虎奶菇產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化的研究

黃碧芳，付劍杰，林文雄

(福建農(nóng)林大學(xué)，福建 福州 350002)

目前草本生物質(zhì)能源數(shù)量巨大，但工農(nóng)業(yè)中草本資源的利用率很低，主要由于其自身組成復(fù)雜，特別是纖維素的結(jié)晶度、聚合度以及環(huán)繞著纖維素與半纖維素締合的木質(zhì)素鞘，木質(zhì)素與半纖維素以共價(jià)鍵形式結(jié)合，將纖維素分子包埋在其中，導(dǎo)致它的難降解性。菌草是經(jīng)過科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明適合用于栽培食 (藥)用菌的草本植物，包括芒萁、五節(jié)芒、象草等草本植物，也包括作物秸稈。食用菌能以菌草為原料，生長獲得可食用菌體，可見食用菌能夠有效分解并利用菌草資源。而利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶降解纖維素也是當(dāng)前生物質(zhì)能源的研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)前期已采用剛果紅鑒別培養(yǎng)基即酶活測定，從18種食用菌中篩選出虎奶菇。本實(shí)驗(yàn)嘗試以食 (藥)用真菌虎奶菇作為出發(fā)菌株，以菌草為碳源發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，研究產(chǎn)酶條件，為能源草資源能開發(fā)利用提供更全面的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

虎奶菇Pleurotus tuber-regium(Fr.)Singer，Pl0001來自福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基 (PDA)[1]:活化、保藏菌種;液體培養(yǎng)基(GPY)[2，3];

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基:菌草5 g、營養(yǎng)液 〔(NH4)2SO40.2%、MgSO40.05%、KH2PO40.01%、蛋白胨 0.2%、酵母粉0.2%〕，pH自然。

1.2 酶活測定方法

采用3，5－二硝基水楊酸比色定糖法 (DNS)[4，5]測定酶的活力。

1.2.1 CMC酶活的測定

酶活的定義:1 mL酶液于上述條件下，1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μmol葡萄糖量的酶量定義為 1 個(gè)酶活力單位 “IU”[6－9]。CMC酶活力E(U·mL－1)公式為:

式中:x為回歸方程所測得的還原糖量 (mg·mL－1);n為反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù);180為葡萄糖的相對分子質(zhì)量 (g·mol－1);30為酶液的反應(yīng)時(shí)間 (min)。

1.2.2 濾紙酶活 (FPA)的測定

酶活的定義:1 mL酶液于上述條件下，1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μmol葡萄糖量的酶量定義為 1個(gè)酶活力單位 “IU”[10－13]。FPA酶活力F(U·mL－1)公式為:

式中:x為回歸方程所測得的還原糖量 (mg·mL－1);n為反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù);180為葡萄糖的相對分子質(zhì)量 (g·mol－1);60為酶液的反應(yīng)時(shí)間 (min)。

1.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

將半試管保存菌株接入裝有100 mL GPY培養(yǎng)液中，150 r·min－1，30℃下振蕩培養(yǎng)3 d，作為種子液。

1.3.1 不同轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶的影響

以5%接種量接種至100 mL液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基內(nèi)，分別以 120 r·min－1、150 r·min－1、180 r·min－1、210 r·min－1培養(yǎng)4 d，測酶活。

1.3.2 不同培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

同上接種，分別置于25℃、30℃、35℃、40℃的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)4 d，測酶活。

1.3.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株產(chǎn)酶的影響

同上接種，置于搖床分別培養(yǎng)4 d、5 d、6 d、7 d后測定酶活。

1.3.4 不同裝樣量對菌株產(chǎn)酶的影響

250 mL三角瓶分別裝入50 mL、75 mL、100 mL、125 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，并置于搖床中發(fā)酵培養(yǎng)，測酶活。

1.3.5 不同接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入種子培養(yǎng)液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL搖床發(fā)酵，測酶活。

1.3.6 初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響

調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH為5.8，6.4，7.0，7.5，再接入種子液置于搖床培養(yǎng)，測酶活。

1.3.7 不同氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

分別以酵母膏、蛋白胨、尿素、KNO3、NH4Cl和(NH4)2SO4(濃度均為0.5%)作為氮源，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，測酶活。

1.3.8 不同的常規(guī)碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

分別以CMC、可溶性淀粉和蔗糖作為碳源在優(yōu)化的條件下進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，測酶活。

1.3.9 不同的菌草碳源對菌株產(chǎn)酶的影響

分別以象草、巨菌草、五節(jié)芒、香根草、斑茅作為優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基碳源，搖床培養(yǎng)，測酶活。

1.3.10 菌草的不同添加量對菌株產(chǎn)酶的影響

1.3.9中得到的最適菌草碳源，按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%添加量作為碳源進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，測酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶的影響

