Claudin-4在膽管癌中的表達及其臨床意義*

王　云　陳　敏　陳　駿　李運紅　諸葛宇征

南京醫(yī)科大學鼓樓臨床醫(yī)學院(210008)

?

Claudin-4在膽管癌中的表達及其臨床意義*

王云#陳敏陳駿李運紅&諸葛宇征&

南京醫(yī)科大學鼓樓臨床醫(yī)學院(210008)

背景：膽管癌是起源于膽管上皮細胞、惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤。Claudin-4是細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的關鍵組分，上皮腫瘤中普遍存在claudin-4表達異常，并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。目的：分析claudin-4在膽管癌中的表達及其與患者臨床病理特征和預后的相關性。方法：應用免疫組化方法檢測claudin-4在77例膽管癌及其配對癌旁組織中的表達率和表達強度，分析其表達與患者臨床病理特征的關系，同時以Kaplan-Meier生存曲線行生存分析。結(jié)果：膽管癌組織中claudin-4以強陽性表達為主，癌旁組織以中等和弱陽性表達為主，癌組織免疫組化評分顯著高于癌旁組織(9.22±3.62對7.12±4.26,P<0.05)。膽管癌組織中的claudin-4表達與腫瘤部位和分化程度顯著相關(P均<0.05)，低分化腺癌高表達率顯著高于高-中分化腺癌(76.2%對50.0%)。Claudin-4低表達組和高表達組31個月累積生存率分別為29.8%和21.1%，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論：Claudin-4在膽管癌中呈異常高表達，并與腫瘤分化程度呈負相關，因此有望成為膽管癌診斷新的生物學標記物和治療靶點。

膽管腫瘤；預后；Claudin-4；免疫組織化學

Background: Cholangiocarcinoma (CCA) is a fatal digestive system tumor arising from biliary epithelium. Claudin-4, a key constituent of intercellular tight junction, is aberrantly and widely expressed in various epithelial tumors, and is correlated with tumorigenesis and tumor progression. Aims: To investigate the expression of claudin-4 in CCA and its correlation with clinicopathological characteristics of the tumor and patient’s prognosis. Methods: Immunohistochemistry was used to determine the expression rate and intensity of claudin-4 in CCA tissue and matched paracancerous tissue of 77 CCA patients. Correlation of claudin-4 expression in CCA with its clinicopathological characteristics was analyzed, and survival analysis was conducted by using Kaplan-Meier method. Results: Claudin-4 was strongly expressed in CCA tissue and mildly or weakly expressed in matched paracancerous tissue; the immunohistochemical score was significantly higher in cancerous tissue than in paracancerous tissue (9.22±3.62vs. 7.12±4.26,P<0.05). Claudin-4 expression was significantly correlated with tumor location and tumor differentiation (Pall <0.05); the high expression rate was significantly higher in poorly differentiated CCA than in well or moderately differentiated ones (76.2%vs. 50.0%). The 31-month accumulate survival rates of claudin-4 low-expression group and high-expression group were 29.8% and 21.1%, respectively (P>0.05). Conclusions: Claudin-4 is highly expressed in CCA and negatively correlated with tumor differentiation. It might be a novel diagnostic biomarker and therapeutic target for CCA.

作為整合素家族成員之一，claudin-4是細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的關鍵組分，在正常上皮組織中發(fā)揮固定細胞和調(diào)節(jié)細胞間通透性的作用。上皮腫瘤中普遍存在claudin-4表達異常，并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系[1]，已發(fā)現(xiàn)claudin-4在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肺腺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達[1-6]，并與某些惡性腫瘤的預后不良相關[3,6]。Ryu等[7]的研究顯示，claudin-4在肝內(nèi)膽管癌中的表達率顯著高于肝細胞癌，是兩者鑒別診斷的獨立生物學標記物。Bunthot等[8]則發(fā)現(xiàn)，claudin-4在肝吸蟲相關膽管癌和癌前增生膽管上皮中呈高表達，敲除claudin-4可抑制膽管癌細胞的遷移和侵襲能力。然而亦有研究發(fā)現(xiàn)claudin-4在惡性腫瘤中起抑癌作用，如在卵巢癌細胞中，claudin-4可抑制EphA2致癌信號通路激活[9]；在胰腺導管腺癌中，claudin-4高表達預示患者預后較好[10]。鑒于claudin-4在惡性腫瘤中的生物學作用存在爭議且我國目前尚無關于claudin-4在膽管癌中表達的研究，本研究通過檢測claudin-4在77例膽管癌及其配對癌旁組織中的表達，分析其表達與膽管癌患者臨床病理特征和預后的相關性，初步探討claudin-4在膽管癌診斷和治療中的意義。

