周 皓 張紹仁 劉紅燕
復(fù)旦大學附屬金山醫(yī)院消化內(nèi)科(201508)
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MicroRNA-21通過PTEN/Akt通路介導前列腺素E2促進胃癌細胞的增殖*
周皓張紹仁劉紅燕#
復(fù)旦大學附屬金山醫(yī)院消化內(nèi)科(201508)
背景:已有研究證實前列腺素E2(PGE2)可促進腫瘤細胞的增殖,microRNA-21(miR-21)可抑制腫瘤細胞增殖,但信號通路尚不明確。目的:探討miR-21介導PGE2促進胃癌細胞增殖的潛在作用機制。方法:體外培養(yǎng)胃癌AGS細胞,分為對照組、PGE2組、anti-miR-21組、PGE2+anti-miR-21組,以WST-1比色法檢測細胞生存率,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,RT-PCR法檢測miR-21 mRNA表達。以Akt特異性抑制劑哌立福辛干預(yù)AGS細胞,檢測其對細胞增殖的影響,蛋白質(zhì)印跡法檢測PTEN/Akt蛋白表達。結(jié)果:與對照組相比,PGE2組AGS細胞生存率顯著升高(P<0.05),凋亡率顯著降低(P<0.05),miR-21 mRNA表達顯著升高(P<0.05)。與PGE2組相比,anti-miR-21組、PGE2+anti-miR-21組細胞生存率顯著降低(P<0.05),凋亡率顯著升高(P<0.05),miR-21 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。以哌立福辛干預(yù)后,AGS細胞生存率顯著降低(P<0.05),凋亡率顯著升高(P<0.05),PTEN蛋白表達明顯上調(diào),p-Akt蛋白表達明顯下調(diào)。結(jié)論:miR-21通過PTEN/Akt通路介導了PGE2促進胃癌細胞增殖的作用,可能成為防治胃癌的新靶點。
微RNAs;胃腫瘤;前列腺素E類;PTEN/Akt通路
Background: Prostaglandin E2(PGE2) could promote the proliferation of tumor cells, microRNA-21 (miR-21) could inhibit the proliferation of tumor cells, but its signal pathway is still unclear. Aims: To investigate the mechanism of PGE2on promoting proliferation of gastric cancer cells potentially mediated by miR-21. Methods: Gastric cancer AGS cells were cultured and divided into control group, PGE2group, anti-miR-21 group and PGE2+anti-miR-21 group. Cell proliferation was determined by WST-1 chromatometry. Cell apoptosis rate was detected by flow cytometry. The expression of miR-21 mRNA was detected by RT-PCR. After AGS cells were intervened by Akt specific inhibitor perifosine, cell proliferation was assessed, and expression of PTEN/Akt protein was detected by Western blotting. Results: Compared with control group, survival rate of AGS cells was significantly increased (P<0.05), apoptosis rate was significantly decreased (P<0.05), and expression of miR-21 mRNA was significantly increased in PGE2group (P<0.05). Compared with PGE2group, survival rate of AGS cells was significantly decreased (P<0.05), apoptosis rate was significantly increased (P<0.05), and expression of miR-21 mRNA was significantly decreased in anti-miR-21 group and PGE2+anti-miR-21 group (P<0.05). After intervention with perifosine, survival rate of AGS cells was significantly decreased (P<0.05), apoptosis rate was significantly increased (P<0.05), expression of PTEN protein was significantly increased, and expression of p-Akt protein was significantly decreased. Conclusions: MiR-21 mediates the promoting of proliferation of gastric cancer cells by PGE2through PTEN/Akt pathway, which might become a new target for the prevention and treatment of gastric cancer.