不同轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶的影響見圖1。

由圖1數(shù)據(jù)顯示，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，虎奶菇產(chǎn)酶的CMC酶活有一定的提高，F(xiàn)PA酶活提高不大，這是液體培養(yǎng)基中的溶氧量增加的緣故。但轉(zhuǎn)速超過150 r·min－1后，菌株產(chǎn)酶的CMC和FPA酶活明顯下降，可能是轉(zhuǎn)速過高，造成機(jī)械損傷，影響了菌絲體的生長。

菌株在生長和產(chǎn)酶過程中要消耗氧氣，所以在產(chǎn)酶過程中應(yīng)保持振蕩來增加發(fā)酵液的溶氧濃度，而且振蕩還可以讓菌體與發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)充分接觸，使菌體獲得充足的營養(yǎng)成分。一般而言，搖床轉(zhuǎn)速的不同可能會(huì)影響到通氣量、營養(yǎng)代謝物和產(chǎn)物等的流動(dòng)速度，進(jìn)而影響到菌株的生長和產(chǎn)酶效果。轉(zhuǎn)速太低可能導(dǎo)致培養(yǎng)基中溶氧不足，影響菌體生長，進(jìn)而影響產(chǎn)酶;轉(zhuǎn)速太高可能機(jī)械剪切力過大，造成菌絲斷裂過度，破壞菌體與營養(yǎng)成分的粘附，也影響產(chǎn)酶效果[15]。

2.2 不同培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶效果的影響

不同培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶效果的影響見圖2。

如圖2所示，隨著溫度的提高虎奶菇產(chǎn)酶量明顯上升，在30℃時(shí)，CMC酶活和FPA酶活均達(dá)到最高，其后隨溫度的升高而降低，且降幅巨大，說明虎奶菇對溫度很敏感。

溫度是影響細(xì)胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一，虎奶菇細(xì)胞生長的最適溫度是28℃～32℃，與產(chǎn)酶最適溫度吻合，有利于對發(fā)酵產(chǎn)酶條件的控制。當(dāng)溫度低于虎奶菇生長的最適溫度時(shí)，使其細(xì)胞內(nèi)的酶代謝處于惰性狀態(tài)，進(jìn)而影響虎奶菇的能量和合成代謝，使纖維素酶的分泌減少。當(dāng)溫度高于虎奶菇生長的最適溫度時(shí)，會(huì)使其細(xì)胞內(nèi)的酶代謝受到高溫的抑制，同樣不利于纖維素酶的分泌[15]。

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株產(chǎn)酶效果的影響

不同培養(yǎng)時(shí)間對菌株產(chǎn)酶效果的影響見圖3。

由圖3可知，纖維素酶酶活力隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在發(fā)酵第4天時(shí)，酶活水平還相對較低，培養(yǎng)第5天時(shí)，菌體產(chǎn)酶水平大幅度提高，并且CMC酶活達(dá)到最大。在之后的培養(yǎng)時(shí)間里CMC酶活隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低。FPA酶活卻在第7天達(dá)到所測的最大值。但FPA酶活所增加的幅度遠(yuǎn)小于CMC酶活所降低的幅度，所以綜合2種酶活結(jié)果，選擇第5天進(jìn)行虎奶菇的酶活測定。

虎奶菇液體發(fā)酵時(shí)菌絲體收集的最佳時(shí)間是在6 d～10 d，由此可知在此之前虎奶菇的菌絲體是處于迅速生長的狀態(tài)，需要大量的碳源和能源供應(yīng)，這些都需要CMC的分解來提供。所以在這段時(shí)間適于測定纖維素酶產(chǎn)量及其酶活力。

2.4 不同裝樣量對菌株產(chǎn)酶效果的影響

不同裝樣量對菌株產(chǎn)酶效果的影響見圖4。

由圖4可知，培養(yǎng)液的裝樣量對虎奶菇的發(fā)酵產(chǎn)酶的影響不大。在一定范圍內(nèi)，不同的裝樣量會(huì)通過影響通氣量、發(fā)酵過程中的營養(yǎng)代謝物總量和產(chǎn)物濃度的阻遏效應(yīng)等一系列因素來造成不同的產(chǎn)酶效果，這是綜合因素導(dǎo)致的結(jié)果[16]。隨著培養(yǎng)基裝量的減少，溶氧量相對提高，促進(jìn)菌體生長，提高纖維素酶的產(chǎn)量。但裝樣量的減少會(huì)增大機(jī)械剪切力，造成菌絲斷裂過度，破壞菌體與營養(yǎng)成分的粘附，影響產(chǎn)酶效果。同時(shí)培養(yǎng)基裝樣量的減少也會(huì)造成菌株在生長時(shí)營養(yǎng)元素的不足，尤其是在發(fā)酵后期。這些應(yīng)該就是造成50 mL和75 mL的裝樣量的酶活小于100 mL裝樣量的原因。本實(shí)驗(yàn)采用的三角瓶容量是250 mL，裝樣量為125 mL已經(jīng)達(dá)到了容量的一半，不利于搖瓶培養(yǎng)，并且在100 mL裝樣量時(shí)虎奶菇有最高的CMC酶活，所以選擇100 mL作為最佳裝樣量。

