基質(zhì)內(nèi)木質(zhì)纖維素酶酶活及其產(chǎn)物變化*

袁勝東，羅 霞，余夢(mèng)瑤，魏 巍，江 南，許曉燕，鄭林用

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066;2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥與細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，四川 成都 610041;3.四川省萬(wàn)源市科學(xué)技術(shù)局，四川 成都 636350)

猴頭菌Hericium erinaceus是著名的食 (藥)用真菌，素有“蘑菇之王”的美稱。猴頭菌需分泌木質(zhì)纖維素酶類對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行降解，以生成還原糖類小分子物質(zhì)才能被菌絲吸收利用。食用菌的酶學(xué)研究在上世紀(jì)70年代至90年代研究的較多，其中以日本科學(xué)家關(guān)于香菇的酶學(xué)研究最多，也取得了大量的成果，發(fā)現(xiàn)食用菌酶活的變化規(guī)律與其生長(zhǎng)進(jìn)程有著緊密的聯(lián)系，還指出漆酶對(duì)子實(shí)體形成具有調(diào)控作用[2]。在食用菌營(yíng)養(yǎng)生理方面，也發(fā)現(xiàn)基質(zhì)內(nèi)葡萄糖的變化和食用菌生長(zhǎng)進(jìn)程相關(guān)。但目前所作研究主要集中在食用菌不同生長(zhǎng)階段，將基質(zhì)內(nèi)物質(zhì)視為均勻整體對(duì)其物質(zhì)及酶活變化進(jìn)行測(cè)定，還未查閱到關(guān)于基質(zhì)內(nèi)不同部位在生長(zhǎng)不同時(shí)期的酶活及物質(zhì)研究方面的報(bào)道。將基質(zhì)視為均勻整體忽略了在基質(zhì)內(nèi)部菌絲體可能處于不同生理階段和不同分化程度，以及基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的差異。本文針對(duì)這一不足從空間和時(shí)間兩個(gè)維度全面地研究了猴頭菌基質(zhì)內(nèi)還原糖含量和木質(zhì)纖維素酶酶活變化，以了解基質(zhì)內(nèi)部在不同時(shí)期代謝情況。同時(shí)結(jié)合木質(zhì)纖維素酶酶活和還原糖含量之間的相關(guān)性研究找出酶活變化與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

猴頭菌HE－3，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

1.2.1 母種活化培養(yǎng)基 (馬鈴薯綜合培養(yǎng)基)

馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、瓊脂20 g，水100 mL，pH自然。

1.2.2 原種培養(yǎng)基

棉籽殼78%、麥麩20%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%。

1.2.3 栽培基質(zhì) (栽培料)基本成分

棉籽殼79%、麥麩20%、石膏1%，含水量62%。

1.3 培養(yǎng)方法及條件

栽培料加水混勻后堆料過(guò)夜，次日裝袋 (菌袋規(guī)格14 cm×28 cm)，每袋濕重約570 g，高約為12 cm。于121℃滅菌2 h，冷卻后接原種。

菌袋在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，菌絲滿袋后移入菇棚，菇棚溫度16℃～24℃，濕度65%～80%。

1.4 取樣

如圖1、表1所示取樣。在菌絲長(zhǎng)至菌袋1/4、1/2、3/4、滿袋、滿袋后第5天、原基出現(xiàn)、子實(shí)體生長(zhǎng)第4天、子實(shí)體生長(zhǎng)第8天、采收、采收后第5天這10個(gè)時(shí)期取樣，編號(hào)1～10;取樣時(shí)基質(zhì)從上至下分為4等分，編號(hào)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。空白對(duì)照為未接種前基質(zhì) (編號(hào)0)。每次取3袋，按相同部位混勻，共取35個(gè)樣品，取樣后－80℃保存。

表1 取樣表

1.5 酶活及物質(zhì)含量測(cè)定

1.5.1 粗酶液提取

精確稱取2 g樣品，適當(dāng)研磨后裝入具塞三角瓶中，加水20 mL，于30℃水浴鍋中浸提2 h，4層紗布過(guò)濾，濾液定容至25 mL，8 000 r·m－1、12℃，離心10 min，上清液即為粗酶液，EP管分裝，－80℃保存。

1.5.2 木質(zhì)纖維素酶酶活測(cè)定

漆酶酶活測(cè)定參照饒慶隆[1]的方法，每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量為1個(gè)酶活單位，樣品重復(fù)測(cè)定2次，得2次平均值;羧甲基纖維素酶酶活測(cè)定參照周長(zhǎng)青[2]的方法，每克干樣30 min降解羧甲基纖維素納生成1 mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位;半纖維素酶酶活測(cè)定參照李江華等[3]的方法，每克干樣10 min降解木聚糖生成l mg木糖為1個(gè)酶活性單位。

