6種中藥材黃曲霉毒素B1快速檢測方法研究△

李細(xì)芬，毛雯雯，張雅琴，馮紅，許宏亮，李彥川，蔡瑩瀛，張?zhí)m蘭

(數(shù)字本草檢測有限公司，天津 300400)

中藥材容易受到黃曲霉毒素的污染已是不爭的事實，相應(yīng)地，中藥材黃曲霉毒素檢測方法也成為目前的研究熱點，已有較多文獻(xiàn)報道[1-7]。目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要為高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。液相色譜法為常規(guī)檢測方法，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法一般為確證方法[8]。兩種方法特異性強、靈敏度高、定量準(zhǔn)確，但步驟繁瑣，耗時費力，成本高昂，不利于中藥材黃曲霉毒素的快速檢測，尤其是缺乏實驗條件的藥材集散地、種植粗加工產(chǎn)地難以廣泛普及。因此，急需開發(fā)一種成本低廉、方便快捷、簡單易學(xué)的檢測方法，以便于對中藥材黃曲霉毒素進(jìn)行隨時隨地檢測。

膠體金法，又稱膠體金免疫層析法(Gold immunochromatography assay，GICA)，是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫技術(shù)和固相層析技術(shù)等多種方法有機結(jié)合在一起的檢測技術(shù)。膠體金法以其簡單快速、結(jié)果直觀、成本低廉的顯著優(yōu)勢，在醫(yī)學(xué)檢驗、食品安全等領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛。由于中藥材成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，在中藥材檢測中應(yīng)用較少，僅有少量文獻(xiàn)報道。林方芬[9]等應(yīng)用膠體金方法檢測中藥飲片，結(jié)果與ELISA方法一致；李輝[10]考察了中藥材對膠體金檢測方法的基質(zhì)影響，提出中藥成分中不含黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)類似物香豆素類成分的藥材對本法檢測結(jié)果影響較小。以上研究均未對膠體金方法檢測酸棗仁、蓮子、薏苡仁、檳榔、決明子和遠(yuǎn)志6種中藥材的前處理方法進(jìn)行詳細(xì)報道，本研究旨在通過對6種中藥材前處理方法進(jìn)行研究，建立酸棗仁等6種中藥材的膠體金快速檢測方法，為膠體金方法應(yīng)用到更多中藥材黃曲霉毒素的快速檢測提供參考。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀；Agilent G1321A FLD檢測器；Aura U.S.A光化學(xué)衍生器；Agilent Zorbax C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；湘儀H1850型離心機；Sartorius QUINTIX224-1CN分析天平；超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試劑與材料

黃曲霉毒素對照品，具體信息見表1。分析甲醇(天津康科德化學(xué)試劑公司)；色譜甲醇(德國默克公司)，黃曲霉毒素B1膠體金檢測卡(本公司自己生產(chǎn)，批號20160831)；黃曲霉素總量免疫親和柱(天津博納艾杰爾科技有限公司)；酸棗仁、蓮子、薏苡仁、檳榔、決明子和遠(yuǎn)志藥材樣品，均購自河北省保定市安國藥材市場。

2 實驗方法

2.1 中藥材黃曲霉毒素B1膠體金快速檢測方法

中藥材品種間基質(zhì)差異較大，對膠體金中抗原抗體反應(yīng)以及膠體金顯色的影響不一，因此需對藥材的前處理方法分別進(jìn)行研究。

2.1.1酸棗仁、蓮子、薏苡仁前處理方法 稱取用液相方法檢測不含黃曲霉毒素的酸棗仁、蓮子和桃仁樣品粉末各若干份，每份1.0 g，添加黃曲霉毒素B1對照品溶液，制成含黃曲霉毒素B10，2.5，5，7.5 μg·kg-1的樣品，加5 mL 70%甲醇(含氯化鈉4%)，渦旋3 min，離心，取上清500 μL于蒸發(fā)皿中，置水浴上揮干，再加1000 μL PBS復(fù)溶，得樣品檢測液。取樣品檢測液100 μL滴加到檢測卡上，觀察檢測結(jié)果。

2.1.2決明子、檳榔和遠(yuǎn)志樣品前處理方法 稱取用液相方法檢測不含黃曲霉毒品素的檳榔、決明子和遠(yuǎn)志樣品粉末各若干份，每份1.0 g，添加黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)對照品溶液，制成含AFB10，2.5，5，7.5 μg·kg-1的樣品，加5 mL 70%甲醇(含氯化鈉4%)，渦旋3 min，離心，取1 mL上清液，加入4 mL水進(jìn)行稀釋，取稀釋后溶液5 mL過免疫親和柱。過柱方法：5 mL上樣，5 mL水洗，1 mL甲醇洗脫。取500 μL洗脫液揮干，加1000 μL 2%BSA/PBS復(fù)溶，得樣品樣測液。取樣品檢測液100 μL滴加到檢測卡上，觀察檢測結(jié)果。

