Box-Benhken響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取黃精總皂苷的條件△

趙麗蓉，羅漢，相英龍，孫慧娟，梅桂林，方成武，*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800)

黃精為百合科植物滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.、黃精PolygonatumsibiricumRed.或多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根莖[1]。始載于《名醫(yī)別錄》，黃精入藥性平而潤，味甘而淡，無毒而殺蟲[2]；其功能補氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎。用于脾胃氣虛，體倦乏力，胃陰不足等[1]。目前臨床上多用于治療糖尿病，冠心病，白細胞減少等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃精可降血糖，降血脂，能有效改善心血管功能，增強免疫力以及延緩衰老[3]。

目前考察黃精總皂苷的提取工藝中大多采用超聲法、回流法，優(yōu)化方式多采用正交試驗法。微波輔助提取法是近年來興起的提取方法，具有加熱速度快，提取時間較短，提取效率高等優(yōu)點[4]。并且響應(yīng)面優(yōu)化方法相對于傳統(tǒng)的正交法，可以更加系統(tǒng)全面的考察因素與因素之間，因素與響應(yīng)面之間的交互作用[5]。有關(guān)Box-Benhken響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取黃精總皂苷的提取工藝的文獻尚未報道，因此本研究采用單因素與響應(yīng)面優(yōu)化相結(jié)合的方法，以黃精總皂苷得率為指標，考察最佳提取條件，以期為黃精質(zhì)量評價提供參考依據(jù)，同時也為黃精資源的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UV-2012C紫外-可見分光光度(上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司)；UPC-50實驗室專用超超純水機(北京康銘時代環(huán)保科技有限公司)；JP-031B 超聲波清洗機(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；C型-800Y打粉機(南京威利朗食品機械有限公司)；4-20R通用離心機(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)；美的M3-L239C微波爐(廣東美的廚房電器制造有限公司)；FA2004萬分之一電子天平(上海上平儀器有限公司)；HWS-24恒溫水浴鍋(上海一恒有限公司)。乙醇、甲醇、冰醋酸、高氯酸等試劑均為分析純。

菝葜皂苷元對照品(批號：126-19-2)、人參皂苷Rb1對照品對照品(批號：41753-43-9)，購于南京元寶峰醫(yī)藥科技有限公司；薯蕷皂苷元(批號：512-04-9)，購于上海源葉生物科技有限公司。黃精樣品采自2017年5月湖南岳陽市，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)王德群教授鑒定為百合科植物多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根莖。

2 溶液的配制

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取菝葜皂苷元對照品2.0 mg，用甲醇定容至置10 mL容量瓶中，配得對照品濃度為0.2 mg·mL-1；精密稱取薯蕷皂苷元對照品2.5 mg，用甲醇定容至置10 mL容量瓶中，配得對照品濃度為0.25 mg·mL-1；精密稱取人參皂苷Rb1對照品10.0 mg，用甲醇定容至置10 mL容量瓶中，配得對照品濃度為1 mg·mL-1。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取黃精粉末1 g(過四號篩)，置100 mL錐形瓶中，加入50%乙醇16 mL，振搖均勻后放入微波爐，設(shè)置390 W的功率，間歇式微波提取40 S，平均每10 S拿出冷卻后再次進行微波提取。抽濾后用50%乙醇洗滌3次，合并濾液與洗滌液，用50%乙醇定容在25 mL容量瓶中，作為供試品溶液。

3 方法

3.1 波長的選擇

分別精密吸取薯蕷皂苷元對照品溶液和人參皂苷Rb1對照品溶液各250 μL，菝葜皂苷元對照品溶液500 μL和供試品溶液250 μL置于具塞試管內(nèi)，在60 ℃水浴條件下?lián)]干，加入新鮮配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，在冰浴條件下加入0.8 mL高氯酸，搖勻后在60 ℃水浴條件顯色20 min， 冷卻2 min后加入5 mL冰醋酸，搖勻后靜置，在200～800 nm條件下進行全波長掃描。空白對照為甲醇，同條件下顯色。

3.2 標準曲線的配制

分別精密吸取菝葜皂苷元標準品0.1、0.2、0.3、0.35、0.4 mL置具塞試管中，在60 ℃水浴條件下?lián)]干，按3.1項下的顯色方法進行顯色。在460 nm下測量吸光度。以進樣質(zhì)量為橫坐標，以吸光度為縱坐標建立標準曲線?？瞻讓φ諡榧状肌?/p>