胃癌是目前嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一,其特點是病情進展快、預(yù)后差、五年生存率較低[1-2]。前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡[3]、促進腫瘤侵襲和血管形成以及逃避免疫監(jiān)視等途徑在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段發(fā)揮重要作用。MicroRNA(miR)是一類長度為17~25個核苷酸的非編碼小分子RNA,在生物體的發(fā)育、增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[4]。目前發(fā)現(xiàn)miR-21幾乎在所有腫瘤中均高表達,通過抑制多種與腫瘤細胞增殖、凋亡和侵襲相關(guān)的抑癌基因而發(fā)揮作用[5-6]。有研究證實miR-21是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵癌基因[7]。本研究通過探討miR-21在胃癌細胞生長增殖中的作用及其可能機制,旨在為miR-21的基礎(chǔ)研究和胃癌的分子生物學治療提供理論依據(jù)。
一、研究資料
人胃腺癌細胞株AGS購自美國ATCC細胞庫(ATCC?CRL-1739TM)。人細胞因子PGE2、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清均購自上海寧盛生物科技有限公司。Anti-miR-21寡核苷酸序列由美國ABI公司設(shè)計并合成。PTEN/Akt單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,β-actin多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。p-Akt單克隆抗體、Akt特異性抑制劑哌立福辛均購自Cell Signaling Technology公司。PCR引物miR-21、U6特異性探針引物由ABI公司合成,其余引物由Invitrogen公司合成。TaqMan MicroRNA檢測試劑盒購自ABI公司。蛋白marker購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。WST-1購自碧云天生物技術(shù)公司。
二、研究方法
1. 細胞培養(yǎng):AGS細胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育。以0.25%胰酶消化,按1∶3的細胞比例傳代,每三天傳代一次。
2. 接種細胞:取對數(shù)生長期的AGS細胞,制成單細胞懸液,以每孔2×105個的密度接種于6孔板,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。
3. 實驗分組:①將AGS細胞分為對照組(不作任何處理)、PGE2(5 μmol/L)組、anti-miR-21組、PGE2(5 μmol/L)+anti-miR-21組,用于研究PGE2和anti-miR-21干預(yù)對AGS細胞增殖的影響;②將AGS細胞分為對照組(不作任何處理)、PGE2組、PGE2+哌立福辛(10 μmol/L)組、PGE2+anti-miR-21組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛(10 μmol/L)組,用于研究哌立福辛對AGS細胞增殖的作用。
4. WST-1比色法檢測細胞生存率:將1 mL電子耦合試劑加入WST-1粉末中,完全溶解,配制成WST-1溶液,4 ℃避光保存。每孔96孔板中加入10 μL WST-1溶液,在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。96孔板置于搖床搖動1 min。以空白孔調(diào)零,酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm波長處的每孔吸光度(A)值,細胞生存率(%)=處理孔A值/對照孔A值×100%。同一處理組設(shè)置6個平行孔,實驗重復(fù)3次,取均值。
5. 流式細胞儀檢測AGS細胞凋亡:收集各組AGS細胞,上流式細胞儀檢測細胞凋亡率,實驗重復(fù)3次,取均值。
6. RT-PCR法檢測miR-21表達:Trizol抽提RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PCR反應(yīng):95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 20 s,共40個循環(huán);4 ℃ 10 min。Pri-miR-21引物:正向:5’-TTT TGT TTT GCT TGG GAG GA-3’,反向:5’-AGC AGA CAG TCA GGC AGG AT-3’。以RNU6B作為內(nèi)參,正向:5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’,反向:5’-AAC GCT TCA CGA ATT TG-3’。以miR-21表達量與內(nèi)參的比值作為miR-21相對表達量。
