HPLC定量分析千斤拔藥材中染料木苷和染料木素的含量△

張鵬，彭開鋒，李伏君，龔云，劉逆夫，付卡利，楊秀偉，王龍

(1.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412000；2.北京大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物學(xué)系/天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；3.約翰霍普金斯大學(xué)，美國(guó) 巴爾的摩 21218)

婦科千金片和婦科千金膠囊是收載于《中華人民共和國(guó)藥典》(《中國(guó)藥典》)2015版一部的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，具有清熱除濕、益氣化瘀之功效；用于濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，癥見帶下量多、色黃質(zhì)稠、臭穢，小腹疼痛，腰骶酸痛，神疲乏力，慢性盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎、慢性宮頸炎見上述證候者。組方藥味包括千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木、單面針、當(dāng)歸、雞血藤和黨參[1]。君藥千斤拔，《中國(guó)藥典》2015版四部收載的基原植物有蔓性千斤拔Moghaniaphilippinensis(Merr.et Rolfe) Li、大葉千斤拔M.macrophylla(Willd.) O.Kuntze和銹毛千斤拔M.ferruginea(Wall.ex Benth.) Li.[2]。千斤拔性溫，味甘、辛，民間多用于治療風(fēng)濕骨痛、慢性腎炎、跌打損傷、白帶多和痛經(jīng)等[3-5]。已有研究表明，千斤拔含有大量的黃酮類化合物[6-9]，其中的染料木苷(genistin)和染料木素(genistein)具有顯著的抗氧化、類激素、抗菌、抗癌和保護(hù)心血管等作用[10-12]。而有關(guān)以千斤拔作為君藥的中成藥婦科千金片、婦科千金膠囊、金雞膠囊等治療婦科疾病和風(fēng)濕病的作用基礎(chǔ)，正是該味藥中起激素作用和抗炎、抗氧化作用的化學(xué)成分。因此，本研究選取染料木苷和染料木素2個(gè)活性成分作為含量測(cè)定的指標(biāo)，建立測(cè)定方法，為評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣提供方法學(xué)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀[沃特世科技(上海)有限公司]，AB204-S型十萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司)，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)Z102微型植物粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑和試藥

對(duì)照品染料木苷(供含量測(cè)定用，批號(hào)：111709-201702)和染料木素(供含量測(cè)定用，批號(hào)：111704-201302)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。色譜純乙腈(美國(guó)Merck公司)，分析純甲醇和乙酸乙酯(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，分析純?nèi)燃淄?天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，分析純冰醋酸和磷酸(湖南匯虹試劑有限公司)。

9批次千斤拔樣品信息見表1，經(jīng)株洲千金藥業(yè)股份有限公司劉逆夫副教授分別鑒定為蔓性千斤拔Moghaniaphilippinensis(Merr.et Rolfe) Li和大葉千斤拔M.macrophylla(Willd.) O.Kuntze的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序見表2，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL；理論塔板數(shù)以染料木苷和染料木素計(jì)，不低于5000；分離度以染料木苷和染料木素計(jì)算，大于1.50。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取染料木苷對(duì)照品約17.5 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成699.3 μg·mL-1的染料木苷對(duì)照品貯備溶液；精密稱取染料木素對(duì)照品約16.5 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成1 635.15 μg·mL-1的染料木素對(duì)照品貯備溶液。

分別精密量取對(duì)照品貯備液，染料木苷20 mL和染料木素2 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成染料木苷質(zhì)量濃度為559.44 μg·mL-1和染料木素質(zhì)量濃度為130.81 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

將混合對(duì)照品溶液精密稀釋成染料木苷質(zhì)量濃度分別為17.483、34.965、69.930、139.860、279.720 μg·mL-1，染料木素質(zhì)量濃度分別為4.088、8.176、16.352、32.703、65.406 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取大葉千斤拔藥材粉末(過(guò)40目篩)5.00 g，加入50%乙醇水溶液75 mL，稱定質(zhì)量，于水浴中在85 ℃回流提取1 h，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別吸取對(duì)照品和供試品溶液，按2.1色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果表明，供試品色譜圖中，具有與對(duì)照品溶液色譜圖中相同保留時(shí)間的色譜峰，供試品中分析物色譜峰與其相鄰色譜峰均能達(dá)到基線分離，分離度符合要求。

