基于指紋圖譜與聚類分析評價不同產(chǎn)地白鮮皮藥材質(zhì)量△

冀艷花，李軍山，2*，田方

(1.神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.河北省中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050200)

白鮮皮，出自《藥性論》，載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，別名羊癬草、山牡丹、八股牛、白奶秧根、臭根皮等[1]，為蕓香科植物白鮮DictamnusdasycarpusTurcz.的干燥根皮，具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒之功效，臨床用于濕熱瘡毒、黃水淋漓、濕疹、風(fēng)疹、疥癬瘡癩、風(fēng)濕熱痹、黃疸尿赤等癥[2]?，F(xiàn)代研究表明，白鮮皮主要含生物堿、檸檬苦素、黃酮、香豆素及揮發(fā)油等類化學(xué)成分[3-6]?；谥兴幉幕瘜W(xué)成分復(fù)雜，且易受產(chǎn)地、氣候、生態(tài)環(huán)境影響的特點，僅僅依據(jù)某一種或幾種指標(biāo)化學(xué)成分的控制，并不能全面反映中藥材的質(zhì)量。中藥指紋圖譜技術(shù)源于指紋鑒定學(xué)，已成為目前國際公認(rèn)的控制中藥及天然藥物質(zhì)量的有效手段[7]。本實驗利用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)評估整體相似度，并以每批共有峰面積為指標(biāo)對購自不同主產(chǎn)地的15批白鮮皮藥材進行考察分析，以期為白鮮皮藥材質(zhì)量的控制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 樣品

15批白鮮皮藥材均購自主產(chǎn)地(具體見表1)，經(jīng)原河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任中藥師鑒定為蕓香科植物白鮮DictamnusdasycarpusTurcz.的干燥根皮，依據(jù)《中華人民共和國藥典》進行檢測，各項指標(biāo)均符合規(guī)定。

1.2 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀(島津儀器設(shè)備有限公司)，CPA225D分析天平(賽多利斯)，JM-A5002電子天平(余姚市紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司)，KH3200E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.3 試藥

黃柏酮對照品(批號：111923-201604)、梣酮對照品(批號：111700-201603)購自中國食品藥品檢定研究院；白鮮堿對照品(批號：161104)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；色譜純乙腈(批號：20170505)、分析純甲醇(批號：20170509)購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：日本GL Science公司InertSustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)作為流動相進行梯度洗脫(0～25 min，5%～28%A；25～30 min，28%A；30～40 min，28%～50%A；40～45 min，50%A；45～55 min，50%～65%A；55～70 min，65%～100%A；70～80 min，100%A)；檢測波長：228 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫為：30 ℃；進樣量：10 μL，分析時間：80 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取梣酮、黃柏酮、白鮮堿對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含梣酮60 μg、黃柏酮0.1 mg、白鮮堿0.1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號篩)約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 按2.2.2項下方法制備同一批供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以6號峰的保留時間和峰面積作為參照，計算13個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，考察儀器精密度。結(jié)果顯示，各共有峰保留時間的RSD<1.0%，各共有峰峰面積的RSD<2.8%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取同批次樣品，按2.2.2項下方法分別制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件平行測定。以6號峰的保留時間和峰面積作為參照，計算13個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間RSD<0.9%，各共有峰相對峰面積RSD<3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 按2.2.2項下方法制備同一批供試品溶液，按2.1項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12 h進樣分析。以6號峰的保留時間和峰面積作為參照，計算13個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間RSD<1.2%，各共有峰峰面RSD<3.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 樣品測定

將15批白鮮皮樣品，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣檢測，色譜圖見圖1。以峰6(S峰)作為參照峰，其余各共有峰的相對保留時間、相對峰面積見表2和表3，相似度結(jié)果見表4。