2.5 不同接種量對菌株產(chǎn)酶效果的影響

不同接種量對菌株產(chǎn)酶效果的影響見圖5。

由圖5知接種量為5 mL和7 mL時(shí)酶活基本相同。因此從節(jié)約和降低污染的角度考慮，選擇最佳接種量為5 mL。1 mL時(shí)，由于接種量過少會(huì)導(dǎo)致菌體生長繁殖過慢，產(chǎn)酶活性降低，進(jìn)而在發(fā)酵液中纖維素酶數(shù)量較少，導(dǎo)致酶活力較低。

2.6 初始pH對菌株產(chǎn)酶效果的影響

初始pH對菌株產(chǎn)酶效果的影響見圖6。

由圖6可知，虎奶菇在培養(yǎng)基隨著初始pH值的升高，纖維素酶活呈現(xiàn)上升趨勢。當(dāng)初始pH值達(dá)6.4左右時(shí)，纖維素酶活力最大。在研究的范圍內(nèi)，確定產(chǎn)酶最適pH為6.4左右，pH過大或過小都會(huì)影響纖維素酶的發(fā)酵。

2.7 不同氮源對菌株產(chǎn)酶效果的影響

不同氮源對菌株產(chǎn)酶效果的影響見圖7。

由圖7可知有機(jī)氮源對虎奶菇的產(chǎn)酶有較大的影響，蛋白胨和酵母膏作為氮源其酶活遠(yuǎn)高于無機(jī)氮源的硝酸鉀、硝酸銨等。說明有機(jī)氮源可促進(jìn)虎奶菇對纖維素酶的合成。在有機(jī)氮源中酵母膏是最適合虎奶菇生長所需，酶活最高。

2.8 不同的常規(guī)碳源對菌株產(chǎn)酶效果的影響

不同的常規(guī)碳源對菌株產(chǎn)酶效果的影響見圖8。

如圖8所示，虎奶菇對3種常規(guī)碳源的利用率從高到低分別是可溶性淀粉、CMC、蔗糖。說明菌株在簡單碳源和復(fù)雜碳源的存在下都可以生長和產(chǎn)酶，不需要專門的誘導(dǎo)物也可以合成少量組成型的纖維素酶。

2.9 不同的菌草碳源對菌株產(chǎn)酶效果的影響

不同的菌草碳源對菌株產(chǎn)酶效果的影響見圖9。

本實(shí)驗(yàn)選用菌草研究中心推廣種植的5種菌草研究對菌株虎奶菇產(chǎn)酶的影響。由圖9可知，其產(chǎn)酶能力有明顯差異，對象草的利用最高，說明象草可為產(chǎn)酶提供必要的營養(yǎng)因子，誘導(dǎo)虎奶菇產(chǎn)纖維素酶，提高發(fā)酵效率;同時(shí)與常規(guī)碳源 (圖8)相比象草更能夠促進(jìn)纖維素酶的產(chǎn)生。因此蔗糖等具有高度單一結(jié)晶結(jié)構(gòu)的碳源產(chǎn)酶效果不佳，產(chǎn)酶能力最差，CMC－Na等半合成纖維素衍生物碳源效果次之，而天然纖維素底物做為碳源產(chǎn)酶能力最高。說明虎奶菇更適合用天然纖維素做碳源。

2.10 菌草的不同添加量對菌株產(chǎn)酶效果的影響

菌草的不同添加量對菌株產(chǎn)酶效果的影響見圖10。

由圖10可知，在前期酶活隨象草添加量的增加而提高，在1%～2%時(shí)呈基本穩(wěn)定狀態(tài)，但隨著象草添加量的繼續(xù)增加，虎奶菇的纖維素酶活卻呈下降趨勢。說明含量在1%～2%的象草能夠滿足虎奶菇生長和進(jìn)行酶的合成，并且象草本身所含的化學(xué)物質(zhì)對虎奶菇的產(chǎn)酶促進(jìn)作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其抑制作用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用食用菌作為研究對象，由于食用菌栽培過程就以菌草為培養(yǎng)基，說明食用菌能夠較好的利用菌草這一可再生資源，這也就限定了選菌的范圍，造成了篩選出來的菌種在經(jīng)過產(chǎn)酶條件優(yōu)化后雖然擁有較高的菌草碳源的利用率但酶活力卻較低的結(jié)果，因此提高酶活將是今后研究降解菌草的中心。如本實(shí)驗(yàn)中所用酶液為未經(jīng)提純的初酶液，后期實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行提純處理，以提高酶活等。草本生物質(zhì)能源數(shù)量巨大，但利用率低，我們正努力嘗試，為其變廢為寶提供科學(xué)依據(jù)。

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