材料與方法

一、標本來源

收集2013年3月—2014年8月在南京鼓樓醫(yī)院接受膽管癌手術治療患者的冰凍或石蠟包埋組織標本，同時采集患者臨床病理資料，電話隨訪獲取生存信息。入組標本HE染色切片由資深病理醫(yī)師再次讀片，與住院期間病理診斷進行比對、確認。排除標準：①再次病理讀片確認為非膽管癌；②隨訪過程中因“非膽管癌”原因死亡；③術前接受放療或化療；④臨床病理資料不完整。結(jié)果共77例膽管癌組織及其配對癌旁組織(腫瘤切緣經(jīng)病理證實的非癌組織)標本納入研究，來源病例中男性49例，女性28例，年齡34～79歲，平均(58.8±10.6)歲；腫瘤部位：肝內(nèi)23例，肝門部31例，遠端23例。生存時間定義為術后第1 d至因膽管癌死亡或隨訪截止時間(2015年10月)的生存月數(shù)。

二、免疫組化染色

兔抗人claudin-4單克隆抗體為Abcam plc.產(chǎn)品，SP免疫組化檢測試劑盒為北京中杉金橋生物技術有限公司產(chǎn)品。石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2室溫靜置10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗3×5 min；檸檬酸熱抗原修復，PBS漂洗3×5 min；加入正常山羊血清室溫封閉2 h，PBS漂洗2次；加入一抗(1 μg/mL)，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3×5 min；加入二抗，室溫孵育30 min，PBS漂洗3×5 min；加入DAB染色液，顯微鏡下觀察，自來水沖洗終止染色；蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片，由資深病理醫(yī)師讀片。

結(jié)果判斷：采用Formwitz半定量積分法。光學顯微鏡下每張切片隨機選取5個100倍視野，計數(shù)陽性細胞并觀察染色強度。陽性細胞比率：≤5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。染色強度：無色，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；棕黃色，3分?？偡譃閮身椩u分之積：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)；0～8分為低表達，9～12分為高表達。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié)　　果

一、Claudin-4在膽管癌組織中表達上調(diào)

免疫組化染色結(jié)果顯示，膽管癌組織中claudin-4以強陽性表達為主，癌旁組織以中等和弱陽性表達為主，陽性表達主要定位于胞膜和胞質(zhì)(圖1)。癌組織和癌旁組織中claudin-4免疫組化評分分別為9.22±3.62和7.12±4.26，癌組織明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.18，P<0.05)。

二、膽管癌組織中claudin-4表達與患者臨床病理特征的關系

統(tǒng)計分析顯示，不同部位膽管癌的claudin-4表達水平差異顯著，肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌和遠端膽管癌高表達率分別為78.3%、54.8%和39.1%(P<0.05)；此外，claudin-4表達水平與膽管癌分化程度亦顯著相關，低分化腺癌高表達率顯著高于高-中分化腺癌(76.2%對50.0%，P<0.05)；claudin-4表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期和有無血管浸潤均無相關性(P>0.05)(表1)。

A(C)：膽管癌細胞胞膜、胞質(zhì)claudin-4強陽性表達；B(D)：癌旁組織claudin-4弱陽性表達

表1膽管癌組織中claudin-4表達與患者臨床病理特征的關系

臨床病理參數(shù)例數(shù)Claudin-4低表達高表達χ2值P值性別0.2290.632 男492029 女281315年齡0.2140.644 <60歲421725 ≥60歲351619腫瘤部位7.3030.026 肝內(nèi)23518 肝門部311417 遠端23149腫瘤大小2.0980.147 <7cm3371918 ≥7cm3401426分化程度4.2780.039 高-中分化562828 低分化21516TNM分期0.5630.453 Ⅰ-Ⅱ期572334 Ⅲ-Ⅳ期201010血管浸潤0.3100.578 無512328 有261016