7. 蛋白質(zhì)印跡法檢測PTEN/Akt蛋白表達:哌立福辛干預(yù)48 h后,抽提各組細胞總蛋白,BCA法行蛋白定量。以β-actin作為內(nèi)參照,每孔加入樣品蛋白30 μg,行SDS-PAGE電泳,經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)移,封閉2 h。一抗分別加入β-actin多克隆抗體(工作濃度1∶1 000)、PTEN(工作濃度1∶2 000)、Akt(工作濃度1∶1 000)、p-Akt抗體(工作濃度1∶1 000),4 ℃冰箱孵育或搖床過夜。二抗加入封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記抗體(工作濃度1∶10 000),孵育2 h。X線曝光、顯影、定影,掃描后進行圖像處理與分析。
三、統(tǒng)計學分析
一、細胞生存率
PGE2和anti-miR-21干預(yù)48 h后,與對照組相比,PGE2組AGS細胞生存率顯著升高(P<0.05),anti-miR-21組、PGE2+anti-miR-21組顯著降低(P<0.05)。與PGE2組相比,anti-miR-21組和PGE2+anti-miR-21組AGS細胞生存率顯著降低(P<0.05)(表1)。
表1 PGE2和anti-miR-21干預(yù)對胃癌細胞增殖的影響
△與對照組比較,P<0.05;#與PGE2組比較,P<0.05
二、細胞凋亡率
與對照組相比,PGE2組AGS細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),anti-miR-21組和PGE2+anti-miR-21組顯著升高(P<0.05)。與PGE2組相比,anti-miR-21組和PGE2+anti-miR-21組AGS細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖1)。
三、miR-21 mRNA表達
與對照組相比,PGE2組miR-21 mRNA表達顯著升高(P<0.05),anti-miR-21組和PGE2+anti-miR-21組顯著下降(P<0.05)。與PGE2組相比,anti-miR-21組和PGE2+anti-miR-21組miR-21 mRNA表達顯著下降(P<0.05)(圖2)。
*與對照組比較,P<0.05;#與PGE2組比較,P<0.05
四、PTEN/Akt通路與AGS細胞生長的關(guān)系
與對照組相比,PGE2組PTEN蛋白表達明顯下調(diào),p-Akt蛋白表達明顯上調(diào);與PGE2組相比,PGE2+anti-miR-21組、PGE2+哌立福辛組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組PTEN蛋白表達明顯上調(diào),PGE2+anti-miR-21組p-Akt蛋白表達明顯下調(diào),而PGE2+哌立福辛組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組未能檢測出p-Akt蛋白表達(圖3)。
與對照組相比,PGE2組AGS細胞生存率顯著升高(P<0.05),PGE2+anti-miR-21組、PGE2+哌立福辛組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組顯著降低(P<0.05)。與PGE2組相比,PGE2+anti-miR-21組、PGE2+哌立福辛組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組AGS細胞生存率均顯著下降(P<0.05)。PGE2+anti-miR-21組AGS細胞生存率與PGE2+哌立福辛組相比無明顯差異(P>0.05)(表2)。
圖3 各組AGS細胞PTEN/Akt蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)
組別A值(x±s)生存率(%)對照組1.102±0.034100PGE2組1.423±0.018*129.13PGE2+anti-miR-21組0.748±0.037*#77.49PGE2+哌立福辛組0.876±0.018*#82.56PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組0.685±0.041*#57.06
*與對照組比較,P<0.05;#與PGE2組比較,P<0.05
五、哌立福辛干預(yù)后細胞凋亡情況
與對照組相比,PGE2組AGS細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),PGE2+anti-miR-21組、PGE2+哌立福辛組、PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組顯著升高(P<0.05)。與PGE2組相比,PGE2+anti-miR-21組、PGE2+哌立福辛組和PGE2+anti-miR-21+哌立福辛組AGS細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖4)。
圖1 各組AGS細胞凋亡結(jié)果(流式細胞術(shù))
圖4 哌立福辛干預(yù)48 h后各組AGS細胞凋亡情況(流式細胞術(shù))
