XAF1轉(zhuǎn)錄變異體在結(jié)直腸腫瘤中的差異表達(dá)*

周永柏　吳　偉　王繼德　張亞歷&

深圳市龍崗中心醫(yī)院消化科1(518116)　南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科2

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·論著·

XAF1轉(zhuǎn)錄變異體在結(jié)直腸腫瘤中的差異表達(dá)*

周永柏1#吳偉1王繼德2張亞歷2&

深圳市龍崗中心醫(yī)院消化科1(518116)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)相關(guān)因子1(XAF1)能與XIAP結(jié)合而拮抗其caspase抑制活性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，已被認(rèn)定是一種腫瘤抑制基因。在多種腫瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到XAF1轉(zhuǎn)錄變異體，但不同轉(zhuǎn)錄變異體在結(jié)直腸腫瘤中的表達(dá)情況尚不明確。目的：檢測(cè)XAF1及其轉(zhuǎn)錄變異體在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)，初步探討其在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法：收集結(jié)直腸癌及其配對(duì)癌旁組織、增生性息肉、腺瘤和正常結(jié)直腸黏膜組織樣本，以免疫組化法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)XAF1蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)XAF1轉(zhuǎn)錄變異體表達(dá)。結(jié)果：與正常結(jié)直腸黏膜相比，XAF1蛋白在增生性息肉、腺瘤和癌組織中的胞核表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(P<0.05)，胞質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度有所增高(P>0.05)，總體表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(P<0.05)。結(jié)直腸癌組織中的XAF1A蛋白表達(dá)顯著低于相應(yīng)癌旁組織(P<0.05)。轉(zhuǎn)錄變異體XAF1A、XAF1B、XAF1C mRNA在結(jié)直腸腫瘤中的表達(dá)均顯著低于正常結(jié)直腸黏膜(P<0.05)。結(jié)論：XAF1及其轉(zhuǎn)錄變異體在結(jié)直腸腫瘤和正常結(jié)直腸黏膜中存在差異表達(dá)，腺瘤階段即已出現(xiàn)XAF1表達(dá)下降并由胞核向胞質(zhì)易位。轉(zhuǎn)錄后修飾可能影響XAF1基因功能。

X連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1；基因，腫瘤抑制；RNA加工，轉(zhuǎn)錄后；轉(zhuǎn)錄變異體；

結(jié)直腸腫瘤

Background: The tumor suppressor, X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)-associated factor 1 (XAF1) is a XIAP-binding protein that antagonizes the anti-caspase activity of XIAP, thereby enhancing apoptosis. Transcriptional variants of XAF1 have been detected in various tumor cells, however, the expression profile of these transcriptional variants in colorectal neoplasms remains unclear. Aims: To investigate the expressions of XAF1 and its transcriptional variants in different colorectal tissues and their roles in tumorigenesis and development of colorectal neoplasms. Methods: Samples of colorectal cancer and paired adjacent tissue, hyperplastic polyp, adenomatous polyp, and normal colorectal mucosa were collected from surgical operation or endoscopic biopsies. XAF1 protein expression was detected by immunohistochemistry and Western blotting, and the transcriptional variants of XAF1 were detected by RT-PCR. Results: Compared with normal colorectal mucosa, the expression level of XAF1 protein in nucleus was significantly reduced (P<0.05) and that in cytoplasm was slightly increased (P>0.05) in hyperplastic polyp, adenomatous polyp, and cancerous tissue, and the overall expression level of XAF1 protein was decreased (P<0.05). XAF1A protein expression in cancerous tissue was significantly reduced when compared with the paired adjacent tissue (P<0.05). mRNA expressions of three transcriptional variants of XAF1, XAF1A, XAF1B and XAF1C were all significantly lower in neoplastic tissues than in normal mucosa (P<0.05). Conclusions: XAF1 and its transcriptional variants are differentially expressed in colorectal neoplasms and normal colorectal mucosa. These changes occurred initially in adenomatous polyp accompanied by a redistribution of XAF1 from nucleus to cytoplasm. Post-transcriptional modification may affect XAF1 gene function.