鑒于claudin-4在不同部位膽管癌中的表達差異，本研究分別分析了其在不同部位膽管癌中的表達水平與患者臨床病理特征的關系，結(jié)果顯示肝內(nèi)膽管癌中的claudin-4表達與性別相關，男性高表達率顯著高于女性(P=0.033)；肝門部膽管癌中的claudin-4表達與腫瘤分化程度相關，低分化腺癌高表達率顯著高于高-中分化腺癌(P=0.021)。

三、膽管癌組織中claudin-4表達與患者預后的關系

71例患者獲得完整隨訪資料，中位隨訪期23個月(14～31個月)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，claudin-4低表達組和高表達組31個月累積生存率分別為29.8%和21.1%，組間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.566，P=0.211)(圖2)。

圖2膽管癌組織中claudin-4表達與患者預后的關系(Kaplan-Meier生存曲線)

討　　論

膽管癌是起源于膽管上皮細胞、惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，按其發(fā)生部位可分為肝內(nèi)膽管癌、肝門部膽管癌和遠端膽管癌，近年其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。由于缺乏特異性診斷指標和有效的晚期腫瘤治療方案，膽管癌患者預后極差，診斷后5年生存率低[11-13]。因此，尋找膽管癌特異性生物學標記物，對于其早期診斷、早期治療和療效提高具有重要意義。Claudin-4為細胞表面跨膜蛋白，近年對其在上皮腫瘤中作用的研究報道不斷增多，但涉及膽管癌者尚少。本研究旨在分析claudin-4表達與膽管癌患者臨床病理特征和預后的關系，探討其是否可作為膽管癌診斷和治療的靶點。

既往國外研究[7-8]和本研究均發(fā)現(xiàn)claudin-4在膽管癌組織中呈異常高表達，提示其可能為膽管癌相關抗原之一。今后可考慮對行ERCP操作的膽管癌和非膽管癌患者進行膽汁claudin-4檢測，觀察是否存在表達差異，以明確其對膽管癌的診斷意義。本研究免疫組化染色結(jié)果顯示，claudin-4在膽管癌癌旁組織中以中等和弱陽性表達為主，而Bunthot等[8]發(fā)現(xiàn)claudin-4在正常膽管組織(非癌旁組織)中呈弱陽性而無中等陽性表達，分析其原因可能為癌旁組織雖保持正常形態(tài)，但癌組織對其細胞代謝和分子表達可產(chǎn)生一定影響，導致其claudin-4表達與正常膽管組織存在差異。本研究分析顯示，膽管癌組織中的claudin-4表達水平與腫瘤分化程度呈負相關，提示其在膽管腫瘤上皮的分化成熟過程中可能起一定調(diào)節(jié)作用。惡性腫瘤的分化程度一般與患者預后呈正相關，由此推測claudin-4高表達者預后相對較差，本研究Kaplan-Meier生存曲線分析證實claudin-4高表達者31個月累積生存率低于低表達者(21.1%對29.8%)，但組間差異無統(tǒng)計學意義，考慮與本研究樣本量較小、入組病例臨床分期不均一等因素有關。今后擬累積樣本量和病例隨訪時間，并選擇臨床分期均一的病例進行分析，以期更好地評估claudin-4對膽管癌患者預后的影響。

Claudin-4為整合素家族成員，具有調(diào)節(jié)細胞滲透性和物質(zhì)轉(zhuǎn)運的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)、肝門部和遠端膽管癌組織的claudin-4高表達率呈遞減趨勢，考慮可能與不同部位膽管上皮細胞的上述功能存在差異，以及不同部位膽管癌在起源、病因和發(fā)病機制方面本身即存在明顯差異有關[13]。進一步分析claudin-4在不同部位膽管癌中的表達水平與患者臨床病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管癌中其表達與患者性別相關，而在肝門部膽管癌中，其表達與腫瘤分化程度相關，此種差異亦提示claudin-4在不同部位膽管癌中所起的作用可能有所不同，其確切生物學功能有待后續(xù)累積樣本量作進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)claudin-4在膽管癌中呈異常高表達，并與腫瘤分化程度呈負相關，因此有望成為膽管癌診斷新的生物學標記物和治療靶點。有研究[14]將具有claudin-4結(jié)合作用而無毒性的產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素羧基端片段(C-CPE)與具有細胞毒作用的白喉毒素片段A(DTA)融合，建立了可特異性靶向claudin-4，進而發(fā)揮細胞毒作用的DTA-C-CPE分子，提示了claudin-4用于腫瘤靶向治療的可行性。Claudin-4表達與膽管癌分化程度呈負相關，與患者預后亦有負相關傾向，提示其在膽管癌中總體上起促癌作用，但其在不同部位膽管癌中的生物學功能及其可能促癌機制仍有待進一步研究。