3.3 微波提取黃精總皂苷的單因素實驗

通過前期查閱文獻以及預(yù)實驗，最終確定考察乙醇濃度，提取時間，料液比，微波功率四個因素，按上述條件進行樣品制備。1)固定提取時間為40 s，微波功率為390 W，料液比為1∶16，設(shè)置乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%五個水平；2)固定乙醇濃度為50%，料液比為1∶16，微波功率為390 W，設(shè)置提取時間為20、30、40、50、60 s五個水平；3)固定乙醇濃度為50%，提取時間為40 s，波功率為390 W，設(shè)置料液比為1∶8，1∶12，1∶16，1∶20，1∶24五個水平；4)固定乙醇濃度為50%，提取時間為40 s，料液比為1∶16，設(shè)置微波功率為90、240、390、550、700 W五個水平。

3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化黃精總皂苷的提取方法

在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度，提取時間，料液比三個因素為自變量，黃精總皂苷得率為因變量，用響應(yīng)面法設(shè)計三因素三水平的中心組合實驗，以優(yōu)化黃精總皂苷的提取方法。因素水平表見表1。

推薦理由:《中國傳統(tǒng)鏤版印花工藝研究》不僅是我國手工印染工藝領(lǐng)域有關(guān)“中國傳統(tǒng)鏤版印花”的第一本專著，填補空白的價值與意義十分突出，而且也是我國傳統(tǒng)鏤版印花工藝類非物質(zhì)文化遺產(chǎn)研究的重要成果之一。這是作者歷時八年用雙腳行萬里路獲取的第一手資料、精心整理分析研究而撰寫的專著。作者師從中國著名設(shè)計理論家、教育家雷圭元教授，清華大學(xué)美術(shù)學(xué)院賈京生教授為本書寫序。

4 結(jié)果與分析

4.1 黃精皂苷提取方法的確立

4.1.1 波長的選擇 經(jīng)全波長掃描得出菝葜皂苷元最大吸收波長為460 nm，薯蕷皂苷元為540 nm，人參皂苷Rb1為550 nm，黃精皂苷樣品為460 nm左右，結(jié)果顯示，菝葜皂苷元與樣品的最大吸收波長一致，因此選用菝葜皂苷元作為對照品。結(jié)果如圖1所示。

注：A.薯蕷皂苷元；B.人參皂苷Rb1；C.菝葜皂苷元；D.樣品。圖1 對照品及樣品補償掃描圖

4.1.2 標準曲線 選用菝葜皂苷元標準品繪制標準曲線，所得線性回歸方程為Y=1.781 8X-0.079 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999.表明線性關(guān)系良好。

4.2 單因素實驗結(jié)果與分析

4.2.1 乙醇濃度對黃精皂苷提取率的影響 如圖2所示，固定其他條件不變，黃精總皂苷的得率隨乙醇濃度的增大而增大，當(dāng)增加到50%時，總皂苷得率達到最大值，當(dāng)乙醇濃度超過50%時，總皂苷得率隨乙醇濃度的增大而減小。其原因可能是微波提取相對于其他提取法，在較短時間內(nèi)達到預(yù)定溫度，而乙醇濃度越高溶劑的沸點越低，達到預(yù)定溫度的時間越短，平衡加熱的時間也就越長。在大于50%的濃度條件下，總皂苷提取率較高。因此選用50%的乙醇濃度作為最佳提取濃度。

圖2 乙醇濃度對黃精總皂苷得率的影響

4.2.2 提取時間對黃精總皂苷提取率的影響 如圖3所示，固定其他條件不變，在20～40 s的微波時間內(nèi)黃精總皂苷的得率逐漸增大，在超過40 s的提取時間內(nèi)黃精總皂苷的得率逐漸減小。原因可能是微波加熱的時間過長，導(dǎo)致黃精總皂苷的結(jié)構(gòu)成分改變，得率因此降低。所以選用40 s作為最佳提取時間。

圖3 提取時間對黃精總皂苷得率的影響

4.2.3 料液比對黃精總皂苷提取率的影響 如圖4所示，固定其他條件不變，料液比在1∶8～1∶24范圍內(nèi)，在1∶16時黃精總皂苷得率達到最大值。原因可能是當(dāng)料液比較低時黃精總皂苷的溶液達到飽和，提取率不完全所致；當(dāng)料液比增大時，結(jié)果表明皂苷得率波動不大，對提取率的影響不大，反而增加了濃縮時間。因此選用料液比為1∶16時較為合適。

圖4 料液比對黃精總皂苷得率的影響

4.2.4 微波功率對黃精總皂苷提取率的影響 如圖5所示，固定其他條件不變，設(shè)置微波功率范圍為90～700 W，當(dāng)功率在390 W時，黃精總皂苷得率達到最大值，其他功率皂苷得率都有降低。分析原因可能是隨著微波功率的增大，電磁波發(fā)射出的頻率越大，物質(zhì)內(nèi)部產(chǎn)生的熱能越大，皂苷溶質(zhì)逐漸溶出。提取率逐漸增大；而功率過高，有效成分破壞，提取率逐漸減小。綜合考慮，選用390 W作為最佳提取功率。