結(jié)直腸癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生率在惡性腫瘤中居第4位。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已證實(shí)結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多基因改變逐漸累積的多階段復(fù)雜過程，一般認(rèn)為其演變規(guī)律為“正常腸上皮→增生性改變/微小腺瘤→早期腺瘤→中期腺瘤→后期腺瘤→癌→癌轉(zhuǎn)移”，但亦有研究表明部分結(jié)直腸癌直接起源于正常黏膜生發(fā)中心的干細(xì)胞而與腺瘤無(wú)關(guān)，即denovo癌。上述兩種演變過程均伴有多種癌基因和抑癌基因的改變[1]。X連鎖凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1(X-linked inhibitor of apoptosis-associated factor 1, XAF1)為X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)相關(guān)因子，能與XIAP直接結(jié)合，通過拮抗其caspase抑制活性而起促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[2-3]。研究顯示XAF1廣泛表達(dá)于正常組織，但在多種腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)或不表達(dá)，在調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等方面發(fā)揮重要作用，已被認(rèn)定是一種腫瘤抑制基因[4-7]。XAF1 mRNA有多種轉(zhuǎn)錄變異體，這些轉(zhuǎn)錄變異體分別編碼不同蛋白，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能起不同甚至相反的作用[8-10]。最近Hatakeyama等[11]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的XAF1轉(zhuǎn)錄變異體XAF1F，并發(fā)現(xiàn)XAF1C和XAF1F在含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的胃癌患者外周血中表達(dá)上調(diào)；本課題組前期研究[10]還發(fā)現(xiàn)，XAF1C在懸浮生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移性胃腸道腫瘤細(xì)胞株中呈高表達(dá)。目前國(guó)內(nèi)尚未見關(guān)于XAF1轉(zhuǎn)錄變異體在結(jié)直腸腫瘤中表達(dá)情況的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過檢測(cè)XAF1及其轉(zhuǎn)錄變異體在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)，初步探討其在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

結(jié)直腸組織標(biāo)本來(lái)源為南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院手術(shù)室和消化內(nèi)鏡中心。27例結(jié)直腸癌、51例結(jié)直腸腺瘤、24例增生性息肉和36例正常結(jié)直腸黏膜組織樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，HE染色，行病理學(xué)檢查、診斷和免疫組化染色；138例患者中男性83例，女性55例，年齡12～82歲，平均(48.2±15.2)歲。20例結(jié)直腸癌及其配對(duì)癌旁組織(距癌灶邊緣5 cm)樣本離體后10 min內(nèi)迅速置于液氮中，轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存，用于蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。42例結(jié)直腸癌及其配對(duì)癌旁組織、28例結(jié)直腸腺瘤和14例正常結(jié)直腸黏膜組織樣本離體后10 min內(nèi)迅速置于RNA樣本保存液中，-80 ℃冰箱保存，用于RT-PCR。所有樣本來(lái)源病例取材前均未接受過化療或放療，并排除其他惡性腫瘤。

二、主要試劑

兔抗人XAF1多克隆抗體(針對(duì)C端305～317氨基酸，Abcam plc.)，羊抗人XAF1A多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)，超敏SP免疫組化試劑盒、DAB染色液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；RNA樣本保存液、RNAiso Plus、Premix TaqTM(TAKARA BIO INC.)，RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc.)。PCR引物由Invitrogen公司合成(表1)。

表1　PCR引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

三、方法

1. 免疫組化染色(SP法)：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗3次，3% H2O2覆蓋10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗3×5 min；枸椽酸鈉(pH 6.8)微波抗原修復(fù)10 min，PBS漂洗3×5 min；加入正常山羊血清孵育30 min封閉非特異性抗體；加入兔抗人XAF1抗體(1∶250)，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3×5 min；加入羊抗兔二抗，室溫孵育15 min，PBS漂洗3×5 min；加入HRP標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10 min，PBS漂洗3×5 min；加入DAB染色液，顯微鏡下觀察顯色(3 min)，蒸餾水洗中止，蘇木精復(fù)染，分化返藍(lán)，脫水，封片。以正常兔IgG代替XAF1一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定：于光學(xué)顯微鏡下放大400倍觀察、評(píng)估XAF1胞核、胞質(zhì)和總體染色情況。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分，無(wú)染色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。細(xì)胞顯色率評(píng)分：每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率?？偡譃閮身?xiàng)評(píng)分之積：0分，陰性；0～0.5分，弱陽(yáng)性；0.5～2分，中等陽(yáng)性；>2分，強(qiáng)陽(yáng)性。

2. 蛋白質(zhì)印跡法：取結(jié)直腸組織100 mg，加入1 mL強(qiáng)效RIPA裂解液和1% PMSF冰上勻漿，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。50 μg/孔總蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入羊抗人XAF1A抗體(1∶300)，4 ℃孵育過夜，TBS-T洗膜3×10 min；加入兔抗羊二抗(1∶4 000)，室溫孵育2 h，TBS-T洗膜3×10 min，ECL法顯影。UVP GDS7500型光密度掃描儀掃描成像，Image Pro Plus v6.0軟件提取條帶灰度值。癌組織中目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以該蛋白條帶灰度值與相應(yīng)癌旁組織蛋白條帶灰度值的比值表示。