1 向若蘭，蘇運超，裴曉慶，等. 緊密連接蛋白claudin-4的研究進展[J]. 生理科學進展, 2012, 43 (4): 310-314.

2 Morin PJ. Claudin proteins in human cancer: promising new targets for diagnosis and therapy[J]. Cancer Res, 2005, 65 (21): 9603-9606.

3 Lanigan F, McKiernan E, Brennan DJ, et al. Increased claudin-4 expression is associated with poor prognosis and high tumour grade in breast cancer[J]. Int J Cancer, 2009, 124 (9): 2088-2097.

4 王琳，李世擁，安萍，等. Claudin-1和Claudin-4在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義[J]. 中華胃腸外科雜志, 2012, 15 (10): 1073-1076.

5 Wang H, Yang X. The expression patterns of tight junction protein claudin-1, -3, and -4 in human gastric neoplasms and adjacent non-neoplastic tissues[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8 (1): 881-887.

6 Chae MC, Park CK, Keum DY, et al. Prognostic significance of claudin 4 in completely resected adenocarcinoma of the lung[J]. Korean J Thorac Cardiovasc Surg, 2014, 47 (3): 262-268.

7 Ryu HS, Lee K, Shin E, et al. Comparative analysis of immunohistochemical markers for differential diagnosis of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma[J]. Tumori, 2012, 98 (4): 478-484.

8 Bunthot S, Obchoei S, Kraiklang R, et al. Overexpression of claudin-4 in cholangiocarcinoma tissues and its possible role in tumor metastasis[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13 Suppl: 71-76.

9 Shang X, Lin X, Howell SB. Claudin-4 controls the receptor tyrosine kinase EphA2 pro-oncogenic switch through β-catenin[J]. Cell Commun Signal, 2014, 12: 59.

10Tsutsumi K, Sato N, Tanabe R, et al. Claudin-4 expression predicts survival in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Ann Surg Oncol, 2012, 19 Suppl 3: S491-S499.

11Khan SA, Toledano MB, Taylor-Robinson SD. Epidemiology, risk factors, and pathogenesis of cholangiocarcinoma[J]. HPB (Oxford), 2008, 10 (2): 77-82.

12Razumilava N, Gores GJ. Cholangiocarcinoma[J]. Lancet, 2014, 383 (9935): 2168-2179.

13Rizvi S, Gores GJ. Pathogenesis, diagnosis, and management of cholangiocarcinoma[J]. Gastroenterology, 2013, 145 (6): 1215-1229.

14Kakutani H, Kondoh M, Saeki R, et al. Claudin-4-targeting of diphtheria toxin fragment A using a C-terminal fragment ofClostridiumperfringensenterotoxin[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2010, 75 (2): 213-217.

(2015-12-04收稿；2016-01-10修回)

Expression of Claudin-4 in Cholangiocarcinoma and its Clinical Significance

WANG Yun, CHEN Min, CHEN Jun, LI Yunhong, ZHUGE Yuzheng.

Drum Tower Clinical Medical College of Nanjing Medical University, Nanjing (210008)Co-correspondence to: LI Yunhong, Email: 13605156761@163.com; ZHUGE Yuzheng, Email: yuzheng9111963@aliyun.com

Bile Duct Neoplasms;Prognosis;Claudin-4;Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.08.004

南京市醫(yī)學科技發(fā)展項目醫(yī)學重點科技發(fā)展項目(ZKX11022)；南京市醫(yī)學科技發(fā)展項目醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題(YKK12053)；南京市醫(yī)學科技發(fā)展項目杰出青年基金項目(JQX14005)

#Email: 972585606@qq.com

&本文共同通信作者，李運紅，Email: 13605156761@163.com；諸葛宇征，Email: yuzheng9111963@aliyun.com