注：A.對(duì)照品；B.供試品。圖1 千斤拔及對(duì)照品HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

取2.2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液梯度溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，分別注入液相色譜儀，按2.1色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積。以各組分質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。染料木苷的回歸方程為Y=53 167X+151 520(r=0.999 7)，染料木素的回歸方程為Y=7259X+48 586(r=0.999 8)，染料木苷在質(zhì)量濃度17.483～279.720 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好；染料木素在質(zhì)量濃度4.088～65.406 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液，按2.1色譜條件分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果，染料木苷和染料木素峰面積的RSD分別為0.40%和1.09%(n=6)，表明本方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.2.2項(xiàng)下的供試品溶液，分別在放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按2.1色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。結(jié)果表明，染料木苷和染料木素峰面積的RSD分別為0.76%和0.58%(n=6)，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取大葉千斤拔樣品(批號(hào)：141208)6份，精密稱定，按2.2.2方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，分別測(cè)定6份樣品中染料木苷和染料木素的含量，計(jì)算RSD值。結(jié)果RSD值分別為1.08%和3.16%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 中間精密度試驗(yàn)

同2.7操作，分別由兩名不同的分析人員使用不同的儀器對(duì)本品進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，染料木苷和染料木素含量測(cè)定的RSD值分別為5.78%和3.15%(n=12)，表明本方法中間精密度良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取大葉千斤拔粉末(批號(hào)：141208)約2.5 g(共9份)，精密稱定，分置具塞錐形瓶中，分別加入對(duì)照品溶液量為樣品量對(duì)應(yīng)化合物量的50%～150%，設(shè)3次重復(fù)，按2.2.2方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3和4。

2.10 樣品含量測(cè)定

取9批次千斤拔樣品各5.0 g，精密稱定，分別按2.2.2方法制備供試品溶液，并按2.1色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積計(jì)算樣品中各待測(cè)物質(zhì)的含量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道[13]，染料木苷和染料木素在261 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，本文對(duì)染料木苷和染料木素進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)染料木苷和染料木素在260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故最終將其測(cè)定波長(zhǎng)定為260 nm。

3.2 提取方法選擇

本方法考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇水及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)甲醇水作為提取溶劑對(duì)染料木苷和染料木素提取率的影響，結(jié)果隨著有機(jī)溶劑比例從30%增加到50%，染料木苷和染料木素的提取率增加，有機(jī)溶劑比例從50%增加到95%，染料木苷和染料木素的提取率下降，且50%乙醇水提取出的染料木苷和染料木素的總量最高，故選定50%乙醇水作為提取溶劑。提取時(shí)間采用熱回流提取30、60、90 min，發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間的推移含量增加，但是增加不大，故選擇50%乙醇水熱回流提取60 min。

3.3 流動(dòng)相選擇

本方法在楊啟明等[13]所使用的相關(guān)方法上進(jìn)行優(yōu)化，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，能使待測(cè)組分得到很好分離。

3.4 不同產(chǎn)地各成分含量測(cè)定結(jié)果分析

通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地蔓性千斤拔和大葉千斤拔的含量測(cè)定結(jié)果分析，蔓性千斤拔以云南勐侖和湖南炎陵兩個(gè)地區(qū)產(chǎn)的染料木苷和染料木素的含量最高，大葉千斤拔以福建泉州產(chǎn)的染料木苷和染料木素的含量最高，提示其可能是最適合千斤拔生長(zhǎng)的環(huán)境，結(jié)合其他研究可以進(jìn)一步確定千斤拔屬植物產(chǎn)地的道地性。

本研究所建立的含量測(cè)定方法能夠用于同時(shí)測(cè)定千斤拔中染料木苷和染料木素的含量，方法操作簡(jiǎn)便、精密度高、分離效果好，可為千斤拔藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)以及合理開發(fā)利用提供依據(jù)。