3. RT-PCR：取結(jié)直腸組織100 mg，按試劑說(shuō)明書操作提取總RNA，電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。取3 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積20 μL，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積25 μL，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)(內(nèi)參β-actin 25個(gè)循環(huán))；72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳，UVP GDS7500型光密度掃描儀掃描成像，Image Pro Plus v6.0軟件提取條帶灰度值。目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量以其條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示。同時(shí)取2例健康成年男性外周血(3 mL)，提取淋巴細(xì)胞總RNA作為正常對(duì)照。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、XAF1蛋白在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)

免疫組化染色顯示，XAF1表達(dá)于結(jié)直腸黏膜腺體細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)，間質(zhì)細(xì)胞和肌細(xì)胞不表達(dá)。正常結(jié)直腸黏膜中，XAF1主要表達(dá)于黏膜腺體細(xì)胞核，越靠近黏膜表面表達(dá)越強(qiáng)，胞質(zhì)不表達(dá)或低表達(dá)；增生性息肉中，XAF1主要表達(dá)于黏膜腺體細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)，胞質(zhì)表達(dá)明顯增多；腺瘤組織，特別是具有高度癌變潛能的管狀絨毛狀腺瘤中，XAF1以胞質(zhì)表達(dá)為主，胞核不表達(dá)或低表達(dá)；癌組織中，胞核、胞質(zhì)均有XAF1表達(dá)，個(gè)體間差異較大(圖1)。與正常黏膜組織相比，XAF1在增生性息肉、腺瘤和癌組織中的胞核表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(P<0.05)，胞質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度有所增高， 但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，總體表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(P<0.05)。XAF1表達(dá)強(qiáng)度與樣本來(lái)源個(gè)體的性別、年齡、樣本取材部位、腺瘤分化程度(異型增生程度)均無(wú)相關(guān)性(表2)。

表2　XAF1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

A：陰性對(duì)照；B：正常結(jié)直腸黏膜；C：增生性息肉；D：腺瘤；E、F：結(jié)直腸癌

二、XAF1A蛋白在結(jié)直腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，與相應(yīng)癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織中的XAF1A蛋白表達(dá)明顯降低，相對(duì)表達(dá)量為0.83±0.34，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)(圖2)。

T：癌組織；N：癌旁組織；1 Da=0.992 1 u

三、XAF1 3個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)顯示，XAF1A mRNA在正常結(jié)直腸黏膜、腺瘤、癌組織及其癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.84±0.31、0.64±0.25、0.63±0.36和0.82±0.46，腺瘤和癌組織明顯低于正常黏膜組織，癌組織明顯低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由于XAF1B、XAF1C mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，故轉(zhuǎn)換為定性資料進(jìn)行分析，結(jié)果顯示腺瘤和癌組織中XAF1B、XAF1C mRNA陽(yáng)性表達(dá)率均顯著低于正常黏膜組織(P<0.05)；癌組織中兩者陽(yáng)性表達(dá)率雖高于相應(yīng)癌旁組織，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)，XAF1B、XAF1C mRNA在正常結(jié)直腸黏膜中為低表達(dá)(電泳條帶較暗)，在腺瘤和癌組織中或表達(dá)缺失，或表達(dá)較強(qiáng)(電泳條帶較亮)(圖3)。2例健康成年男性外周血淋巴細(xì)胞中可檢測(cè)到XAF1A、XAF1B mRNA，但未檢測(cè)到XAF1C mRNA。

表3XAF1 3個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá)n(%)

組別例數(shù)XAF1AmRNAXAF1BmRNAXAF1CmRNA正常黏膜1414(100.0)13(92.9)12(85.7)腺瘤2828(100.0)20(71.4)*19(67.9)*癌組織4242(100.0)30(71.4)*24(57.1)*癌旁組織4242(100.0)28(66.7)22(52.4)

*與正常結(jié)直腸黏膜比較，P<0.05

T：癌組織；N：癌旁組織

圖3XAF1 3個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體在結(jié)直腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)

