糖尿病膀胱功能障礙小鼠的膀胱功能及尿動力學改變

談博，　連大衛(wèi)，　黃涌鑫，　范平龍，　操紅纓，　黃萍

（廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州　510006）

糖尿病膀胱功能障礙小鼠的膀胱功能及尿動力學改變

談博，連大衛(wèi)，黃涌鑫，范平龍，操紅纓，黃萍

（廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州510006）

【目的】探討糖尿病膀胱功能障礙小鼠的尿動力指標、小鼠膀胱功能的變化，為進一步探討中藥活性成分作用機制奠定基礎?！痉椒ā窟x用C57BL/6雄性小鼠，隨機分為空白對照組、模型組，空白對照組給予普通飼料，模型組給予高脂純化配方飼料，連續(xù)喂養(yǎng)4周。模型組腹腔注射鏈脲佐菌素（劑量為200 mg/kg），空腹血糖值到達10.5 mmol/L視為造模成功；造模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)12周，測定口服葡萄糖耐量（OGTT）、糖化血清蛋白（GSP）、空腹血糖值（FBG）和胰島素（INS）；進行小鼠尿動力學測定，并用powerlab生物信號系統(tǒng)測小鼠膀胱肌條功能；對膀胱組織行蘇木素—伊紅（HE）和Masson染色后采用光鏡觀察病理情況。【結果】造模12周后，與空白對照組小鼠比較，模型組小鼠的OGTT、GSP、FBG、INS均顯著增加（P＜0.01）；尿動力檢測中，膀胱漏尿點壓（BLPP）、排尿期的最大排尿壓（MVP）、排尿率（EV）均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），而膀胱最大容量（MBC）、膀胱順應性（BC）以及殘余尿量（PVR）均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；離體肌條檢測中，肌條對α，β-meATP、Carbachol、Capsaicin、KCl誘發(fā)的逼尿肌條舒縮反應顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。光鏡觀察HE染色切片，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的膀胱逼尿肌層束排列紊亂且間隙明顯增寬，Masson染色切片發(fā)現(xiàn)膠原纖維成分下降?！窘Y論】糖尿病小鼠膀胱的運動及感覺功能均出現(xiàn)功能障礙，并出現(xiàn)組織形態(tài)學變化，進入膀胱功能低下的失代償期。

糖尿病膀胱；尿動力學；膀胱肌條；膀胱/病理學；疾病模型，動物；小鼠

糖尿病是當前威脅全球人類健康的最重要的非傳染性疾病之一。糖尿病膀胱功能障礙（diabetic bladder dysfunction，DBD），又稱為糖尿病性膀胱（diabetic cystopathy，DCP），是糖尿病最常見的泌尿系并發(fā)癥之一，影響50%以上的糖尿病患者［1］。目前針對DBD的臨床治療手段雖然不少，但都是屬于經驗性治療或對癥治療，常見的治療方法有行為治療、藥物治療、神經調節(jié)治療等，嚴重者可采取手術治療，如骨盆懸吊或膀胱頸懸吊，但療效皆不盡如人意［2］。本研究對糖尿病膀胱功能障礙小鼠的膀胱功能及尿動力學進行觀察，為探求有效的治療方法、篩選中藥活性成分及探討其藥理作用機制提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigma公司，批號：031M1287V）；辣椒素（Capsaicin，美國Cayman chemical公司，批號：0441703-13）；α，β-亞甲基-ATP（α，β-me ATP，美國Sigma公司，批號：SLBG3834V）；卡巴膽堿（Carbachol，山東博士倫福瑞達制藥有限公司，批號：H10950174）；體積分數(shù)95%O2、5%CO2混合氣體（廣州君多氣體有限公司，批號：A5A007）；氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、無水氯化鈣（CaCl2）、無水硫酸鎂（MgSO4）、硫酸二氫鉀（KH2PO4）和無水葡萄糖（C6H12O6）均為天津市大茂化學試劑廠產品。高溫滅菌柜（HVE-50，日本HIRAYAMA生產公司）；Laborie UDS-94型尿動力學檢查儀（加拿大Laborie公司）；WZ-50C6型微量注射泵（浙江史密斯醫(yī)學儀器有限公司產品）；生物機能記錄系統(tǒng)（澳大利亞 AD Instruments Powerlab公司產品）；Multiskan Go 1510全波長酶標儀（美國Thermo scientific公司）。

