慢性萎縮性胃炎患者Runx3基因甲基化水平的研究

趙春娜　肖麗麗　王　倍　魏玥光

大慶油田總醫(yī)院消化內(nèi)科(163000)

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慢性萎縮性胃炎患者Runx3基因甲基化水平的研究

趙春娜*肖麗麗王倍魏玥光

大慶油田總醫(yī)院消化內(nèi)科(163000)

背景：慢性萎縮性胃炎(CAG)是一種胃黏膜發(fā)生萎縮性改變的慢性胃炎，目前CAG外周血生物標(biāo)記物的研究較少見(jiàn)。目的：探討CAG患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)各CpG位點(diǎn)的甲基化水平。方法：選取2013年6月—2014年5月大慶油田總醫(yī)院82例輕度CAG患者和73例中重度CAG患者，以45名胃黏膜正常者作為對(duì)照。采用MALDI-TOF-MS法測(cè)定Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)各CpG位點(diǎn)的甲基化水平，熒光定量PCR法測(cè)定Runx3 mRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定Runx3蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組和輕度CAG組相比，中重度CAG組Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG13、CpG14和CpG15位點(diǎn)的甲基化水平明顯升高(P<0.05)；Runx3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。而輕度CAG組Runx3基因各CpG位點(diǎn)的甲基化水平、Runx3 mRNA和蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論：CAG患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG13、CpG14和CpG15位點(diǎn)的高甲基化可抑制Runx3表達(dá)，有望作為CAG臨床分期的生物標(biāo)記物。

胃炎, 萎縮性；Runx3；甲基化；生物學(xué)標(biāo)記

Background: Chronic atrophic gastritis (CAG) is a kind of chronic gastritis with atrophic changes of gastric mucosa. The studies on peripheral blood biomarkers in CAG are rare. Aims: To investigate the methylation of peripheral blood CpG sites in Runx3 gene promoter region in CAG patients. Methods: Eighty-two mild CAG patients, 73 moderate to severe CAG patients from June 2013 to May 2014 at Daqing Oilfield General Hospital were enrolled, and 45 patients with normal gastric mucosa were served as controls. The methylation of CpG sites in Runx3 gene promoter region was measured by MALDI-TOF-MS. mRNA expression of Runx3 was determined by fluorescent quantitative PCR, and the protein expression of Runx3 was determined by Western blotting. Results: Compared with the control group and mild CAG group, methylation levels of CpG13, CpG14 and CpG15 sites in Runx3 gene promoter region were significantly increased in moderate to severe CAG group (P<0.05), the mRNA and protein expressions of Runx3 were significantly decreased (P<0.05). No significant differences in methylation of CpG sites in Runx3 gene promoter region and mRNA and protein expressions of Runx3 were found between mild CAG group and control group (P>0.05). Conclusions: The hypermethylation of peripheral blood CpG13, CpG14 and CpG15 sites in Runx3 gene promoter region can inhibit the expression of Runx3 in CAG patients, and can be used potentially as the biomarker for clinical staging of CAG.

慢性萎縮性胃炎(CAG)的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，隨著幽門(mén)螺桿菌(Hp)感染率的增高、環(huán)境污染加劇以及不健康的生活方式如高脂、高鹽飲食、蔬菜水果攝入不足等問(wèn)題的凸顯，我國(guó)CAG的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-2]。長(zhǎng)期CAG改變可導(dǎo)致胃癌的發(fā)病率增高，CAG為公認(rèn)的胃癌癌前病變，因此尋找CAG早期非侵襲性生物標(biāo)記物可能有助于降低胃癌發(fā)病率[3-4]，以達(dá)到早期預(yù)防和治療的作用。