討　　論

細(xì)胞凋亡抑制可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、免疫逃逸及其對(duì)化療、放療的抵抗。近年來(lái)，越來(lái)越多的凋亡調(diào)控相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)和闡明。XAF1對(duì)凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis proteins, IAPs)家族有普遍抑制作用，同時(shí)參與穩(wěn)定p53蛋白，促進(jìn)survivin蛋白降解，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放，以及促進(jìn)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、紫外線等誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因[4-7]，文獻(xiàn)報(bào)道其在人類泌尿系、消化系腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤等中均呈低表達(dá)。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、涉及多基因改變逐漸累積的復(fù)雜過程，本研究通過檢測(cè)XAF1及其轉(zhuǎn)錄變異體在結(jié)直腸癌及其癌前病變中的表達(dá)情況，旨在明確其在結(jié)直腸癌變過程中的作用。入組結(jié)直腸腫瘤樣本來(lái)源病例均未合并其他惡性腫瘤；因目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道慢性疾病如糖尿病、高血壓病、痛風(fēng)等與XAF1轉(zhuǎn)錄變異體之間的相關(guān)性，故本研究未將是否合并慢性疾病納入統(tǒng)計(jì)分析。

本研究結(jié)果顯示，與正常結(jié)直腸黏膜相比，XAF1在增生性息肉、腺瘤和癌組織中的總體和胞核表達(dá)強(qiáng)度顯著降低，胞質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度略有增高；在正常黏膜組織中，XAF1主要表達(dá)于腺體細(xì)胞核，且多為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)中雖亦有表達(dá)，但多為弱陽(yáng)性表達(dá)；而在腺瘤組織，特別是具有高度癌變潛能的管狀絨毛狀腺瘤中，XAF1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，胞核多不表達(dá)或僅有弱陽(yáng)性表達(dá)。上述發(fā)現(xiàn)與Ng等[12]對(duì)黑色素瘤的研究結(jié)果類似。同時(shí)，本研究還觀察到，正常黏膜組織中靠近黏膜表面的腺體細(xì)胞核強(qiáng)表達(dá)XAF1，靠近肌層的腺體細(xì)胞或不表達(dá)，或主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)直腸黏膜為一不斷更新的組織，黏膜表面的腺體細(xì)胞為老化細(xì)胞，即將發(fā)生凋亡。由此推測(cè)參與細(xì)胞凋亡的是表達(dá)于胞核的XAF1。腫瘤細(xì)胞中XAF1不表達(dá)或表達(dá)于胞質(zhì)而不入核，可能是腫瘤細(xì)胞得以永生的原因之一。腺瘤組織中XAF1胞核表達(dá)強(qiáng)度降低、胞質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度增高，提示在結(jié)直腸癌變過程中，XAF1基因表達(dá)在腺瘤階段即開始降低，并出現(xiàn)亞細(xì)胞定位改變。

由于本研究免疫組化染色使用的XAF1抗體為多克隆抗體，不能區(qū)分由XAF1不同轉(zhuǎn)錄變異體翻譯的蛋白，故進(jìn)一步以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了XAF1A在結(jié)直腸癌及其癌旁組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示癌組織中XAF1A蛋白表達(dá)顯著低于相應(yīng)癌旁組織，與免疫組化染色結(jié)果相符，證實(shí)XAF1在結(jié)直腸癌中呈低表達(dá)。