1.2實驗動物SPF級C57BL/6小鼠，雄性，體質量20～22 g，由廣東省實驗動物中心提供，合格證號為：SCXK（粵）2013-0002，在廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)并完成實驗。

1.3造模方法參考文獻［3］方法，取以上C57BL/ 6小鼠30只，隨機分為2組，即空白對照組、模型組?？瞻讓φ战M給予普通飼料，模型組給予高糖高脂飼料，定量飲食，自由飲水。高糖高脂飼料造模4周后，動物禁食不禁水12 h，模型組動物按200 mg/kg的劑量一次性腹腔注射STZ（臨用前用0.1 mmol/L，pH 4.4的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液配制成10 mg/L的STZ溶液，30 min內使用完），空白對照組腹腔注射等體積的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液。于STZ造模72 h后，動物禁食不禁水測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），F(xiàn)BG值到達10.5 mmol/L者視為造模成功，再連續(xù)喂養(yǎng)至12周，最后造模成功小鼠有8只。

1.4觀察指標

1.4.1模型小鼠血糖、口服糖耐量、糖化血清蛋白及胰島素的變化造模12周后，小鼠禁食不禁水8 h，于尾尖采血，用血糖試紙測定0 min血糖值；然后灌服500 mg/L葡萄糖溶液（劑量為1.5 g/ kg）；此后分別于15、30、60、120 min，尾尖采血，用血糖試紙測定血糖值，并計算血糖曲線下面積（AUC）；同時檢測糖化血紅蛋白及胰島素含量。

1.4.2模型小鼠尿動力學的變化［4］造模成功12周后，小鼠以烏拉坦麻醉后，仰臥位固定。將靜脈留置針從膀胱頂插入，小荷包縫合，經三通閥連接膀胱測壓管和灌注管。排空動物膀胱尿液，膀胱測壓管與壓力傳感器相連，灌注管與微量注射泵相連，泵水速度為50 μL/min。充盈期膀胱內壓及漏尿點壓測定：體內置零后開啟微量注射泵向膀胱內灌注生理鹽水，記錄尿液自主溢出時的膀胱壓，即為膀胱漏尿點壓（bladder leak point pressures，BLPP），此時停止灌注，觀察壓力曲線，其峰值即為最大膀胱排尿壓（maximum voiding pressure，MVP）。計算灌注時間×灌注速度，即膀胱最大容量（maximum bladder capacity，MBC）；用注射器經灌注管抽出膀胱內殘余液體，其體積即為殘余尿量（post void residual，PVR）；計算順應性 BC （bladder compliance，BC=ΔV/ΔP，mL/mmH2O）、有效膀胱容量（Voiding Volume，Vv，Vv=MBCPVR）和排尿效率（efficiency of voiding，EV=Vv/ MBC×100%）。

1.4.3模型動物膀胱功能的變化進一步觀察α，β-me ATP、Carbachol、Capsaicin、KCl誘發(fā)的逼尿肌條舒縮反應的影響，具體方法如下。造模成功12周后，處死小鼠，全切膀胱，立刻把膀胱放入盛有37℃Krebs營養(yǎng)液的平皿中，并持續(xù)通入體積分數(shù)95%O2、5%CO2混合氣體，縱行切成8 mm×2 mm肌條，稱取肌條質量后將肌條固定于恒溫平滑肌槽內。上端連接張力傳感器，可通過裝置的微調螺旋調節(jié)肌條的牽拉程度。張力傳感器與八通道多功能生理信號放大器相連，放大器連接生理信號收集系統(tǒng)，檢測信號輸入計算機。肌條靜置于Krebs營養(yǎng)液中無張力適應30 min。待肌條穩(wěn)定后，給予肌條0.5 g前負荷張力，維持60 min。肌條維持0.5 g前負荷張力穩(wěn)定后，先后加入α，β-me ATP（100 μmol/L）、Carbachol（10-8～10-5mol/L）、辣椒素Capsaicin（10 μmol/L）、KCl（120 mmol/L），每種藥物加入浴槽中，觀察肌條收縮反應；然后沖洗3次，肌條平衡30 min后再進行下一藥物實驗。所測得的結果以每mg肌條所產生的張力［張力/肌條質量，w/（mg·mg-1）］表示。其中Carbachol各濃度加入后繪制累積濃度反應曲線（cumulative concentration-response curves，CRCs）。