2.1.3膠體金快檢方法特異性考察 以酸棗仁樣品為例，將AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到陰性酸棗仁粉末中，制備成5、10、20 μg·kg-1系列濃度，再依法制備AFB2、AFG1、AFG2系列濃度樣品，按“2.1.1法”處理，每濃度取100 μL滴加到檢測卡上，觀察檢測結(jié)果。

2.1.4膠體金法檢測樣品重復(fù)性考察 取“2.1.1法”中添加2.5和7.5 μg·kg-1的酸棗仁樣品，按“2.1.1法”處理，每個濃度重復(fù)檢測10次，觀察膠體金檢測卡的重復(fù)性。

2.2 中藥材黃曲霉毒素液相色譜檢測方法

2.2.1對照品溶液的制備 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2對照品溶液配制：分別將對照品全部轉(zhuǎn)移至適當(dāng)容積的容量瓶中，用甲醇洗滌2～3次，一并轉(zhuǎn)移至同一容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻即得。

混合對照品貯備溶液的配制：分別精密吸取黃曲霉毒素4種標(biāo)準(zhǔn)溶液適量至適當(dāng)容量瓶中，用70%甲醇定容，最后得AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的濃度分別為40、12、40、12 ng·mL-1。

混合對照品溶液的制備：精密量取上述混合對照品貯備溶液，用70%甲醇制成每1 mL分別含AFB1、AFG12.5、5、10、20、40 ng；AFB2、AFG20.75、1.5、3、6、12 ng的溶液，即得。

2.2.2 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；FLD熒光檢測器，激發(fā)波長=360 nm，發(fā)射波長=440 nm；流動相：甲醇-水(45∶55)，等度洗脫；柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量50 μL。兩個相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。

2.2.3黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度，依次進(jìn)樣檢測。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4供試品溶液制備 取藥材樣品粉末(過二號篩)約15 g，精密稱定，置于均質(zhì)器中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2分鐘(攪拌速度大于11000 r·min-1)，離心5分鐘(離心速度2500 r·min-1)，過濾，精密取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，量取續(xù)濾液20.0 mL，通過免疫親和柱，流速每分鐘3 mL，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用1.5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，并用純水定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.5 HPLC方法學(xué)考察 (1)線性范圍：精密吸取上述不同濃度的混合對照品溶液，按2.2.2色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算線性范圍。(2)精密度：取“(1)線性范圍”項下，AFB1、AFG1濃度為10 ng·mL-1，AFB2、AFG2濃度為3 ng·mL-1的混合對照品溶液，按照2.2.2項下的色譜條件進(jìn)行分析，一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)進(jìn)樣兩天，分別記錄AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的峰面積，計算日內(nèi)和日間RSD值。(3)重復(fù)性：取陽性蓮子樣品做重復(fù)性試驗。按2.2.4藥材供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，并按2.2.2色譜條件進(jìn)行分析。(4)回收率：取陰性薏苡仁樣品做回收率試驗。AFB1、AFG1的添加水平為10 μg·kg-1，AFB2、AFG2的添加水平為3 μg·kg-1。按2.2.4供試品溶液制備方法，精密添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，平行制備6份供試品溶液，并按2.2.2色譜條件進(jìn)行分析，計算回收率。(5)檢測項與定量限：根據(jù)信噪比S/N=3和S/N=10確定目標(biāo)物的檢出限和定量限。

2.3 中藥材樣品快檢結(jié)果與液相結(jié)果驗證

收集酸棗仁、蓮子、薏苡仁、檳榔、遠(yuǎn)志，決明子樣品若干份，分別按2.1.1和2.1.2方法用膠體金試紙條檢測，獲得快檢結(jié)果；同時按2.2.4方法進(jìn)行HPLC檢測，獲得液相結(jié)果；將兩種方法檢測結(jié)果進(jìn)行對比，判斷兩種方法的符合率。