Runx3是一種重要的抑癌基因，其表達(dá)降低可通過(guò)影響機(jī)體多種蛋白如Smad的功能，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)包含兩個(gè)高度保守的CpG島，可調(diào)控Runx3基因表達(dá)[5]。目前關(guān)于CAG患者Runx3基因甲基化水平的研究較少見(jiàn)，且缺乏甲基化CpG位點(diǎn)的分布位置的報(bào)道。本研究通過(guò)采用MALDI-TOF-MS法測(cè)定CAG患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)各個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平，旨在探討其作為CAG生物標(biāo)記物的可行性，從而為尋找CAG新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2013年6月—2014年5月大慶油田總醫(yī)院消化內(nèi)科經(jīng)胃鏡檢查確診為CAG的患者155例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡為20～60歲；②首次診斷為CAG。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有肝腎疾病、糖尿病、心血管疾病、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病如過(guò)敏性鼻炎、皮炎或哮喘等疾病；②過(guò)去一年內(nèi)長(zhǎng)期服用(>3個(gè)月)維生素或微量元素補(bǔ)充劑、中藥或其他免疫抑制劑等；③過(guò)去一年內(nèi)曾暴露于醫(yī)療射線或鉻汞補(bǔ)牙；④過(guò)去半年內(nèi)燙染過(guò)頭發(fā)或進(jìn)行過(guò)家居裝修；⑤過(guò)去半年內(nèi)曾服用過(guò)治療Hp的藥物；⑥有胃癌、結(jié)腸癌等消化道腫瘤的家族史。選取同期45名胃鏡檢查黏膜正常者作為對(duì)照。本研究的設(shè)計(jì)方案由大慶油田總醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有納入對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1. 胃鏡檢查：納入者均由同一位內(nèi)鏡醫(yī)師行胃黏膜取材，根據(jù)病變部位選取五個(gè)方位的胃黏膜行活檢。由兩名病理科醫(yī)師進(jìn)行讀片，如結(jié)果不一致，交由第三位經(jīng)驗(yàn)更為豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行最終的判斷。胃黏膜損傷程度分級(jí)：輕度：胃竇部淺層腺體呈局灶性萎縮、減少，而大小彎腺體正常；中度：胃竇部和小彎腺體均有萎縮、減少，且范圍較輕度廣泛；重度：胃竇部大部分萎縮、減少，僅殘留少數(shù)原有腺體；大、小彎和彎腺體萎縮；或黏膜顯著變薄，原有腺體完全萎縮、消失，以化生腺體代之。

2. 血樣采集：采集受試者空腹外周靜脈血10 mL，分裝于兩管。EDTA抗凝管6 mL，用于RNA、DNA和蛋白質(zhì)的提取；抗凝管4 mL，分離血清，用于Hp感染情況的測(cè)定。

3. Runx3基因甲基化水平的測(cè)定：應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，并測(cè)定其濃度和質(zhì)量。應(yīng)用MALDI-TOF-MS法測(cè)定Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)各CpG位點(diǎn)的甲基化水平。使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)(UCSC、Ensamble和NCBI)并結(jié)合文獻(xiàn)資料，確定Runx3基因CpG島的序列。采用Sequenom公司在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)Runx3的引物序列，正向：5’-agg aag aga gGT TTT TGG GGA TGT AGG TTT GG-3’，反向：5’-cag taa tac gac tca cta tag gga gaa ggc tAA AAA ACA CTT CAT AAT AAA CCA CC-3’。按DNA甲基化試劑盒(Zymol公司)說(shuō)明書(shū)對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。PCR反應(yīng)體系總體積為5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min。每個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入0.3 μL蝦堿性磷酸酶(SAP)和1.7 μL ddH2O混勻，SAP反應(yīng)條件：37 ℃ 20 min；85 ℃ 5 min。堿基特異性酶切反應(yīng)體系總體積為7 μL，37 ℃ 3 h。使用DNA質(zhì)譜陣列基因分析系統(tǒng)(MassARRAYR)行質(zhì)譜分析，測(cè)定Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)各CpG位點(diǎn)的甲基化水平。