1.4.4膀胱組織形態(tài)學觀察大鼠處死后取出膀胱組織，以40 g/L多聚甲醛固定，無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，常規(guī)蘇木素—伊紅（HE）和Masson染色，光鏡觀察。

1.5統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1模型組小鼠空腹血糖值和口服糖耐量的變化

表1結果顯示：與空白對照組比較，造模后及造模12周后，模型組的空腹血糖（FBG）值均顯著上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

如圖1所示，與空白對照組比較，造模12周后，模型組口服葡萄糖耐量（OGTT）曲線下面積、糖化血清蛋白（GSP）和胰島素（INS）水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1　模型建立前后小鼠空腹血糖值的變化Table 1　Comparison of FBG levels of mice in various groups before and after modeling?。邸纒，c/（mmol·L-1）］

表1　模型建立前后小鼠空腹血糖值的變化Table 1　Comparison of FBG levels of mice in various groups before and after modeling?。邸纒，c/（mmol·L-1）］

①P＜0.01，與空白對照組比較

組別空白對照組模型組N 8 8造模前5.33±0.07 5.29±0.02造模后5.57±0.17 11.55±0.72①造模12周后6.05±0.53 13.64±4.40①

圖1　各組口服糖耐量曲線下面積、糖化血清蛋白和胰島素的變化比較Figure 1　Comparison of glucose tolerance（area under curve），glycated serum protein and insulin in the blank control group and model group?。ā纒，N=8）

2.2各組膀胱功能及容量的變化表2結果顯示，模型組膀胱漏尿點壓（BLPP）、排尿期的最大排尿壓（MVP）和排尿率（EV）顯著下降（P＜0.01），膀胱最大容量（MBC）、殘余尿量（PVR）和膀胱順應性（BC）顯著上升，與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　糖尿病小鼠尿動力學的影響Table 2　Changes of urodynamics indexes in diabetic cystopathy mice?。ā纒）

表2　糖尿病小鼠尿動力學的影響Table 2　Changes of urodynamics indexes in diabetic cystopathy mice?。ā纒）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對照組比較

組別空白對照組模型組組別空白對照組模型組N 8 8 N 8 8 pBLPP/mmH2O 26.22±1.09 15.64±0.22②pBC 0.00±0.000 1 0.013 3±0.000 8①pM VP/mmH2O 26.26±1.08 15.70±0.22②vPVR/mL 0.04±0.00 0.13±0.01②vMBC/mL 0.10±0.00 0.21±0.01②pEV/% 0.57±0.02 0.38±0.02②

2.3各組膀胱逼尿肌條對α，β-me ATP、Capsaicin、KCl、Carbachol誘發(fā)收縮反應的影響表3結果顯示，各組離體肌條分別加入α，β-me ATP（100 μmol/L）、Capsaicin（10 μmol/L）、KCl （120 mmol/L）后，均產生收縮反應，模型組收縮幅度均顯著小于空白對照組（P＜0.01）。

表3　逼尿肌條對α，β-me ATP、Capsaicin、KCl收縮反應比較Table 3　Effects of α，β-me ATP，Capsaicin，and KCl on contraction reactions of isolated bladder detrusor?。邸纒，w/（mg·mg-1）］

表3　逼尿肌條對α，β-me ATP、Capsaicin、KCl收縮反應比較Table 3　Effects of α，β-me ATP，Capsaicin，and KCl on contraction reactions of isolated bladder detrusor　［±s，w/（mg·mg-1）］

①P＜0.01，與空白對照組比較

組別空白對照組模型組N 8 8α，β-meATP 88.05±4.24 19.42±1.53①Capsaicin 2.46±0.07 0.81±0.04①KCl 102.75±9.25 63.38±4.75①

表4結果顯示：各組肌條對Carbachol在3.0× 10-7～1.0×10-5mol/L刺激時，均產生收縮反應，在此濃度范圍內，模型組收縮值較空白對照組顯著下降（P＜0.01）。