圖5 微波功率對黃精總皂苷得率的影響

4.3 響應(yīng)面法實驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素結(jié)果，選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)三個因素進行Box-Benhken響應(yīng)面優(yōu)化，其中1～12組實驗為析因設(shè)計，13～17組實驗為中心設(shè)計；零點實驗共設(shè)計五組，用以估算實驗誤差。響應(yīng)面設(shè)計以A、B、C為自變量，以總皂苷得率(Y)為因變量，設(shè)計方案如表2所示。

對表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得出回歸方程為Y=3.72-0.2A-0.074B-0.067C-2.5AB-0.03AC+ 0.01BC-0.91A2-0.62B2-0.77C2并作出響應(yīng)面圖和等值線圖。對該模型進行響應(yīng)面分析，得出二次響應(yīng)回歸模型的方差分析，分析結(jié)果如表3所示。

由方差分析結(jié)果可見，該模型的顯著型檢驗中F=383.63，P<0.01表明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義；而在失擬項中F=383.63，P>0.05表明失擬項無統(tǒng)計學(xué)意義。且該模型的校正決定性系數(shù)RAdj2=0.9954，表明該實驗?zāi)Ｐ蛯Ρ緦嶒灥臄M合度較好，能夠較好的反映提取時間、乙醇濃度、料液比三個因素對黃精總皂苷得率的影響。另外，分析結(jié)果中，回歸方程的一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2的P值均小于0.05或0.01，說明各個因素對結(jié)果的影響不是簡單的線性關(guān)系。由F值可知A>B>C，表明各單因素對實驗結(jié)果的影響順序為：乙醇濃度>料液比>提取時間[6-8]。

采用Design-Expert.8.0 軟件對結(jié)果進行響應(yīng)面分析，結(jié)果如圖6～8。

圖6 乙醇濃度與提取時間的響應(yīng)面與等值線

圖7 乙醇濃度與料液比的響應(yīng)面與等值線

圖8 料液比與提取時間的響應(yīng)面與等值線

圖6～8表示當(dāng)A、B、C中任意一個因素變?yōu)?時，其他兩個因素對提取率的影響以及交互作用。由圖6可知，固定料液比不變時，黃精總皂苷得率隨乙醇濃度和提取時間的增大而增大，當(dāng)乙醇濃度范圍在38%～58%， 提取時間范圍在28～50 s 時，總皂苷含量最大，超過此范圍含量降低；由圖7可知，固定提取時間不變時，黃精總皂苷得率隨乙醇濃度和料液比的增大而增大，當(dāng)乙醇濃度范圍在38%～58%，料液比范圍在1∶11～1∶21時，總皂苷含量最大，超過此范圍含量降低；由圖8可知，固定乙醇濃度不變時，黃精總皂苷得率隨料液比和提取時間的增大而增大，當(dāng)料液比范圍在1∶13～1∶19時，提取時間范圍在29～49 s，總皂苷含量最大，超過此范圍含量降低[9-10]。

經(jīng)Design-Expert.8.0 軟件分析，黃精總皂苷最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為50%，料液比為1∶16，提取時間為40 s。預(yù)測值為3.72%。

4.4 驗證實驗

基于上述分析結(jié)果得出的最佳提取工藝，進行微波提取黃精總皂苷，平行三次實驗。三次實驗所得結(jié)果的平均值為3.70%，與模擬預(yù)測值接近。說明該模型優(yōu)選出的最佳提取工藝真實可靠，具有實際意義。

5 討論

本實驗以紫外分光光度法為檢測手段，考察了微波提取黃精總皂苷的最佳工藝，以香草醛-冰醋酸法進行顯色。將薯蕷皂苷元、菝葜皂苷元、人參皂苷Rb1三種標準品與黃精樣品的最大吸收波長進行對比，確定以菝葜皂苷元作為對照品；根據(jù)單因素實驗結(jié)果，確定乙醇濃度、提取時間、料液比三個因素進行三水平三因素的響應(yīng)面優(yōu)化，最后用Design-Expert.8.0 軟件對結(jié)果進行分析。優(yōu)選出最佳提取工藝為乙醇濃度為50%，料液比為1∶16，提取時間為40 s。方差分析結(jié)果表明：該模型對本實驗的擬合度較好，可以較為準確的預(yù)測結(jié)果，具有實際意義。

致謝：本次實驗所用黃精藥材由王德群教授的學(xué)生彭星星于2017年5月采自湖南岳陽市，特此感謝。