胃癌的發(fā)病機制復(fù)雜, 其病理生理過程涉及多種細胞與細胞因子之間的相互作用。來源于花生四烯酸的脂質(zhì)介質(zhì)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的信號分子,可通過環(huán)氧合酶(cyclooxygenase, COX)轉(zhuǎn)化為各種PG而發(fā)揮相關(guān)的生物學功能,其同工酶主要為COX-1和COX-2[8]。已有研究證實COX-2為早期瞬時表達基因,在生理情況下不表達,而在炎癥和腫瘤組織中的表達顯著上調(diào)[9]。研究[10-11]表明COX-2在各種癌前病變和腫瘤中的表達顯著增高,并與患者的預(yù)后呈負相關(guān)。COX-2的作用主要是通過其代謝產(chǎn)物PGE2來實現(xiàn)的,后者通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡、增加腫瘤侵襲和血管形成以及減少免疫監(jiān)視功能而與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段密切相關(guān)。
計春燕等[12]的研究證實COX-2/PGE2通路在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGE2作用于AGS細胞48 h后,生存率為151.9%,細胞凋亡率僅為0.5%;anti-miR-21干預(yù)后細胞生存率為51.9%,細胞凋亡率高達47.2%;PGE2+anti-miR-21聯(lián)合干預(yù)后細胞生存率為75.2%,細胞凋亡率為8.2%;PGE2組、anti-miR-21組、PGE2+anti-miR-21組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且PGE2+anti-miR-21組與PGE2組相比差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。證實PGE2能促進AGS細胞增殖,而anti-miR-21可減弱PGE2對AGS細胞增殖的刺激作用,miR-21可能介導了PGE2對AGS細胞增殖的刺激作用。
miR由70~90個核苷酸組成的發(fā)夾狀單鏈RNA前體經(jīng)Dicer酶加工而成,可調(diào)節(jié)mRNA表達或翻譯,在生物體的發(fā)育、增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要生理作用[13]。Song等[14]的研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清miR-21水平與腫瘤大小相關(guān)。Ishiguro等[15]指出,胃癌和非胃癌患者的胃組織中存在miR-21高表達。Zhang等[16]的研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中miR-21表達顯著高于癌旁組織,且與腫瘤分化、局部侵襲以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示PGE2組miR-21 mRNA表達較對照組顯著升高(P<0.05),PGE2+anti-miR-21組miR-21 mRNA表達較PGE2組顯著下降(P<0.05),提示miR-21可能參與了PGE2介導的促AGS細胞增殖作用。
為進一步了解miR-21介導的PGE2刺激AGS細胞增殖作用與PTEN/Akt信號通路是否相關(guān),本研究對Akt特異性抑制劑哌立福辛干預(yù)AGS細胞后PTEN/Akt蛋白的表達進行檢測。結(jié)果顯示PGE2組PTEN蛋白表達較對照組下調(diào),p-Akt蛋白表達較對照組上調(diào)。PGE2+anti-miR-21組PTEN蛋白表達較PGE2組上調(diào),p-Akt蛋白表達較PGE2組下調(diào),提示PTEN/Akt參與了miR-21對PGE2促AGS細胞增殖作用的調(diào)節(jié)。哌立福辛干預(yù)后,PGE2對AGS細胞的促增殖作用減弱,間接提示miR-21通過PTEN/Akt介導了PGE2對AGS細胞的促增殖作用。Yang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-21表達后,PTEN表達上調(diào),提示PTEN可作為控制胃癌發(fā)生、發(fā)展的靶點。
綜上所述,本研究證實PGE2可促進AGS細胞增殖,miR-21可能參與了PGE2促進AGS細胞增殖作用的調(diào)節(jié),而這一調(diào)節(jié)作用可能與PTEN/Akt通路有關(guān)。需開展體內(nèi)動物實驗進一步探討miR-21對胃癌的作用及其機制,為胃癌的防治提供新的生物學靶點。
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(2016-03-02收稿;2016-03-15修回)
MicroRNA-21 Mediates the Promoting of Proliferation of Gastric Cancer Cells by Prostaglandin E2through PTEN/Akt Pathway
ZHOU Hao, ZHANG Shaoren, LIU Hongyan.
Department of Gastroenterology, Jinshan Hospital of Fudan University, Shanghai (201508)Correspondence to: LIU Hongyan, Email: Liuhy1320@163.com
MicroRNAs;Stomach Neoplasms;Prostaglandins E;PTEN/Akt Pathway
10.3969/j.issn.1008-7125.2016.08.007
復(fù)旦大學附屬金山醫(yī)院院級課題(2013-院743)
#本文通信作者,Email: Liuhy1320@163.com