2.4各組膀胱組織形態(tài)學結果如圖2、圖3所示，HE染色下，與空白對照組比較，模型組小鼠膀胱逼尿肌纖維排列雜亂，細胞間隙明顯增大；Masson染色下可見模型組小鼠膀胱組織中的膠原纖維（藍色部分）含量低于空白對照組，這些都屬于典型的糖尿病神經源膀胱病理改變。

圖2　各組膀胱組織形態(tài)學比較（HE染色，×100）Figure 2 Comparison of histomorphologic feature of bladder tissue in various groups（by HE staining，×100）

3　討論

傳統(tǒng)上，糖尿病膀胱的形成一度被認為僅僅是自主神經病變。當自主神經感受功能受損時，患者無法感受到膀胱充盈，缺乏排尿意愿，導致殘留尿量增加，逼尿肌收縮力減弱，甚至于尿失禁?？墒?，這種傳統(tǒng)觀念顯然無法解釋糖尿病膀胱（DCP）復雜的臨床表現(xiàn)，因為臨床上也可以見到25%～55%糖尿病患者有逼尿肌過度活動。近年來越來越多的研究者們發(fā)現(xiàn)情況遠比想像中復雜得多。DCP既有膀胱排空的問題，也有貯尿的問題［5-6］。而膀胱排尿和貯尿功能由復雜的神經網絡支配，存在自主神經、肌層傳入和傳出神經的交互作用與影響，由逼尿肌的收縮和舒張實現(xiàn)，并有膀胱上皮感應器的參與。Daneshgari等［7］提出一個“時間框架”假說（temporal theory），試圖從病理生理學角度統(tǒng)一認識。簡單地說，就是糖尿病膀胱形成受多因素影響，在自然病史上可以分為2個階段：早期階段，糖尿病的滲透性多尿占主導地位，導致膀胱代償性肥大，發(fā)生神經源性和肌源性病理改變，表現(xiàn)為高反應的膀胱，核心是貯尿問題；晚期階段，持續(xù)高血糖所產生的氧化應激產物不斷蓄積，損傷膀胱組織和功能，表現(xiàn)為無動力的、功能失代償?shù)陌螂?，核心是排尿問題。

表4　不同濃度Carbachol誘發(fā)逼尿肌條收縮反應的影響Table 4　Effects of different concentrations of Carbachol on contraction reactions of isolated bladder detrusor ［±s，w/（mg·mg-1）］

表4　不同濃度Carbachol誘發(fā)逼尿肌條收縮反應的影響Table 4　Effects of different concentrations of Carbachol on contraction reactions of isolated bladder detrusor ［±s，w/（mg·mg-1）］

①P＜0.01，與空白對照組比較

圖3　各組膀胱組織形態(tài)學比較（Masson染色，×100）Figure 3　Comparison of histomorphologic feature of bladder tissue in various groups （by Masson staining，×100）

通過尿動力學的改變，可以測知糖尿病膀胱所處的階段和狀態(tài)。本研究結果顯示：造模后12周的糖尿病小鼠膀胱漏尿點壓（BLPP）、排尿期的最大排尿壓（MVP）和排尿率（EV）顯著下降，相應的，膀胱最大容量（MBC）、殘余尿量（PVR）和膀胱順應性（BC）均顯著上升，這說明此時膀胱動力不足、出現(xiàn)排尿問題，相當于糖尿病膀胱功能障礙的失代償階段。這種特征可能與膀胱感覺與運動功能的漸進性喪失有關，導致形成脹大的膀胱和尿量殘留慢性化。多種糖尿病模型動物均發(fā)現(xiàn)類似的異常特征，如STZ誘導的糖尿病大鼠、糖尿病中國倉鼠，alloxan誘導糖尿病大鼠模型等［8］。

排尿過程由神經介導的逼尿肌收縮完成，其中主要遞質有乙酰膽堿和ATP，研究發(fā)現(xiàn)平滑肌M3受體和P2X1受體均參與逼尿肌收縮反應［9］。有文獻［10］報道，與正常的Wistar大鼠比較，2型糖尿病模型Goto-Kakizaki大鼠具有膀胱及下尿道的功能異常改變；雖然其離體膀胱平滑肌對Carbachol所致收縮的反應性下降，但對電場刺激（electric field stimulation，EFS）和高K+狀態(tài)的反應性不變。