3 結(jié)果與分析

3.1 膠體金快速檢測方法考察結(jié)果

3.1.1 酸棗仁、蓮子、薏苡仁樣品膠體金快速檢測基質(zhì)干擾與靈敏度 酸棗仁樣品添加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品后經(jīng)膠體金檢測卡檢測，檢測線(T線)0和2.5 μg·kg-1顯色，5和7.5 μg·kg-1濃度不顯色，結(jié)果如圖1，即5 μg·kg-1消線。通過實驗發(fā)現(xiàn)，蓮子和薏苡仁基質(zhì)干擾與酸棗仁相似，可用同一種方法消除，結(jié)果同圖1。因此，本膠體金檢測卡檢測酸棗仁、蓮子和薏苡仁樣品的靈敏度為5 μg·kg-1，大于5 μg·kg-1的樣品均不顯色，為陽性。

圖1 酸棗仁快檢方法靈敏度試驗結(jié)果

3.1.2 決明子、檳榔和遠(yuǎn)志樣品膠體金快速檢測基質(zhì)干擾與靈敏度 決明子、檳榔和遠(yuǎn)志藥材色素較重，未經(jīng)凈化滴加在膠體金檢測卡上，背景很深，影響檢測線的顯色。因而無法檢測，如圖2。決明子和遠(yuǎn)志藥材情況類似，圖略。決明子等3種藥材添加系列黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)品后，按方法2.1.2操作，將樣品提取液通過免疫親和柱凈化，凈化后樣品檢測液色素明顯減輕，從而消除了色素干擾，0和2.5 μg·kg-1濃度顯色，5和7.5 μg·kg-1濃度不顯色，即5 μg·kg-1消線，大于5 μg·kg-1的樣品均不顯色，為陽性。結(jié)果同圖1。因此，本膠體金檢測卡檢測遠(yuǎn)志、決明子和檳榔樣品的靈敏度為5 μg·kg-1。

3.1.3膠體金法檢測樣品特異性 對添加系列濃度黃曲霉毒素的酸棗仁樣品用膠體金檢測卡進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示AFB15～20 μg·kg-1均呈顯著抑制，T線不顯色，結(jié)果如圖3。對AFB25～20 μg·kg-1均無抑制，T線均顯色，結(jié)果如圖4，AFG1、AFG2反應(yīng)結(jié)果與AFB2相同，均無抑制，圖略。說明本膠體金試紙條對AFB1有特異性，只識別黃曲霉毒素B1，而與其他3種黃曲霉毒素?zé)o交叉反應(yīng)。

圖2 檳榔樣品過柱前后檢測結(jié)果

圖3 膠體金法對B1檢測結(jié)果圖

圖4 膠體金法對B2檢測結(jié)果

3.1.4膠體金法檢測樣品重復(fù)性 用膠體金檢測卡檢測2.5和7.5 μg·kg-1兩個濃度酸棗仁樣品，每個濃度重復(fù)10次，結(jié)果顯示2.5 μg·kg-1濃度均顯色，為陰性，且顯色一致性較好，如圖5；7.5 μg·kg-1濃度均不顯色，為陽性。結(jié)果如圖6。

圖5 膠體金法檢測2.5 μg·kg-1濃度重復(fù)性結(jié)果

圖6 膠體金法檢測7.5 μg·kg-1濃度重復(fù)性結(jié)果

3.2 黃曲霉毒素液相檢測方法考察

3.2.1黃曲霉毒素HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 精密吸取不同濃度的混合對照品溶液，進(jìn)行液相分析。黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖7。相鄰色譜峰之間的分離度分別為3.15、2.24、2.08。

以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算線性范圍。結(jié)果顯示對照品濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r≥0.999，結(jié)果見圖8。黃曲霉毒素B1、G1在2.5～40 ng·mL-1，黃曲霉毒素B2、G2在0.75～12 ng·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

圖7 4種黃曲霉毒素HPLC圖

3.2.2 黃曲霉毒素HPLC精密度 同一濃度黃曲霉毒素混合對照品溶液，一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)進(jìn)樣兩天，計算日內(nèi)和日間峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2日內(nèi)精密度RSD分別為1.17%、1.62%、2.69%、2.52%；日間精密度RSD分別為1.66%、1.26%、2.69%、2.62%。

由此可見，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的日內(nèi)和日間峰面積RSD均小于3%，表明方法精密度良好。

圖8 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.3黃曲霉毒素HPLC重復(fù)性 取陽性蓮子樣品平行檢測6份得出重復(fù)性結(jié)果。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的計算結(jié)果RSD分別為4.85%、6.74%、3.04%、7.30%，均小于8%，說明黃曲霉HPLC法重復(fù)性良好。

3.2.4黃曲霉毒素HPLC回收率 對添加了黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的薏苡仁陰性樣品按2.2供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液進(jìn)行液相色譜法檢測。回收率結(jié)果見表2，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的回收率在87.9%～98.0%之間，RSD均小于5.0%。

