1991,13(4):202-206.

[8] LU X M,LU P Z,ZHANG H.Bacterial communities in manures of piglets and adult pigs bred with different feeds revealed by 16S rDNA 454 pyrosequencing[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(6):2657-2665.

[9] ALEXOPOULOS C,GEORGOULAKIS I E,TZIVARA A,et al.Field evaluation of the efficacy of a probiotic containingBacilluslicheniformisandBacillussubtilisspores,on the health status and performance of sows and their litters[J].Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition,2004,88(11/12):381-392.

[10] YE X L,LI X G,YUAN LJ,et al.Relationship between the antibacterial and immunological activities of houttuyfonate homologues and their surface activities[J].Journal of Asian Natural Products Research,2006,8(4):327-334.

[11] HYRONIMUS B,MARREC C L,SASSI A H,et al.Acid and bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria[J].International Journal of Food Microbiology,2000,61(2/3):193-197.

[12] TOLBA O,EARLE J A P,MILLAR B C,et al.Speciation ofBacillusspp.in honey produced in Northern Ireland by employment of 16S rDNA PCR and automated DNA sequencing techniques[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2007,23(12):1805-1808.

[13] 寧豫昌,趙緒永,鄭鳴.豬源芽孢桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2012,39(9):65-68.

*Corresponding author, professor, E-mail: duhmao@swu.edu.cn

(責(zé)任編輯 武海龍)

Isolation, Identification and Biological Characterization ofBacillusspp from Swine

JIANG Jiaxuan1WANG Shujing2REN Zhihong2DU Huamao1*

(1. College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. National Institute for Communicable Diseases Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention, State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, Beijing 102206, China)

The aim of this project was to isolateBacillusspp with good performance from the normal intestinal flora of healthy swine, and to improve the feed utilization rate, reduce the infection of pig digestive tract and reduce the use of antibiotics. The feces specimen were collected from local back-yard cows which never feed with manufactured feeds, and theBacillusspp with acid and bile salt tolerance was isolated from fresh feces. The isolates were then tested for the production potency of amylase, cellulose and protease on specific agar plates. The strains were identified by biochemical assays and 16s rDNA sequence alignment analysis. The results showed that 7Bacillusstrains were isolated which could secrete amylase, cellulose and proteinase. The survival ratios ofBacillusstrains in pH 3.0 for 2 hours were 30% to 90%, and in 0.5% bile salt for 4 hours were 40% to 100%. The strains were identified asBacillusstearothermophiluc(1 strain),Bacilluslicheniformis(1 strain) andBacillussubtilis(5 strains) by biochemical identification and molecular identification, respectively. In conclusion, it selects 7 strains identifiedBacillusspp, which have good tolerance in low pH and high bile salt conditions, and the strains can secrete amylase, cellulose and proteinase.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(11)：3542-3548]

probiotics;Bacillusspp; biochemical identification; 16S rDNA; enzyme production capacity

2016-04-09

傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室留學(xué)歸國(guó)人員啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)(2011SKLlD301)

蔣佳璇(1992—)，女，重慶合川人，碩士研究生，從事微生物學(xué)方向研究。E-mail： jjx411uan@126.com

*通信作者：杜華茂，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： duhmao@swu.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.11.022

S811.6

A

1006-267X(2016)11-3542-07