1.5.3 還原糖含量測(cè)定

還原糖含量測(cè)定參照周長(zhǎng)青[2]的方法，重復(fù)測(cè)定3次，得3次平均值。

1.5.4 pH測(cè)定

參照《土壤農(nóng)化分析手冊(cè)》土壤的氯化鉀鹽浸提液pH(潛在酸)的測(cè)定[4]，由于菌質(zhì)吸水性強(qiáng)，用1∶1(W∶V)浸提時(shí)液體被菌質(zhì)完全吸收，故本研究用50 mL KCl浸提25 g菌質(zhì)。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析

采用Spss19.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 木質(zhì)纖維素酶酶活

2.1.1 漆酶酶活

漆酶酶活變化如圖2，其中“0”號(hào)樣品沒(méi)有檢測(cè)到酶活(圖上未顯示)。

圖2 漆酶酶活

從圖2看出，不同位置基質(zhì)的酶活在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程的變化趨勢(shì)基本一致，即在菌絲剛長(zhǎng)滿基質(zhì)時(shí)酶活較高隨后活性降低到一定水平，在采收后酶活有所上升;其中部位Ⅰ的變化趨勢(shì)有所不同，在原基形成時(shí)酶活急劇升高出現(xiàn)一個(gè)活性高峰。

2.1.2 羧甲基纖維素酶酶活

羧甲基纖維素酶酶活變化如圖3，其中“0”號(hào)樣品沒(méi)有檢測(cè)到酶活 (圖上未顯示)。

圖3 羧甲基纖維素酶酶活

由圖3可看出，不同部位基質(zhì)酶活變化趨于一致，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段酶活較低，呈緩慢上升趨勢(shì)，原基形成時(shí)形成一個(gè)活性小高峰，此后酶活略微下降，到采收時(shí)酶活達(dá)到最高，采收后酶活降低。其中部位Ⅰ的酶活在整個(gè)生長(zhǎng)階段都要低于其他部位。

2.1.3 半纖維素酶酶活

半纖維素酶酶活變化如圖4，其中“0”號(hào)樣品沒(méi)有檢測(cè)到酶活 (圖上未顯示)。

圖4 半纖維素酶酶活

從圖4可以看出，半纖維素酶活與羧甲基纖維素酶酶活變化規(guī)律趨于一致。

2.2 還原糖含量

還原糖含量變化如圖5。

圖5 還原糖含量

從圖5可看出，基質(zhì)內(nèi)不同部位還原糖含量變化趨于一致，在菌絲剛長(zhǎng)滿時(shí)含量較高，隨后含量逐漸降低，原基出現(xiàn)時(shí)含量達(dá)到低點(diǎn)，生殖生長(zhǎng)階段還原糖含量逐漸增加，到接近采收及采收時(shí)含量達(dá)到一定峰值，采收后含量降低。其中部位Ⅳ基質(zhì)含量略高，部位Ⅲ、部位Ⅱ、部位Ⅰ基質(zhì)含量逐次降低，部位Ⅰ基質(zhì)在原基形成后還原糖含量升高趨勢(shì)有所不同，采收時(shí)含量超過(guò)其他樣品。

2.3 pH值

pH值如表2所示。

表2 PH

從表2可看出，基質(zhì)長(zhǎng)滿菌絲后pH值從5.95降到4.6左右，各部位pH值相差不大且在不同時(shí)期變化不大，在生長(zhǎng)后期pH值有所降低，采收后降到最低。

2.4 相關(guān)性分析

偏相關(guān)結(jié)果分析顯示，以半纖維素酶酶活和羧甲基纖維素酶酶活為控制變量，漆酶酶活與還原糖含量呈中度相關(guān) (r=0.420，P=0.015);以半纖維素酶酶活和漆酶酶活為控制變量，羧甲基纖維素酶酶活與還原糖含量呈中度相關(guān) (r=0.346，P=0.049);以羧甲基纖維素酶酶活和漆酶酶活為控制變量，半纖維素酶酶活和還原糖含量無(wú)顯著相關(guān)性;pH值與上述酶活無(wú)顯著相關(guān)性;羧甲基纖維素酶酶活與半纖維素酶酶活呈極顯著相關(guān) (r=0.000，P=0.933)。