4. Runx3基因mRNA表達(dá)的測(cè)定：Trizol提取血液mRNA，測(cè)定RNA濃度和質(zhì)量。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司)。利用美國(guó)Bio-Rad公司CFX-96熒光定量PCR儀行qRT-PCR(SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司)。以β-actin為內(nèi)參，對(duì)所有樣品進(jìn)行均一化處理，然后與對(duì)照組進(jìn)行比較，以2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA的表達(dá)量。

5. Runx3蛋白表達(dá)的測(cè)定：參照血液總蛋白提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)抽提血液總蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定Runx3蛋白表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、一般情況

對(duì)照組、輕度CAG組和中重度CAG組患者性別、年齡、BMI、Hp感染率、吸煙和飲酒狀況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)，說(shuō)明具有可比性。

表1　三組研究對(duì)象的基本情況

*吸煙的定義：每天至少吸1支，且持續(xù)至少1年；亦包括戒煙不足1年者；**飲酒的定義：每周不少于3次，每次不少于2兩白酒或1瓶啤酒

二、Runx3基因CpG位點(diǎn)的甲基化水平

與對(duì)照組和輕度CAG組相比，中重度CAG組中Runx3基因CpG13、CpG14和CpG15位點(diǎn)的甲基化水平明顯升高(P<0.05)，而輕度CAG組Runx3基因各CpG位點(diǎn)的甲基化水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

三、Runx3 mRNA和蛋白表達(dá)

與對(duì)照組和輕度CAG組相比，中重度CAG組Runx3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，輕度CAG組Runx3 mRNA和蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2、3)。

*與輕度CAG組和對(duì)照組比較，P<0.05

圖3　各組Runx3蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

討　　論

多數(shù)疾病的發(fā)生由環(huán)境因素和遺傳因素共同調(diào)控[6-7]。CAG的發(fā)生、發(fā)展亦是基因-環(huán)境交互作用的結(jié)果，即環(huán)境污染和不健康飲食因素的暴露可通過(guò)多種不同途徑影響相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致CAG的發(fā)生。目前研究表明基因的表達(dá)受多種因素的調(diào)控，其中包括DNA甲基化水平和模式的改變。DNA甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，以S-腺苷蛋氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移至特定堿基的過(guò)程。其可通過(guò)影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性和DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，從而調(diào)控基因的表達(dá)，在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起有至關(guān)重要的作用。

*與輕度CAG組和對(duì)照組比較，P<0.05

Runx3基因?yàn)镽unx家族成員之一，位于人1號(hào)染色體短臂上。目前研究表明Runx3啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化可引起mRNA和蛋白表達(dá)的降低或直接導(dǎo)致基因靜默和表達(dá)缺失，進(jìn)而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，包括肝癌、胃癌等[8-9]，且其甲基化水平可作為這些腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物標(biāo)記物。近年有研究發(fā)現(xiàn)，Runx3是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)加強(qiáng)Smad復(fù)合物與靶位點(diǎn)的結(jié)合并激活靶基因，起調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化等作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)Runx3基因內(nèi)含2個(gè)高度保守的CpG島，其甲基化水平可通過(guò)影響基因表達(dá)而導(dǎo)致TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)的紊亂，從而參與多種疾病的發(fā)生，特別是腫瘤，包括胃癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等[11-14]。

CAG為胃癌的癌前病變，尋找其早期的生物標(biāo)記物具有一定的臨床意義。Zou等[15]的研究已證實(shí)胃癌患者存在Runx3基因的高甲基化改變，且Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)中重度CAG患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG13、CpG14和CpG15位點(diǎn)的甲基化水平超過(guò)30%，且均顯著高于胃黏膜正常者(P<0.05)，與前期研究[15]中胃癌組織的變化趨勢(shì)相一致。同時(shí)中重度CAG患者Runx3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于胃黏膜正常者(P<0.05)，說(shuō)明Runx3基因高甲基化可影響相應(yīng)基因的表達(dá)，甚至引起蛋白表達(dá)的缺失，進(jìn)而誘導(dǎo)胃黏膜的癌變。