注：S1～S15.1～15批白鮮皮；R.白鮮皮共有模式。圖1 15批白鮮皮的HPLC指紋圖譜疊加圖

表2 相對保留時間

表3 共有峰相對峰面積

表4 相似度分析結(jié)果

2.5 指紋圖譜分析與評價

2.5.1 共有峰的確定 將15批白鮮皮藥材依照2.2.2項下方法制備成供試品溶液，并按2.1項下方法進行測定。將所得的15批白鮮皮HPLC 指紋圖譜依次導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”(2012版)進行全峰匹配，對比色譜圖確定共有峰為13個。將白鮮堿、黃柏酮、梣酮對照品色譜圖與樣品色譜圖中相應(yīng)位置的色譜峰進行比較，確認(rèn)樣品指紋圖譜中6號峰為白鮮堿，9號峰為黃柏酮，10號峰為梣酮(見圖2) 。

圖2 白鮮皮HPLC指紋圖譜共有峰

2.5.2 參比峰的選擇 通過對比各批樣品圖譜發(fā)現(xiàn)，白鮮堿的色譜峰(6號峰) 峰位較居中、分離度良好，峰面積較大且為所有樣品共有，故將白鮮堿峰設(shè)為參照峰。

2.5.3 聚類分析 將15批白鮮皮色譜峰相對內(nèi)參比峰的峰面積量化，得到15×13階原始數(shù)據(jù)矩陣，運用SPSS分析軟件，以歐式距離(Euclidean distance)為測度，采用組間聯(lián)結(jié)法(between-grouplink-age)對樣品進行聚類分析[8]。聚類分析譜系圖如圖3所示，15個產(chǎn)地的白鮮皮大體分為三類，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S12、S13、S14、S15為第一類，S7，S8，S9，S11為第二類，S10為第三類。

圖3 不同產(chǎn)地白鮮皮聚類分析譜系圖

2.5.4 指紋圖譜綜合評價 通過對15批不同來源的白鮮皮藥材整體觀察并結(jié)合指紋圖譜綜合評價，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地和購買地的藥材所含主要化學(xué)成分相似，但指標(biāo)成分黃柏酮、梣酮含量差異較大，RSD值高達22.12%。此外，編號S4(黑龍江五常)白鮮皮藥材圖譜在保留時間20、24、28 min處各出現(xiàn)一個較為明顯且其他批次均無的峰，具體是何種化學(xué)成分有待進一步研究。由聚類分析結(jié)果可以看出，白鮮皮藥材質(zhì)量受地域影響較為顯著，而通過聚類分析能夠直觀地將不同產(chǎn)地白鮮皮藥材成分與品質(zhì)加以區(qū)分。

3 討論

中藥材化學(xué)成分復(fù)雜，且產(chǎn)品質(zhì)量受多種因素的影響，如產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境、采收季節(jié)、儲存條件等，而中藥指紋圖譜技術(shù)能夠全面反映中藥材質(zhì)量，成為目前國際公認(rèn)的控制手段[9-10]。本研究收集5個白鮮皮主產(chǎn)地15批白鮮皮藥材，測定HPLC指紋圖譜，評價其相似度，并對15批藥材進行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)白鮮皮藥材質(zhì)量受地域影響較為顯著，提示在中藥材質(zhì)量控制上需給予重視。

本實驗考察了提取溶劑(95%乙醇、水、不同濃度甲醇)、提取方式(回流、超聲)對指紋圖譜的影響，綜合考慮提取的全面性、穩(wěn)定性以及操作簡便性等，選取100%甲醇作為白鮮皮的提取溶劑、超聲提取30 min。

本實驗使用LC-20AT的PDA檢測器進行紫外區(qū)全波長掃描，以228 nm 為檢測波長時，各色譜峰響應(yīng)較大，且峰穩(wěn)定。故確定228 nm 為檢測波長。

此外，本實驗參考文獻[11-13]色譜條件，并對色譜條件中的流動相體系進行考察，分別采用甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水進行梯度洗脫，結(jié)果表明，以乙腈-水作為流動相進行梯度洗脫，所得圖譜基線平直，峰形較好且分離度良好。