3 討論

基質(zhì)內(nèi)不同部位的木質(zhì)纖維素酶酶活和還原糖含量都有明顯的差異，在菌絲生長(zhǎng)活躍的區(qū)域 (Ⅰ－1、Ⅱ－2、Ⅲ－3、Ⅳ－4)表現(xiàn)出了較強(qiáng)的漆酶酶活和較高的還原糖含量，說(shuō)明在菌絲剛生成時(shí)木質(zhì)素降解反應(yīng)活躍，生成了大量的還原糖以提供其營(yíng)養(yǎng)需要。越靠近袋口的基質(zhì)表現(xiàn)出越低的酶活和較少的還原糖含量，部位Ⅰ基質(zhì)纖維素酶、半纖維素酶和還原糖含量都在相同時(shí)期基質(zhì)中數(shù)值最低。這可能是由于該部位最先長(zhǎng)滿菌絲，菌絲自身老化或者該部位菌絲經(jīng)過(guò)分化轉(zhuǎn)為生殖生長(zhǎng)進(jìn)行著不同的代謝反應(yīng)，也可能是由于基質(zhì)較早被酶分解利用導(dǎo)致基質(zhì)內(nèi)營(yíng)養(yǎng)含量減少?；|(zhì)內(nèi)不同部位還原糖含量在生殖生長(zhǎng)后期變化趨勢(shì)有所不同，最后呈現(xiàn)出上高下低的狀態(tài)，這可能與基質(zhì)內(nèi)部糖類轉(zhuǎn)移有關(guān)。

變化趨勢(shì)方面，基質(zhì)內(nèi)不同部位木質(zhì)纖維素酶酶活和還原糖含量變化趨勢(shì)基本相同，在猴頭生長(zhǎng)發(fā)育的幾個(gè)重要時(shí)期都有明顯的變化:在菌絲剛長(zhǎng)滿基質(zhì)時(shí)表現(xiàn)出較高的漆酶酶活和還原糖含量;幾種酶的酶活都在原基形成時(shí)出現(xiàn)活性高峰，還原糖含量在原基形成時(shí)含量降到最低谷;羧甲基纖維素酶、半纖維素酶以及還原糖含量都在采收時(shí)出現(xiàn)峰值。這些都說(shuō)明木質(zhì)纖維素酶酶活和還原糖含量的變化與猴頭菌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。其中漆酶酶活在原基出現(xiàn)時(shí)變化最為強(qiáng)烈，峰值最高，且該變化只出現(xiàn)在與原基形成位置直接相關(guān)的部位Ⅰ基質(zhì)，這也進(jìn)一步說(shuō)明漆酶與原基形成有著密切的聯(lián)系。采收后漆酶、羧甲基纖維素酶、纖維素酶酶活都有變化為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的趨勢(shì)，為下個(gè)周期的原基形成做準(zhǔn)備。

有報(bào)導(dǎo)顯示原基的形成與還原糖的大量消耗有關(guān)[5]，而還原糖是木質(zhì)纖維素酶類所催化反應(yīng)的終產(chǎn)物，為了了解木質(zhì)纖維素酶酶活與還原糖含量的關(guān)系，對(duì)木質(zhì)纖維素酶酶活與還原糖含量進(jìn)行了相關(guān)性分析。相關(guān)性分析顯示漆酶酶活、羧甲基纖維素酶酶活與還原糖含量呈中度相關(guān)，雖然半纖維素酶酶活與還原糖含量無(wú)顯著相關(guān)性，但半纖維素酶酶活與羧甲基纖維素酶酶活呈極顯著相關(guān)，半纖維素酶酶活能極大影響羧甲基纖維素酶酶活，這些說(shuō)明了還原糖的生成受到了木質(zhì)纖維素酶的影響，進(jìn)而對(duì)猴頭菌的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

溫度和pH值對(duì)酶活影響較大，但本次試驗(yàn)猴頭菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段在恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行溫度穩(wěn)定，生殖生長(zhǎng)階段在菇棚進(jìn)行，溫度變化在16℃～24℃之間，變化不是很大且不可控，故本次試驗(yàn)結(jié)果排除了溫度對(duì)酶活的影響。通過(guò)pH測(cè)定顯示樣品pH值在4.25～4.67之間變化，各部位pH值變化不大，相關(guān)性顯示pH值未能對(duì)酶活產(chǎn)生影響。

基質(zhì)內(nèi)不同部位木質(zhì)纖維素酶酶活和還原糖含量有較大的差異，排除pH和溫度可能對(duì)酶活的影響，提示基質(zhì)內(nèi)不同部位菌絲體可能處于不同的生理階段和分化程度，從而導(dǎo)致了代謝反應(yīng)的差異。木質(zhì)纖維素酶和還原糖與猴頭菌生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，木質(zhì)纖維素酶可能通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)內(nèi)還原糖含量對(duì)猴頭菌生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，其中漆酶與猴頭菌原基形成聯(lián)系最為密切。

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[2]周長(zhǎng)青.白靈菇栽培基礎(chǔ)生理和關(guān)鍵技術(shù)研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2007:46－50.

[3]李江華，房峻.半纖維素酶高產(chǎn)菌種的選育及產(chǎn)酶條件 [J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23(5):48－51.

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[5]馮志勇.斑玉蕈對(duì)基質(zhì)中葡萄糖濃度變化的響應(yīng) [R].第九屆食用菌學(xué)術(shù)討論會(huì)學(xué)術(shù)報(bào)告.