XAF1基因包括8個(gè)外顯子，其mRNA經(jīng)軟件預(yù)測(cè)有24種轉(zhuǎn)錄變異體，其中19種可編碼完整蛋白，目前在人類細(xì)胞或組織中檢測(cè)到的有6種，即XAF1A-F[8-11]。XAF1A即通常所說(shuō)的XAF1，含7個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，編碼蛋白C端6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與促凋亡作用有關(guān)，N端鋅指結(jié)構(gòu)(ZF-TRAF)則參與蛋白間的相互作用[2]。與XAF1A相比，XAF1B缺失外顯子3(57 nt)，編碼蛋白缺失19個(gè)氨基酸；XAF1C在外顯子4和5之間多一個(gè)4b外顯子(152 nt)，導(dǎo)致開放閱讀框(ORF)出現(xiàn)中止密碼子而只能編碼含164個(gè)氨基酸的蛋白，其C端結(jié)構(gòu)(由外顯子4b編碼的24個(gè) 氨基酸)不同于XAF1A，N端鋅指結(jié)構(gòu)則與XAF1A相同。XAF1D和XAF1E分別編碼含141和122個(gè)氨基酸的蛋白，XAF1F與XAF1C一樣ORF內(nèi)含中止密碼子。研究[13]發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤細(xì)胞株A375中，單獨(dú)表達(dá)外源性ZF-TRAF能劑量依賴性地抑制干擾素誘導(dǎo)的內(nèi)源性XAF1的促凋亡作用，而表達(dá)ZF-TRAF缺失的外源性XAF1對(duì)干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡無(wú)影響。Fang等[9]的研究顯示，前列腺癌細(xì)胞株LNCaP和DU145僅表達(dá)由XAF1B編碼的截短XAF1蛋白，與XIAP間的相互作用受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡平衡機(jī)制被打破，而抑制DNA甲基化可使XAF1B轉(zhuǎn)變?yōu)槿L(zhǎng)XAF1A。上述發(fā)現(xiàn)提示XAF1不同轉(zhuǎn)錄變異體的編碼蛋白可能因所含結(jié)構(gòu)域不同而在細(xì)胞中起不同甚至是相反的作用。Chung等[14]以體外構(gòu)建的XAF1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，則發(fā)現(xiàn)XAF1 5個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體的編碼蛋白均起促凋亡作用。Yin等[8]的研究顯示，XAF1A與XAF1C mRNA的比值在不同類型腫瘤細(xì)胞株中存在差異。鑒于XAF1C N端ZF-TRAF結(jié)構(gòu)與XAF1A相同而不含XAF1A的C端結(jié)構(gòu)，推測(cè)其可能在腫瘤組織中起拮抗XAF1A的作用，腫瘤組織中兩者比值不同可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。XAF1C能否拮抗XAF1A的活性及其自身生物學(xué)活性有待進(jìn)一步研究。

本研究中XAF1A mRNA在正常結(jié)直腸黏膜、腺瘤和癌組織中的相對(duì)表達(dá)量依次降低，癌組織顯著低于相應(yīng)癌旁組織，與Ma等[15]的研究結(jié)果相似。XAF1B、XAF1C mRNA陽(yáng)性表達(dá)率在癌組織中略高于癌旁組織，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在腺瘤和癌組織中均顯著低于正常黏膜組織。本研究還發(fā)現(xiàn)XAF1B、XAF1C mRNA在正常黏膜組織中為低表達(dá)，在腺瘤和癌組織中或表達(dá)缺失，或表達(dá)較強(qiáng)；健康成年男性外周血淋巴細(xì)胞中有XAF1A、XAF1B mRNA表達(dá)，但不表達(dá)XAF1C mRNA。無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)能選擇性降解含有翻譯提前終止密碼子(premature translation termination codon, PTC)的mRNA，從而防止對(duì)機(jī)體有害的截短蛋白產(chǎn)生。既往文獻(xiàn)報(bào)道含有PTC的XAF1C、XAF1F mRNA因NMD缺陷而在高度轉(zhuǎn)移性胃癌細(xì)胞和含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的胃癌患者外周血中聚集[11]，因此推測(cè)部分結(jié)直腸腫瘤組織中XAF1C表達(dá)增強(qiáng)可能與NMD缺陷有關(guān)。由于獲取含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的結(jié)直腸癌患者外周血樣本較為困難，本研究未對(duì)此進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)XAF1及其轉(zhuǎn)錄變異體在結(jié)直腸腫瘤和正常結(jié)直腸黏膜中存在差異表達(dá)，腺瘤階段即已出現(xiàn)XAF1表達(dá)下降并由胞核向胞質(zhì)易位，表明XAF1在腺瘤發(fā)生及其向腺癌演變過程中起抑癌基因作用。XAF1轉(zhuǎn)錄變異體XAF1B、XAF1C在結(jié)直腸腺瘤和癌組織中表達(dá)紊亂，兩者在部分腫瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)是否有抑制XAF1入核、影響其腫瘤抑制基因功能的作用，尚有待進(jìn)一步研究。

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(2016-03-07收稿；2016-05-09修回)

Differential Expression of Transcriptional Variants of XAF1 in Colorectal Neoplasms

ZHOU Yongbai1, WU Wei1, WANG Jide2, ZHANG Yali2.1

Department of Gastroenterology, Longgang District Central Hospital of Shenzhen, Shenzhen, Guangdong Province (518116);2Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou Correspondence to: ZHANG Yali, Email: zyl41531@163.com

X-Linked Inhibitor of Apoptosis-Associated Factor 1;Genes, Tumor Suppressor;RNA Processing, Post-Transcriptional;Transcriptional Variants;Colorectal Neoplasms

10.3969/j.issn.1008-7125.2016.08.003

深圳市龍崗區(qū)科技創(chuàng)新局項(xiàng)目(YS2013123)

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