綜上所述，CAG患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG13、CpG14和CpG15位點(diǎn)的高甲基化可抑制Runx3的表達(dá)，進(jìn)而影響患者的臨床癥狀，上述位點(diǎn)的甲基化有望作為CAG臨床分期的生物標(biāo)記物。

1 Sipponen P, Maaroos HI. Chronic gastritis[J]. Scand J Gastroenterol, 2015, 50 (6): 657-667.

2 Chen T, Sun L, He C, et al. Serum OPN expression for identification of gastric cancer and atrophic gastritis and its influencing factors[J]. PLoS One, 2014, 9 (12): e114005.

3 Tursi A, Grattagliano I, De Polo M, et al. Noninvasive prediction of chronic atrophic gastritis in autoimmune thyroid disease in primary care[J]. Scand J Gastroenterol, 2014, 49 (11): 1394-1396.

4 Watari J, Chen N, Amenta PS, et al.Helicobacterpyloriassociated chronic gastritis, clinical syndromes, precancerous lesions, and pathogenesis of gastric cancer development[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20 (18): 5461-5473.

5 Berg M, Nordgaard O, K?rner H, et al. Molecular subtypes in stage Ⅱ-Ⅲ colon cancer defined by genomic instability: early recurrence-risk associated with a high copy-number variation and loss of RUNX3 and CDKN2A[J]. PLoS One, 2015, 10 (4): e0122391.

6 鄭玉新. 暴露評(píng)估與暴露組研究—探索環(huán)境與健康的重要基礎(chǔ)[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 47 (2): 99-100.

7 Song H, Held M, Sandin S, et al. Increase in the prevalence of atrophic gastritis among adults age 35 to 44 years old in Northern Sweden between 1990 and 2009[J]. Clin Gastroenterol Hepatol, 2015, 13 (9): 1592-1600.e1.

8 Zhang X, He H, Zhang X, et al. RUNX3 promoter methylation is associated with hepatocellular carcinoma risk: A meta-analysis[J]. Cancer Invest, 2015, 33 (4): 121-125.

9 Lotem J, Levanon D, Negreanu V, et al. Runx3 at the interface of immunity, inflammation and cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1855 (2): 131-143.

10Bangsow C, Rubins N, Glusman G, et al. The RUNX3 gene -- sequence, structure and regulated expression[J]. Gene, 2001, 279 (2): 221-232.

11Zaidi SK, Sullivan AJ, van Wijnen AJ, et al. Integration of Runx and Smad regulatory signals at transcriptionally active subnuclear sites[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99 (12): 8048-8053.

12Li QL, Ito K, Sakakura C, et al. Causal relationship between the loss of RUNX3 expression and gastric cancer[J]. Cell, 2002, 109 (1): 113-124.

13Barutcu AR, Hong D, Lajoie BR, et al. RUNX1 contributes to higher-order chromatin organization and gene regulation in breast cancer cells[J]. Biochim Biophys Acta, 2016, pii: S1874-9399(16)30170-5.[Epub ahead of print]

14Liu G, Xiang T, Wu QF, et al. Long noncoding RNA H19-derived miR-675 enhances proliferation and invasion via RUNX1 in gastric cancer cells[J]. Oncol Res, 2016, 23 (3): 99-107.

15Zou XP, Zhang B, Zhang XQ, et al. Promoter hypermethylation of multiple genes in early gastric adenocarcinoma and precan-cerous lesions[J]. Hum Pathol, 2009, 40 (11): 1534-1542.

(2015-10-08收稿；2015-10-28修回)

Investigation on Methylation of Runx3 Gene in Patients with Chronic Atrophic Gastritis

ZHAO Chunna, XIAO Lili, WANG Bei, WEI Yueguang.

Department of Gastroenterology, Daqing Oilfield General Hospital, Daqing, Heilongjiang Province (163000)

Gastritis, Atrophic;Runx3;Methylation;Biological Markers

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.08.006

*Email: zjg122@sina.com