本研究結果顯示：糖尿病C57BL/6小鼠的離體膀胱平滑肌對M3膽堿受體激動劑Carbachol和P2X1受體激動劑α，β-me ATP所致收縮的反應性均出現(xiàn)下降。結合病理形態(tài)學結果，糖尿病小鼠膀胱肌纖維減少，提示可能存在相應的M3受體和P2X1受體數(shù)量減少，從而導致平滑肌對激動劑收縮反應性下降。本研究還發(fā)現(xiàn)，糖尿病C57BL/6小鼠的離體膀胱平滑肌對非受體依賴的KCl收縮反應性亦出現(xiàn)下降。KCl可導致膜的去極化和增加鈣內流，后者可激活收縮蛋白。這說明糖尿病小鼠膀胱逼尿肌收縮功能下降可能是多因素導致的。

瞬時受體電位通道（transient receptor potential channels，TRP channels）是位于細胞膜上的一類重要的陽離子通道，其中TRPV1在維持膀胱正常排尿功能的機械感覺中有重要作用，TRPV1通道可被辣椒素Capsaicin激活，繼而通過中樞神經引起逼尿肌收縮［11］。本研究發(fā)現(xiàn)Capsaicin誘導的逼尿肌收縮反應亦出現(xiàn)下降。

綜上所述，本研究從多角度觀察糖尿病小鼠模型的膀胱尿動力學和病理學特征，可為篩選治療糖尿病膀胱功能障礙的中藥活性成分，研究其藥理作用機制奠定基礎。

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【責任編輯：黃玲】

Changes of Bladder Function and Urodynamics of Diabetic Cystopathy Model Mice

TAN Bo，LIAN Dawei，HUANG Yongxin，F(xiàn)AN Pinglong，CAO Hongying，HUANG Ping
（Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

ObjectiveTo investigate the changes of urodynamics indexes and bladder function of diabetic cystopathy mice，thus to provide evidence for studying the therapeutic mechanism for active ingredients of Chinese medicine.Methods C57BL/6 male mice were randomly divided into blank control group and model group.The mice in the blank control group were given common fodder，and the mice in the model control group were given purified high fat fodder，lasting for 4 continuous weeks.The mice in the model group received intraperitoneal injection of 200 mg/kg of streptozocin，and when fasting blood glucose value arrived to 10.5 mmol/L，the mouse model of diabetic cystopathy was proved being successfully established.After the modeled mice were fed for another 12 weeks，we determined the levels of oral glucose tolerance testing（OGTT），glycated serum protein（GSP），fasting blood glucose（FBG）and insulin（INS）.We performed the urodynamic test，and measured the detrusor strip function with Powerlab biological signal system.And the histomorphology of bladder was observed under light microscope after hemotoxylin and eosin staining and Masson staining. Results Compared with the blank control group，the levels of OGTT，GSP，F(xiàn)BG and INS in the model group were increased（P＜0.01）.Urodynamic test results showed that bladder leak point pressure（BLPP），maximum voiding pressure（MVP）and efficiency of voiding（EV）were decreased（P＜0.05 or P＜0.01），while maximum bladder capacity（MBC），bladder compliance（BC）and post-void residual urine volume（PVR）were increased in the model group（P＜0.05 or P＜0.01）.The results of isolated bladder detrusor strip test showed that the contractility and relaxation reaction of bladder detrusor strip stimulated by α，β-meATP，Carbachol，Capsaicin，and KCl were lowered（P＜0.05 or P＜0.01）.And HE staining results showed that bladder detrusor had disordered myofilament and widened gap under optical microscope，and Masson staining results showed that the amount of collagenous fibers was decreased.Conclusion Diabetic cystopathy mice have motorand sensory dysfunction， and have abnormal histomorphology， indicating that the bladder has developed into the decompensated stage.

diabetic cystopathy；urine dynamics；detrusor strip；bladder/pathology；disease models，animal；mice

R587.2

A

1007-3213（2016）04-0573-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.030

2016-03-01

談博（1974-），男，副教授；E-mail：tannyr@163.com

黃萍（1960-），女，教授；E-mail：hping331@126.com

國家自然科學基金資助項目（編號：81202982）；廣州中醫(yī)藥大學薪火計劃項目（編號：XH20140111）