3.3 快檢方法與液相方法比對

收集酸棗仁樣品20批、蓮子15批、薏苡仁19批、檳榔17批，遠(yuǎn)志20批、決明子20批，共計111批次，同時用膠體金快檢方法和液相色譜法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果見表3。111批次樣本中109批次檢測結(jié)果與液相結(jié)果相符，快檢方法的判斷準(zhǔn)確率為98.2%。其中出現(xiàn)2例與液相結(jié)果不符合的情況，檳榔B006號、遠(yuǎn)志Y001號液相結(jié)果分別為4.5 μg·kg-1和3.4 μg·kg-1，而膠體金快檢方法判斷為陽性(為黃曲霉毒素B1超標(biāo)，可能為樣品中的黃曲霉毒素含量較為接近藥典標(biāo)準(zhǔn)5 μg·kg-1，從而出現(xiàn)誤判。因此，快檢方法適合黃曲霉毒素的初篩性檢查，如遇可疑結(jié)果還需用藥典標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行確證。

4 討論

對本公司檢測數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)報道[11-12]分析，選擇酸棗仁、薏苡仁、蓮子、決明子、檳榔和遠(yuǎn)志6種黃曲霉毒素污染率高的藥材進(jìn)行膠體金快檢方法摸索。6種藥材基質(zhì)不同，需采用不同的前處理方法消除基質(zhì)影響。

酸棗仁、薏苡仁和蓮子基質(zhì)影響相對較少，通過70%甲醇提取、離心，上清液揮干，除掉提取液中有機溶劑甲醇，再用PBS緩沖溶液復(fù)溶，復(fù)溶后溶液較為澄清，基本為無色，用膠體金檢測卡進(jìn)行檢測時，膠體金顯色基本不受基質(zhì)干擾，零濃度顯色清晰，隨著樣品中黃曲霉毒素濃度的增加，顯色逐漸變淺，直至不顯色。這是由于黃曲霉毒素膠體金法采用的是免疫競爭原理，樣品中黃曲霉毒素的濃度與試紙條上檢測線的顏色呈反相關(guān)。當(dāng)樣品中的黃曲霉毒素濃度達(dá)到5 μg·kg-1及以上時，檢測線完全被抑制不顯色，為陽性結(jié)果；低于5 μg·kg-1，檢測線顯色，為陰性。這種判斷符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)，因此可用于對酸棗仁、薏苡仁和蓮子中的黃曲霉毒素B1進(jìn)行初篩性檢測。

表3 111批次樣品兩種方法檢測結(jié)果

注：表中“+”表示超過藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，“-”表示未超過藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

檳榔、遠(yuǎn)志和決明子用甲醇提取后，色素過重，僅用揮干有機溶劑的方法不能消除色素等基質(zhì)的影響。因此，需采用一定的凈化方法，將提取物中的色素等其他雜質(zhì)清除或降低。黃曲霉毒素免疫親和柱凈化是目前較好的凈化方法，它采用的是特異性抗原抗體結(jié)合原理，不能與親和柱中包埋的黃曲霉毒素抗體結(jié)合的雜質(zhì)流出柱子，只有黃曲霉毒素能結(jié)合在柱體上，再用甲醇進(jìn)行洗脫，從而實現(xiàn)目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離，有效消除了基質(zhì)影響。膠體金法樣品需要量少，只需取1mL提取液過柱凈化，節(jié)省了實驗時間，實現(xiàn)了檳榔、遠(yuǎn)志和決明子的快速檢測，整個樣品檢測30 min內(nèi)可完成。

液相色譜法檢測黃曲霉毒素一般有多種流動相系統(tǒng)：甲醇-水[13]，甲醇-乙腈-水[14]，乙腈-水[15]，需根據(jù)實驗室液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行選擇優(yōu)化。本實驗室液相色譜系統(tǒng)選用甲醇-水(45∶55)作流動相，取得了較好效果，4種黃曲霉毒素分離度均在1.5以上，精密性、回收率和重復(fù)性良好，檢測一個樣品約需5 h完成。而快檢方法只需要30 min即可完成，大大提高了樣品的檢測效率。快檢方法使用過程中無需使用黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，只需膠體金檢測卡和少量試劑即可完成，安全、環(huán)保、省時、省力、省成本，無需專業(yè)人員、可用于大量樣本的快速篩查和現(xiàn)場及時篩查。

本文對2015版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定的19種藥材中的6種進(jìn)行了快檢研究，其它藥材的快檢有待今后繼續(xù)研究。